ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MẠNH CƯỜNG THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ORGANOPHOSPHORUS HYDROLASE (OPHC2) PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2012 1Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN MẠNH CƯỜNG THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ORGANOPHOSPHORUS HYDROLASE (OPHC2) PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. LÊ VĂN SƠN THÁI NGUYÊN - 2012 2Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh mục các chữ cái viết tắt iii Danh mục các bảng trong luận văn v Danh mục các hình trong luận văn vi MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. VẤN ĐỀ Ô NHIỄM MÔI TRƢỜNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 4 1.1.1. Ô nhiễm không khí 4 1.1.2. Ô nhiễm nƣớc 4 1.1.3. Ô nhiễm đất 5 1.1.3.1. Tình hình ô nhiễm đất ở Việt Nam và thế giới 5 1.1.3.2. Ô nhiễm đất do sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật 7 1.1.3.3. Các phƣơng pháp xử lý ô nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật 10 1.1.4. Xử lý ô nhiễm môi trƣờng bằng thực vật 14 1.2. XỬ LÝ Ô NHIỄM MÔI TRƢỜNG BẰNG CÂY CHUYỂN GEN 17 1.2.1. Tác động của cây chuyển gen tới môi trƣờng 17 1.2.2. Nghiên cứu về cây chuyển gen xử lý ô nhiễm môi trƣờng 18 1.2.3. Nghiên cứu tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc bảo vệ thực vật 20 1.3. KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 20 21 1.3.2. Chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium 21 1.3.3. Giới thiệu về vector pBI121 22 1.3.4. Gen OPHC2 25 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 26 2.1.1. Vật liệu 26 2.1.2. Hóa chất, thiết bị 27 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 Hình 2.2 Minh họa tóm tắt quá trình thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen pBI121/OPHC2opt và quá trình chuyển gen OPHC2opt vào cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens. 29 2.2.1. Thiết kế cấu trúc OPHC2opt 29 2.2.2. Thiết kế vector chuyển gen OPHC2opt 34 2.2.3. Chuyển cấu trúc mang gen OPHC2opt vào cây thuốc lá 37 2.2.4. Phƣơng pháp đánh giá các dòng thuốc lá chuyển gen 38 2.2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 39 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. THIẾT KẾ CẤU TRÚC MANG GEN OPHC2opt 40 3.1.1. Đổi mã gen OPHC2 tối ƣu biểu hiện trong thực vật (OPHC2opt) 40 3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen OPHC2opt 43 3.1.3. Kết quả tổng hợp mồi và gen OPHC2opt 43 3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN OPHC2opt 45 3.2.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pBI121 mang gen OPHC2opt 45 3.2.2. Kết quả tạo dòng A. tumefaciens 51 3.3. KẾT QUẢ TẠO CÂY THUỐC LÁ MANG GEN OPHC2opt 52 3.3.1. Kết quả chuyển gen OPHC2opt vào mảnh lá 52 3.3.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá mang gen 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 1. Kết luận 57 2. Kiến nghị 57 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 64 4Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT aa amino acid - axit amin BAP 6- benzyl amino purine Bp Base pair Bt Bacillus thuringiensis BVTV Bảo vệ thực vật cs Cộng sự DDT Dichloro-diphenyl-trichloroethane DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid E. coli Escherichia coli GM Germination medium - Môi trƣờng nảy mầm của hạt GMO Genetically modified organism - Sinh vật biến đổi gen GMP Genetically modified plant - Thực vật biến đổi gen gus - Glucuronidase gene ( Gen mã hóa enzyme - Glucuronidase) IBA Indole 3 - butyric acid IPTG Isopopyl -D-1 thiogalactopyranoside Kb Kilo base LB Luria Bertani MS Môi trƣờng nuôi cấy mô cơ bản theo Murashige và Skoog MSI Dung dịch I (muối đa lƣợng) dùng để pha môi trƣờng MS MSII Dung dịch II (muối đa lƣợng) dùng để pha môi trƣờng MS MSIII Dung dịch III (|sắt) dùng để pha môi trƣờng MS MSIV Dung dịch IV (muối vi lƣợng) dùng để pha môi trƣờng MS MSV Dung dịch V (vitamin) dùng để pha môi trƣờng MS 5Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv OD Optical density OP Organophosphorus OPH Organophosphorus hydrolase Opt optimization-Tối ƣu hóa PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase PM10 Particulate matter 10 - Những hạt bụi có kích thƣớc bé hơn 10 micromet RM Rooting medium - Môi trƣờng ra rễ RDX Royal Demolition eXplosive – Chất độc gây nổ (hexahydro- 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine hay (CH 2 -N-NO 2 ) 3 ). TAE Tris - Acetate - EDTA Taq Thermus aquaticus UOW The University of Wollongong – Trƣờng đại học Wollongong TNT Trinitrotoluen v/p vòng / phút X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside WHO World Health Organization – Tổ chức y tế thế giới 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid 6Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Trang Bảng 1.1. Thời gian tồn lƣu trong đất của một số nông dƣợc 7 Bảng 1.2. Lƣợng thuốc trừ sâu sử dụng ở Việt Nam qua các năm 8 Bảng 1.3. Dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật trong đất nghiên cứu (µg/kg) 9 Bảng 2.1. Các vector sử dụng trong thí nghiệm 26 Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR 31 Bảng 2.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 32 Bảng 2.4. Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 33 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng 34 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối 36 Bảng 3.1. Trình tự mồi nhân gen OPHC2opt 43 Bảng 3.2. Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen OPHC2opt. 53 7Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Trang Hình 1.1. Thực vật xử lý ô nhiễm môi trƣờng 15 Hình 1.2. Mô hình hấp thụ các chất ở thực vật 15 Hình 2.1. Sơ đồ quá trình chuẩn bị cấu trúc gen OPHC2opt 28 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector và chuyển gen OPHC2opt vào cây thuốc lá 29 Hình 2.3. Cấu trúc gen chuyển trong vector pBI121 35 Hình 3.1. Trình tự nucleotide của gen OPHC2 40 Hình 3.2. Trình tự các aa của protein quy định bởi gen OPHC2 40 Hình 3.3. Trình tự nucleotide của gen OPHC2opt 41 Hình 3.4. So sánh trình tự gen OPHC2 của P.pseudoalcaligenes (OPHC2) và OPHC2 đã sửa đổi (OPHC2opt) 42 Hình 3.5. Sơ đồ cấu trúc OPHC2opt chuyển vào thực vật 42 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR pBluescipt II SK/ OPHC2opt 44 Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 bằng BamHI và SacI 45 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm thôi gel vector pBI121 đã cắt mở vòng bằng 2 enzyme BamHI và SacI 46 Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt 47 plasmid pBluescript II SK/OPHC2opt bằng 2 enzyme BamHI và SacI 47 Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm thôi gel cấu trúc OPHC2opt 48 Hình 3.11. Hình ảnh đĩa nuôi cấy E. coli DH5α đã biến nạp pBI121/OPHC2opt 49 Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pBI121/OPHC2opt 49 Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra vector pBI121/OPHC2opt 50 8Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR khuẩn lạc A. tumefaciens Cv58A1 bằng cặp mồi đặc hiệu OPHC2-F/OPHC2-R 52 Hình 3.15. Ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào cây thuốc lá 54 Hình 3.16. Hình ảnh so sánh khả năng phát sinh rễ của cây thuốc lá 55 sau khi nuôi cấy trên môi trƣờng ra rễ 55 Hình 3.17. Hình ảnh điện di mẫu DNA tổng số các mẫu lá 55 cây thuốc lá chuyển gen OPHC2opt 55 Hình 3.18. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OPHC2opt 56 từ lá cây thuốc lá chuyển gen bằng cặp mồi đặc hiệu 56 9Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việc sử dụng tràn lan thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm đất ở nhiều khu vực sản xuất nông nghiệp, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khoẻ của con ngƣời và cây trồng [25], [41]. Một lƣợng thuốc trừ sâu đã và đang phát tán ra môi trƣờng sau đó lắng đọng dần xuống, ngấm vào đất. Thuốc trừ sâu tồn dƣ lâu trong đất dẫn đến ô nhiễm nƣớc ngầm. Chất độc từ thuốc trừ sâu ngấm vào các giếng khoan, các công trình nƣớc sinh hoạt, hồ, ao, sông, suối ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe, sức sinh sản của ngƣời và động vật. , làm sạch đất ô nhiễm là một quá trình cấp thiết nhằm bảo vệ nguồn tài nguyên đất, nƣớc và sức khỏe con ngƣời. Để xử lý đất ô nhiễm ngƣời ta thƣờng sử dụng các phƣơng pháp truyền thống nhƣ: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng phƣơng pháp hoá học hoặc phƣơng pháp vật lý, xử lý nhiệt, trao đổi ion, oxy hoá hoặc khử các chất ô nhiễm, đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi đến những nơi chôn lấp thích hợp, Các phƣơng pháp này thƣờng rất tốn kém về kinh phí, giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích. Gần đây, nhờ những hiểu biết về , ngƣời ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử dụng thực vật để xử lý môi trƣờng nhƣ một công nghệ môi trƣờng đặc biệt. Việc sử dụng thực vật trong công tác làm sạch các loại đất bị ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật (phytoremediation) là công nghệ đã và đang đƣợc áp dụng ở rất nhiều nƣớc trên thế giới, nó đã đem lại hiệu quả cao về công nghệ cũng nhƣ tiết kiệm tiền bạc. Những nghiên cứu này đã đƣợc tiến hành trên nhiều đối tƣợng thực vật nhƣ lúa, Arabidopsis thaliana và cây dƣơng. Tuy nhiên các loại cây trồng truyền thống thƣờng có những hạn chế nhất định về 10Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... organophosphorus hydrolase vào môi trƣờng nuôi cấy và phân hủy đến 99% methyl parathion trong môi trƣờng nuôi cấy sau 14 ngày Từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Thiết kế vector biểu hiện gen organophosphorus hydrolase (OPHC2) phục vụ tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu 2 Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế đƣợc cấu trúc mang gen OPHC2opt tối ƣu phù hợp với biểu hiện trong thực vật Thiết kế đƣợc vector. .. khoa học Trung Quốc trong việc chuyển gen mã hóa enzyme OPHC2 phân lập từ Pseudomonas pseudolicagel biến nạp và biểu hiện trong cây thuốc lá Kết quả phân tích cho thấy, cây thuốc lá chuyển gen đã tiết enzyme OPH ra môi trƣờng nuôi cấy Cây chuyển gen phân hủy đƣợc trên 99% lƣợng thuốc trừ sâu methyl parathion (Mep) tồn dƣ trong môi trƣờng nuôi cấy [39] 1.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT Việc hiểu biết... đƣợc vector mang gen OPHC2opt, nhằm mục đích tạo ra cây trồng có khả năng tiết enzyme OPH phân hủy thuốc trừ sâu dạng OP (Mep) tồn dƣ trong môi trƣờng đất Tạo đƣợc cây thuốc lá chuyển gen mang gen OPHC2opt có khả năng tiết enzyme OPH phân hủy thuốc trừ sâu dạng Mep (một loại OP) 3 Nội dung nghiên cứu - Dựa trên thông tin về trình tự nucleotide của gen OPHC2 đã công bố ngân trên hàng gen GENBANK, đổi mã... đƣa đƣợc các gen quan tâm vào hệ gen của tế bào thực vật, để thu nhận đƣợc các protein tái tổ hợp biểu hiện các tính trạng mong muốn Trong các bƣớc của quy trình chuyển gen ngoài đối tƣợng cây chuyển gen và phƣơng pháp chuyển gen thì việc xác định vector và gen chuyển là những yếu tố quan trọng làm cơ sở cho quá trình chuyển gen thành công [10], [11] 1.3.3 Giới thiệu về vector pBI121 Vector pBI121... nhiều năm [48] Vấn đề tạo ra cây trồng chuyển gen xử lý ô nhiễm môi trƣờng trên thế giới đang đƣợc nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu, hứa hẹn nhiều khả năng xử lý ô nhiễm môi trƣờng đất đạt hiệu quả tối ƣu hơn Tuy nhiên các nghiên cứu trên thế giới chủ yếu tập trung nghiên cứu tạo cây trồng chuyển gen hấp thụ kim loại nặng, việc tạo cây trồng chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu chƣa đƣợc nghiên... SacI đƣợc thiết kế ở hai đầu ở gen gus đƣợc quan tâm sử dụng trong nội dung nghiên cứu này Vì vậy, khi cắt vector pBI121 bằng hai loại enzyme trên chúng ta sẽ thu đƣợc hai băng có kích thƣớc tƣơng ứng khoảng 11,2 kb (vector) và khoảng 1,8 kb (gen Gus) Khi thiết kế vector chuyển gen, gen mục tiêu sẽ đƣợc gắn thay thế cho vị trí của gen Gus trong vector [4] (4) Vùng kết thúc (terminator) Vùng kết thúc... nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật có thời gian bán phân hủy rất lâu Trong đó, Thuốc trừ sâu mà chúng tôi quan tâm nghiên cứu có thời gian bán phân hủy nhanh hơn Tuy nhiên nhƣ với thời gian 0,2 năm cũng gây ra nhiều tác hại nguy hiểm bởi tính độc của nó rất cao Tuy nhiên hiện nay việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nói chung và thuốc trừ sâu trong nông nghiệp nói riêng là việc làm cần thiết Lƣợng thuốc bảo... pháp chuyển gen trực tiếp nhờ polyethylen glycol: là phƣơng pháp chuyển DNA thông qua xử lý polyethylen glycol Là phƣơng pháp chuyển gen cho hiệu quả cao, cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua các thế hệ Ƣu điểm: tần số chuyển nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao, có thể chuyển gen vào protoplast của bất kