ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN    NGUYỄN THỊ THƯƠNG HUYỀN NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Sinh lý học Người và Động vật Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 Công trình này được hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm Tế bào gốc, Trường Đại học khoa học Tự Nhiên TP. HCM. Người hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Nghĩa Sơn TS. Nguyễn Quốc Đạt Phản biện 1: PGS.TS. Bùi Hồng Thủy Phản biện 2: PGS.TS. Lê Xuân Cương Phản biện 3: TS. Lê Văn Ty Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Mai Văn Sánh Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Văn Hạnh Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… vào lúc giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - 1 - PHẦN MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization - IVF) từ nguồn tế bào trứng (TBT) động vật có vú nói chung và TBT nói riêng cho kết quả còn rất thấp hơn so với TBT tươi. Vì vậy, việc cải tiến quy trình đông lạnh và giải đông nhằm nâng cao hiệu quả IVF từ TBT bò đông lạnh là một yêu cầu cấp thiết hiện nay. Nghiên cứu IVF từ TBT bò đông lạnh ở Việt Nam mới chỉ có một số ít tác giả thực hiện gần đây, tỉ lệ thụ tinh khá thấp (11,67%, 3,72% phát triển lên phôi nang), tỉ lệ TBT sống sau đông lạnh mới đạt 14% và tỉ lệ tạo phôi dâu, phôi nang từ TBT đông lạnh chỉ đạt 2,5%. Những công trình nghiên cứu theo hướng này ở nước ta còn rất ít, cũng như tỉ lệ thành công còn thấp hơn nhiều so với các nghiên cứu trên thế giới. Để nâng cao tỉ lệ TBT sống sau đông lạnh, giải đông và góp phần nâng cao tỉ lệ tạo phôi trong ống nghiệm từ TBT đông lạnh, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu cải tiến quy trình đông lạnh tế bào trứng bò nhằm nâng cao hiệu quả tạo phôi trong ống nghiệm” 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Cải tiến được quy trình đông lạnh TBT bò bằng phương pháp thủy tinh hóa phù hợp với điều kiện Việt Nam, góp phần nâng cao hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm từ TBT bò đông lạnh. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1/. Nuôi chín TBT tươi trong ống nghiệm 2/. Đông lạnh, giải đông TBT chín (TBT MII) 3/. Thụ tinh trong ống nghiệm từ các TBT MII đông lạnh 4/. Thử nghiệm cấy truyền phôi tạo ra từ các TBT MII đông lạnh 5/. Đông lạnh, giải đông TBT giai đoạn túi mầm (TBT GV) 6/. Nuôi chín TBT GV sau khi được bảo quản lạnh 7/. Thụ tinh trong ống nghiệm từ các TBT GV đông lạnh được nuôi chín in vitro 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI  Nâng cao được tỉ lệ sống của TBT bò sau đông lạnh, giải đông góp phần nâng cao hiệu quả tạo phôi trong ống nghiệm từ TBT bò đông lạnh;  Góp phần trong việc thành lập ngân hàng tế bào sinh sản gia súc, từ đó làm cơ sở để nghiên cứu đông lạnh TBT của các động vật khác và các nghiên cứu cơ bản như chuyển nhân, chuyển gen, cloning, tạo phôi trong ống nghiệm;  Các kết quả của luận án là tài liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu, nhà giáo giảng dạy và học sinh, sinh viên trong lĩnh vực công nghệ sinh học sinh sản gia súc. 5. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI 1. Nghiên cứu thành công bảo quản lạnh TBT bò giai đoạn chín (MII) dùng cọng rạ, TBT bò giai đoạn túi mầm (GV) dùng cọng rạ và vi giọt theo phương pháp thủy tinh hóa; 2. Nâng cao tỉ lệ sống của TBT MII sau khi đông lạnh, giải đông bằng phương pháp thủy tinh hóa cải tiến; - 2 - 3. Nuôi chín TBT bò trong ống nghiệm từ nguồn TBT GV đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa; 4. Tạo được phôi bò trong ống nghiệm từ các TBT MII và GV đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ 1.1.1. Những nghiên cứu trên thế giới 1.1.1.1. Đông lạnh tế bào trứng chín (MII) Năm 1998, Vajta và cs. đã nghiên cứu đông lạnh TBT bò MII bằng phương pháp thủy tinh hóa hai bước, tỉ lệ thụ tinh đạt 50%, tỉ lệ phôi nang đạt 13%. Năm 2008, Morato và cs. bảo quản lạnh TBT bò MII, sử dụng cọng rạ kéo mở và cryotop làm vật mang, tỉ lệ TBT sống sau giải đông tương ứng là 88,4% và 94,5% (P < 0,05); tỉ lệ thụ tinh lần lượt là 31,5% và 41,6% (P < 0,05); tỉ lệ phôi nang lần lượt là 0,0% và 2,4%. Cũng trong năm này, nhóm tiến hành nghiên cứu bảo quản lạnh TBT MII bằng phương pháp thủy tinh hóa, bổ sung 1µM Taxol vào dung dịch cân bằng và dung dịch thủy tinh hóa, tỉ lệ TBT có thoi vô sắc bình thường theo phương pháp nhuộm DAPI sau đông lạnh giải đông đạt 50,00% (TBT bò) và 57,7% (TBT bê), P < 0,05. Tỉ lệ thụ tinh được cải thiện đáng kể khi xử lí với Taxol trước khi thủy tinh hóa: 33,7% so với 23,5% (TBT bê); 41,9% so với 34,00% (TBT bò). Chỉ riêng nhóm được xử lí trước với Taxol có phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang (3,2%), còn nhóm không xử lí với Taxol chưa ghi nhận được phôi nào đạt đến giai đoạn phôi nang. Một công bố khác của nhóm này về đông lạnh TBT MII khi được xử lí trước với Taxol cho thấy Taxol đã có vai trò tích cực trong việc cải thiện tỉ lệ bình thường của thoi vô sắc, tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ phát triển phôi nang đối với TBT bò MII khi được thủy tinh hóa: 45,8% so với 29,9%; 42,8% so với 16,2% và 2,3% so với 0,00% (P < 0,05) [104]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu do Zhou và cs. tiến hành bảo quản lạnh TBT bò MII, tỉ lệ sống sau đông lạnh giải đông đạt 93,00% (chưa loại bỏ cumulus) so với 91,8% (đã loại bỏ một phần cumulus); tỉ lệ thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi nang ở nhóm để nguyên cumulus so với nhóm được loại bỏ một phần cumulus lần lượt là 35,2% so với 36,8%; 5,00% so với 4,4%. Cũng trong năm này, Prentice (Canada) thu được tỉ lệ thụ tinh và phát triển phôi nang khi tiến hành IVF từ nguồn TBT bò MII được thủy tinh hóa lần lượt là 42% và 0,4% so với lô đối chứng là 93% và 31% [117]. 1.1.1.2. Đông lạnh tế bào trứng túi mầm (GV) Năm 2006, Cetin Yunus và Ayhan Bastan bảo quản TBT bò GV bằng phương pháp đông lạnh cực nhanh với các chất bảo vệ khác nhau, tỉ lệ chín trên 20,7% so với nhóm đối chứng là 79,6% [39]. Gupta và cs. thử nghiệm quy trình thủy tinh hóa bằng cách sử dụng kết hợp EG và DMSO đối với TBT heo GV, chỉ 3,4% phát triển đến phôi nang so với lô TBT tươi là 20,1% [62]. Yamada và cs. bảo quản lạnh TBT bò - 3 - GV bằng phương pháp thủy tinh hóa, tỉ lệ chín khi nuôi các TBT GV sau khi đông lạnh và giải đông đạt 11,7% (lô 1) và 29,2% (lô 2). Năm 2007, Dong-Hoon Kim và cs. bảo quản lạnh TBT bò GV bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt, tỉ lệ sống sau giải đông là 84% và tỉ lệ chín đạt 44,4% [77]. Cũng trong măm này, Yamada và cs. thu được tỉ lệ chín sau khi IVM TBT GV đông lạnh đạt 29,2% [149]. Năm 2008, Vieira và cs. bảo quản lạnh TBT bò giai đoạn GV bằng phương pháp thủy tinh hóa qua 2 bước, tỉ lệ chín sau khi IVM từ nguồn TBT GV đông lạnh đạt 60,2%; tỉ lệ thụ tinh và phôi đạt 47,5% và 5,86%. Năm 2010, Zhou và cs. thực hiện bảo quản lạnh TBT bò GV, tỉ lệ sống sau đông lạnh giải đông đạt 93,8% (chưa loại bỏ cumulus) và 81,3% (đã loại bỏ một phần cumulus); tỉ lệ thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi nang ở nhóm để nguyên cumulus so với nhóm được loại bỏ một phần cumulus lần lượt là 65,8% so với 47,3%; 11,3% so với 4,00% [155]. Cũng trong năm này, Prentice thu được tỉ lệ chín khi nuôi chín TBT GV sau khi bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa đạt 24% (cryotop) và 9% (cọng rạ) [117]. Năm 2011, Hajarian và cs. thu được tỉ lệ chín khi nuôi TBT GV sau khi bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa 2 bước đạt 36,2% (cryotop) và 29,5% (cọng rạ) [63]. Nhìn chung các nghiên cứu về đông lạnh TBT bò đang được các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm. Họ vẫn đang tiếp tục nghiên cứu để nâng cao tỉ lệ IVF từ nguồn TBT này. 1.1.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam Việc nghiên cứu bảo quản lạnh đối với TBT gia súc nói chung và TBT bò nói riêng, kết quả thu được còn rất khiêm tốn, chỉ mang tính khởi đầu. Năm 2008, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM đã bảo quản thành công TBT bò bằng phương pháp đông lạnh cực nhanh trong cọng rạ với tỉ lệ sống so với tổng số TBT đem đông lạnh sau giải đông 58,83%. Tháng 5/2009, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM bảo quản TBT bò GV bằng phương pháp đông lạnh cực nhanh với tỉ lệ sống sau giải đông theo quan sát hình thái là 53,7% (trong vi giọt) và 47,16% (trong cọng rạ), tỉ lệ thụ tinh là 11,67%, 3,72% phát triển lên phôi nang. Năm 2010, Viện chăn nuôi quốc gia Hà Nội đã tiến hành giải đông TBT bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt, tỉ lệ sống sau giải đông là 14%, đã tạo được phôi từ TBT bò sau đông lạnh giải đông, tỉ lệ phôi nang từ TBT đông lạnh đạt 2,5%. Hiện nay các nhà khoa học vẫn đang tiếp tục nghiên cứu về việc bảo quản TBT ở động vật có vú, nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (TBT) để phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn: IVF, ICSI, cloning, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc phôi… - 4 - 1.2. CƠ SỞ KHOA HỌC ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ 1.2.1. Những biến đổi trong quá trình đông lạnh Sự hình thành tinh thể đá Sự hình thành tinh thể nước đá trong và ngoài tế bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sức sống của tế bào sau đông lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nước đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể nước đá hình thành có dạng sáu cạnh. Khi tốc độ làm lạnh được đẩy lên thì hình dạng của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu [12, 102, 111]. Khi tốc độ làm lạnh đạt đến 20000 o C/giây, nước nguyên chất tạo băng vô định hình mà không có dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đông sẽ xảy ra quá trình tái tạo tinh thể nước đá từ nhỏ đến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải đông sẽ gây bất lợi cho tế bào [12, 102, 111]. Sự khử nước Một khi tế bào không được khử nước thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu nhiệt độ xuống dưới 0 o C. Tốc độ khử nước của tế bào phụ thuộc vào tính thấm nước của màng, năng lượng hoạt hóa của tính thấm và tỉ lệ diện tích bề mặt/thể tích tế bào (S/V). Những yếu tố này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đóng vai trò quyết định trong việc xác định quá trình đông lạnh thích hợp nhất [12, 117]. 1.2.2.Những tổn thương trong quá trình đông lạnh Các TBT sau khi giải đông thường bị đứt gãy màng trong suốt và màng tế bào trứng. Khi TBT được làm lạnh từ 37 o C xuống 20 o C hoặc dưới 20 o C thường dẫn đến có nhiều biến đổi về cấu trúc tế bào và nhiễm sắc thể, nhưng trong một số trường hợp, tế bào có khả năng tự sửa chữa toàn bộ hoặc một phần [94, 138]. Những tác dụng ngược chủ yếu trong suốt quá trình bảo quản lạnh là do sự hình thành tinh thể nước đá, tổn thương thẩm thấu, các hiệu ứng độc của các chất bảo vệ lạnh, các chất điện giải bên trong tế bào cô đặc, tổn thương lạnh, đứt gãy màng và những biến đổi của các bào quan bên trong tế bào, sự tiếp xúc giữa tế bào với tế bào [93, 136]. 1.2.3. Các phương pháp đông lạnh tế bào trứng Có hai phương pháp đông lạnh hiện nay được sử dụng là: đông lạnh và đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa, vitrification). Sự lựa chọn phương pháp đông lạnh phụ thuộc vào một số yêu cầu như: (1) tính hiệu quả, (2) tính an toàn, (3) tính tiện lợi [7, 24]. 1.2.4. Các chất bảo vệ lạnh Chất bảo vệ ngoại bào: không có khả năng thấm qua màng tế bào (non- permeable CPA). Chúng kết hợp vào dung dịch thủy tinh hóa giúp loại nước ra khỏi tế bào nhanh hơn và giảm bớt thời gian tế bào tiếp xúc với những chất bảo vệ gây độc. Chất bảo vệ n ội bào: phân tử lượng thấp, có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào (permeable CPA), có khả năng hòa tan do hình thành những liên kết hydro với các phân tử nước và có độc tính thấp đối với tế bào. Ethylene glycol (EG) là chất bảo vệ phổ biến nhất và đã được sử dụng trong quy trình thủy tinh hóa. Chất này ít ảnh hưởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua màng, độc tính của nó sẽ xuất hiện - 5 - vào khoảng 38 o C. Dimethyl sulfoxide (DMSO) có khả năng hòa tan nhiều loại chất hữu cơ khác nhau: carbohydrate, polymer, peptid, các muối vô cơ và khí. DMSO được sử dụng khá rộng rãi để bảo vệ các bào quan, mô và tế bào. Một số chất bảo vệ lạnh khác: Các đại phân tử (polyvinylpirrolidone, Polyethylene glycol, hydroxyethyl starch (HES), Ficoll, Bovine Serum Albumin (BSA), Fetal Bovine Serum (FBS)); Taxol ổn định các vi ống nhờ các liên kết bền vững giữa các dimer α-tubulin và ß-tubulin. Với liều lượng thấp hơn, Taxol ổn định sự vận động của các vi ống ở thoi vô sắc. 1.2.5. Những khó khăn khi bảo quản lạnh tế bào trứng so với các tế bào khác TBT dễ bị tổn thương do thay đổi môi trường hơn so với phôi trước khi cấy - chứa nhiều tế bào [86]. TBT là một tế bào đặc biệt, có màng trong suốt bao quanh, nên tính thấm nước và chất bảo vệ lạnh của nó giảm. Tỉ lệ diện tích bề mặt trên thể tích của TBT thấp hơn so với các loại tế bào khác, gây khó khăn cho sự vận chuyển nước và chất bảo vệ qua màng nguyên sinh chất, tăng nguy cơ hình thành tinh thể đá ngoại bào trong quá trình đông lạnh. TBT phải duy trì tính nguyên vẹn của vài cấu trúc đặc thù của nó cần cho sự thụ tinh và phát triển sau đó [70, 117]. CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU TBT bò thu nhận từ buồng trứng bò cái tại lò giết mổ gia súc thuộc công ty Kỹ nghệ Vissan và cơ sở giết mổ gia súc Thành Vinh. Tinh trùng sử dụng trong thí nghiệm là tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ, giống Holstein Friesian (Mỹ) và giống Clovis (Pháp). Các thí nghiệm IVM, đông lạnh TBT, IVF được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Tế bào gốc, Trường Đại học khoa học Tự Nhiên TP. HCM. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp thu buồng trứng và tế bào trứng Buồng trứng được thu nhận theo phương pháp của Gordon (2003) [60], Cetin (2006) [39], Kim (2007) [77]. TBT được thu nhận bằng phương pháp chọc hút; TBT được phân loại theo phương pháp của các tác giả Mario Mayes (2002) [98] và De Loos và cs. (1989) [47], gồm 3 loại A, B, C. Dùng các TBT loại A và B cho các thì nghiệm. 2.2.2. Phương pháp nuôi chín tế bào trứng Môi trường nuôi chín TBT trong ống nghiệm được pha theo công thức của Rizos và cs. (2002) và Checura và cs. (2007), có biến đổi. Nuôi chín tế bào trứng tươi (chưa qua đông lạnh) trong 3 môi trường khảo sát IVM1, IVM2, IVM3. Nuôi chín tế bào trứng đông lạnh trong 2 môi trường N1 và N2. Sau 22 - 24h nuôi cấy, đánh giá sự chín của TBT dưới kính hiển vi đảo ngược theo độ giãn nở và màu sắc của các lớp tế bào cumulus, sự đồng đều của tế bào chất. 2.2.3. Phương pháp đông lạnh tế bào trứng Môi trường đông lạnh TBT được pha dựa theo phương pháp của Cetin (2006), Kim (2007) và Morato (2008), có sự biến đổi. Đối với TBT MII, đông lạnh theo 3 quy trình: quy trình 1 (cơ bản); quy trình 2 (cải tiến 1); quy trình 3 (cải tiến 2), dùng cọng rạ làm vật mang. Đối với TBT GV, quy trình đông lạnh với môi trường cân bằng NV2 và môi trường thủy tinh hóa; dùng vật mang là cọng rạ hoặc vi giọt. - 6 - 2.2.4. Phương pháp giải đông Môi trường giải đông TBT được pha dựa theo phương pháp của Cetin (2006), Kim (2007) và Morato (2008a), có sự biến đổi. Đối với các TBT MII đông lạnh theo quy trình 1, giải đông qua 3 bước: với môi trường rã đông 1 (TCM–199 + 10% FBS + 0,25M Sucrose), môi trường rã đông 2 (TCM–199 + 10% FBS + 0,15M Sucrose) và môi trường rã đông 3 (TCM–199 + 10% FBS). Đối với các TBT MII đông lạnh theo quy trình 2, quy trình 3 và các TBT GV đông lạnh, quy trình giải đông qua 3 bước: với môi trường rã đông 1 (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS + 0,25M Sucrose), môi trường rã đông 2 (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS + 0,15M Sucrose) và môi trường rã đông 3 (TCM–199 + 10% FBS + 5% FCS). Các TBT sau khi được rã đông sẽ được đánh giá theo quan sát hình thái dựa trên 3 chỉ tiêu: tỉ lệ thu hồi; tỉ lệ TBT sống trên tổng số TBT đem đông lạnh; tỉ lệ TBT sống trên tổng số TBT thu hồi. Riêng TN2 và TN3 của TBT MII đông lạnh, ngoài 3 chỉ tiêu trên còn khảo sát thêm chỉ tiêu 4 - tỉ lệ TBT có nhiễm sắc thể không bị tổn thương trên các TBT được đánh giá sống theo hình thái theo nhuộm PI; TBT GV đông lạnh khảo sát thêm chỉ tiêu đánh giá theo phương pháp nhuộm AO/PI. 2.2.5. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm Thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện theo phương pháp của các nhà khoa học Nhật Bản (Japan Livestock Technology Association [74], có cải biến. Dùng môi trường BO để hoạt hóa và pha loãng tinh trùng (dùng tinh đông lạnh), điều chỉnh mật độ đạt 5-6x10 6 tinh trùng/ml (Otoi, 1998). Dịch huyền phù này dùng để tạo vi giọt thụ tinh trong đĩa 4 giếng (100 µl/giọt), phủ dầu khoáng một phần vi giọt thụ tinh, giữ trong tủ ấm 38,5 o C, 5% CO 2 . Chuyển 15-20 TBT thí nghiệm vào vi giọt thụ tinh, đặt vào tủ nuôi ở 38,5 o C; 5% CO 2 trong 5-6 giờ. Sau đó, quan sát đánh giá kết quả thụ tinh. 2.2.6. Phương pháp nuôi phôi Dùng môi trường CR1aa bổ sung 5% FBS (100 µl/giọt) nuôi phôi, quan sát và đánh giá sự phát triển của phôi tại các mốc thời gian: 3-4 ngày nuôi cấy (phôi 8-16 tế bào); 5-6 ngày nuôi cấy (phôi dâu); 7-8 ngày nuôi cấy (phôi nang). 2.2.7. Phương pháp đông lạnh phôi Phôi được đông lạnh chậm theo quy trình của Hasler (2002), có cải biến bằng máy đông lạnh tự động (Cryochamber, CC5S, Úc). Chỉ đông lạnh những phôi được tạo ra từ nguồn TBT MII bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa. 2.2.8. Phương pháp cấy truyền phôi Phôi được cung cấp trong các cọng rạ (0,25ml), và chuyển giao cho cán bộ của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM, tổ chức thử nghiệm cấy truyền. 2.2.9. Phương pháp xử lí số liệu Tất cả số liệu của luận án được xử lý theo các thuật toán xác suất thống kê trên máy vi tính bằng phần mềm Minitab 16, R và Analysis Toolpak trong MS-Excel 2010. Xác định giá trị trung bình và sai số trung bình của các kết quả thu được ở mức ý nghĩa α < 0,05. Dùng hàm Chi – square test để kiểm định các tỉ lệ giữa các nghiệm thức. - 7 - CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NUÔI CHÍN TẾ BÀO TRỨNG TƯƠI TRONG ỐNG NGHIỆM Bảng 3.1. Kết quả nuôi chín TBT trong ống nghiệm Các loại môi trường nuôi Số đợt TN Tổng số TBT đem nuôi Tỉ lệ (%) TBT chín IVM 1 10 2557 82,42 ± 0,73 a (2085) IVM 2 10 980 82,24 ± 1,22 a (806) IVM 3 6 2756 83,09 ± 0,71 a (2290) a: không có sự khác biệt theo chiều dọc ở độ tin cậy 95% Tỉ lệ chín của TBT ở các môi trường IVM1 đạt 82,42 ± 0,73% (2085/2557); IVM2 đạt 82,24 ± 1,22% (806/980); IVM3 đạt 83,09 ± 0,71% (2290/2756). Nhìn chung tỉ lệ chín đạt từ 82-83% và tương đối ổn định ở những lần thí nghiệm của cả 3 môi trường khảo sát. Tỉ lệ chín của TBT khi nuôi ở 3 môi trường là tương đương nhau và chưa thấy ảnh hưởng của FCS và hCG lên kết quả nuôi chín TBT tươi (P > 0,05). Có 154/190 TBT ở môi trường IVM1 có thể cực, đạt tỉ lệ 81,05 ± 2,84%. Tỉ lệ chín theo thể cực không có sự khác biệt so với tỉ lệ chín theo độ giãn nở cumulus (P > 0,05). Như vậy, kết quả của chúng tôi đánh giá tỉ lệ chín của TBT bò theo độ giãn nở cumulus và theo sự xuất hiện thể cực thứ nhất là tương đương, và tỉ lệ chín như vậy tương đối cao (> 80%). Kết quả này đã khẳng định sự thành công trong việc nuôi trưởng thành TBT bò trong ống nghiệm. 3.2. K ẾT QUẢ ĐÔNG LẠNH, GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG MII (ND2) Bảng 3.2. Kết quả đông lạnh TBT MII Quy trình Số đợt TN Tổng số TBT đông lạnh Tỉ lệ (%) các chỉ tiêu sau đông lạnh CT1 CT2 CT3 1 10 1404 81,84 ± 1,03 (1149 TBT) 62,89 ± 1,29 ab (883 TBT) 76,85 ± 1,24 a 2 16 1350 87,85 ± 0,89 (1186 TBT) 59,63 ± 1,34 b (805 TBT) 67,88 ± 1,36 b 3 16 1285 88,33 ± 0,90 (1135 TBT) 64,51 ± 1,33 ac (829 TBT) 73,04 ± 1,32 c a, b, c: khác nhau theo cột, có ý nghĩa về mặt thống kê CT1-Tỉ lệ thu hồi TBT sau khi giải đông; CT2 – Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên tổng số TBT đem đông lạnh; CT3- Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên tổng số TBT thu hồi Kết quả thu hồi TBT sau khi giải đông nhìn chung đạt trên 80% (P < 0,001). - 8 - Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên tổng số TBT đem đông lạnh trung bình ở quy trình 1 đạt 62,89 ± 1,29%; ở quy trình 2 đạt 59,63 ± 1,34% và ở quy trình 3 đạt 64,51 ± 1,33 (P < 0,05). Kết quả này không khác nhau giữa quy trình 1 và quy trình 2, quy trình 1 và quy trình 3 (P > 0,05); nhưng ở quy trình 3 có tỉ lệ TBT sống trên tổng số TBT đem đông lạnh cao hơn quy trình 2 là 4,88% (P < 0,01). Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên tổng số TBT thu hồi được ở quy trình 1 đạt 76,85 ± 1,24%; ở quy trình 2 đạt 67,88 ± 1,36% và ở quy trình 3 đạt 73,04 ± 1,32% (P < 0,01). Kết quả so sánh riêng từng cặp về chỉ tiêu này (CT3) ở cả 3 cặp đều có sự khác biệt: ở quy trình 1 và quy trình 2 (P < 0,001); ở quy trình 1 và quy trình 3 (P < 0,05); ở quy trình 2 và quy trình 3 (P < 0,01). Qua phân tích trên cho thấy, tỉ lệ sống của TBT MII sau khi bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa ở quy trình 3 cao nhất, kế đến là quy trình 1 và cuối cùng là quy trình 2. Đây chỉ là kết quả đánh giá tỉ lệ sống của TBT sau giải đông theo quan sát hình thái. Kết quả theo đánh giá nhuộm PI được thể hiện trong Bảng 3.3. Bảng 3.3. Chất lượng TBT MII sau đông lạnh theo phương pháp nhuộm PI Lô TN Số lần TN Số TBT đem nhuộm Số TBT sống theo nhuộm Tỉ lệ (%) TBT sống theo nhuộm PI (CT4) QT2(1) 10 245 187 76,33 ± 2,72 a QT3(1) 10 209 166 79,43 ± 2,80 a a: các giá trị không khác nhau theo cột ở độ tin cậy 95% Chất lượng TBT MII sau đông lạnh được đánh giá theo phương pháp nhuộm PI đạt 76,33 ± 2,72% ở QT2(1) và 79,43 ± 2,80% ở QT3(1). Tỉ lệ này không khác biệt ở độ tin cậy 95% (P > 0,05). Như vậy, tỉ lệ sống theo hình thái và theo quan sát sự tổn thương NST ở thí nghiệm có bổ sung Taxol và thí nghiệm không được bổ sung Taxol chưa khác biệt nhau. Các kết quả đạt được đã chứng minh rằng các TBT bò khi được nuôi chín trong ống nghiệm có thể được bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa dùng cọng rạ làm vật mang và hỗn hợp chất bảo quản là DMSO và EG. Vì đây là một trong số ít nghiên cứu đầu tiên về đông lạnh TBT bò giai đoạn MII bằng phương pháp thủy tinh hóa ở nước ta, nên kết quả đạt được là một điều khích lệ. Tuy nhiên kết quả đạt được vẫn còn thấp hơn so với các nghiên cứu được công bố trên thế giới. [...]...3.3 KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ CÁC TẾ BÀO TRỨNG MII ĐÔNG LẠNH 3.3.1 Thụ tinh trong ống nghiệm từ tế bào trứng MII đông lạnh theo quy trình 1 Bảng 3.4 Kết quả IVF từ TBT MII đông lạnh theo quy trình 1 Số Tỉ lệ các giai đoạn phát triển của phôi (%) TBT Lô đem Phôi 8-16 Phôi 2 TB Phôi dâu Phôi nang thụ TB tinh 11,01 ± 12,93 ± 1,2a 5,76 ± 0,83a... tinh hóa trong cọng rạ và trong vi giọt Các TBT sau khi bảo quản lạnh có thể sống sót, nuôi chín in vitro và tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm, phát triển đến phôi nang Đây là kết quả đầu tiên trong nước cho tới thời điểm này Tuy nhiên cần có nhiều nghiên cứu được tiếp tục tiến hành nhằm nâng cao tỉ lệ thụ tinh và phát triển của phôi 3.8 SO SÁNH HIỆU QUẢ ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG Ở HAI GIAI ĐOẠN Nghiệm. .. TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ TẾ BÀO TRỨNG ĐÔNG LẠNH Ở HAI GIAI ĐOẠN Nghiệm thức 1: IVF từ nguồn TBT MII đông lạnh chưa xử lí Taxol Nghiệm thức 2: IVF từ nguồn TBT MII đông lạnh có xử lí Taxol Nghiệm thức 3: IVF từ nguồn TBT non đông lạnh dùng vật mang là cọng rạ Bảng 3.20 So sánh hiệu quả IVF từ TBT đông lạnh Số TBT Tỉ lệ các giai đoạn phát triển của phôi (%) Nghiệm đem thức Phôi 2 TB Phôi 4-8 TB Phôi dâu Phôi. .. quản bằng phương pháp thủy tinh hóa đã được cải tiến về tỉ lệ thụ tinh Xét sự chuyển tiếp của phôi từ giai đoạn phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu và từ phôi dâu lên phôi nang ở từng lô, kết quả thể hiện ở Bảng 3.7 Bảng 3.7 So sánh sự chuyển tiếp của phôi ở các giai đoạn liền kề Tỉ lệ chuyển tiếp của phôi (%) Chỉ số P Phôi 2 tế bào Phôi 8-16 tế Phôi dâu Lô theo hàng lên phôi 8-16 bào lên phôi lên phôi tế. .. 0,001); trong khi sự chuyển tiếp từ giai đoạn phôi dâu lên phôi nang sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) Kết quả này cho thấy, các TBT MII sau khi trải qua bảo quản lạnh và giải đông đem IVF bị -9- “block” ở giai đoạn 8-16 tế bào chuyển lên phôi dâu nhiều hơn so với các TBT MII chưa trải qua bảo quản lạnh 3.3.2 Thụ tinh trong ống nghiệm từ TBT MII đông lạnh theo quy trình 2 và quy trình. .. sở kết quả đạt được của đề tài, cần tiếp tục nghiên cứu đông lạnh tế bào sinh sản trên đối tượng các động vật khác, đặc biệt là những động vật quý hiếm có nguy cơ bị tiệt chủng, góp phần bảo tồn đa dạng nguồn gen vật nuôi 2 Tiến hành thêm các thí nghiệm cấy truyền phôi nhằm chứng minh chất lượng phôi được tạo ra từ TBT đông lạnh 3 Đưa kết quả các phương pháp cải tiến đông lạnh TBT bò vào chương trình. .. thống kê (P > 0,05) Hiện nay, trong nước chưa có công trình nghiên cứu nào về bảo quản lạnh TBT bò sử dụng phương pháp đánh giá này Vì vậy, kết quả đánh giá chỉ mang tính khởi đầu Tóm lại, tỉ lệ thu hồi và tỉ lệ sống của TBT sau giải đông ở giai đoạn GV trong thí nghiệm này nằm trong khoảng tương đối cao - 13 - 3.6 KẾT QUẢ NUÔI CHÍN TBT GV SAU KHI BẢO QUẢN LẠNH 3.6.1 Kết quả nuôi chín TBT GV đông lạnh. .. TẾ BÀO TRỨNG Ở HAI GIAI ĐOẠN Nghiệm thức 1: đông lạnh TBT MII chưa xử lí trước với Taxol (quy trình 1) Nghiệm thức 2: đông lạnh TBT MII xử lí trước với Taxol (quy trình 3) Nghiệm thức 3: đông lạnh TBT GV dùng cọng rạ làm vật mang - 16 - Bảng 3.20 So sánh hiệu quả đông lạnh TBT ở cả hai giai đoạn Tỉ lệ TBT Tỉ lệ TBT Nghiệm Số TBT Tỉ lệ TBT thu sống/tổng số sống/tổng số thức đem ĐL hồi (%) – TC1 TBT ĐL... hồi ở 3 nghiệm thức khác biệt nhau, cụ thể: tỉ lệ thu hồi khi đông lạnh TBT GV cao nhất, đạt 95,54%; kế đến là khi đông lạnh TBT MII được xử lí trước với Taxol (88,33%) và sau cùng là khi đông lạnh TBT MII theo quy trình cơ bản, sự khác biệt này rất có ý nghĩa thống kê (P < 0,001) Tỉ lệ sống sau đông lạnh, giải đông trên tổng số TBT đem đông lạnh không khác biệt theo từng cặp (nghiệm thức 1-2; nghiệm. .. Tyrode trong 20 giây Đây là một khảo sát thăm dò nồng độ và thời gian tiếp xúc với dung dịch này nhằm giúp màng trong suốt bớt tính cứng sau khi bảo quản lạnh Từ đó giúp tăng tỉ lệ thụ tinh và phát triển về sau của phôi Kết quả cho thấy tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi nang đã cải thiện rõ rệt 3.3.3 So sánh hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm từ TBT MII đông lạnh Bảng 3.8 Kết quả IVF từ TBT MII đông lạnh . tài: Nghiên cứu cải tiến quy trình đông lạnh tế bào trứng bò nhằm nâng cao hiệu quả tạo phôi trong ống nghiệm” 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Cải tiến được quy trình đông lạnh TBT bò bằng phương pháp. 1.1. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ 1.1.1. Những nghiên cứu trên thế giới 1.1.1.1. Đông lạnh tế bào trứng chín (MII) Năm 1998, Vajta và cs. đã nghiên cứu đông lạnh TBT bò MII bằng. Đối với TBT MII, đông lạnh theo 3 quy trình: quy trình 1 (cơ bản); quy trình 2 (cải tiến 1); quy trình 3 (cải tiến 2), dùng cọng rạ làm vật mang. Đối với TBT GV, quy trình đông lạnh với môi trường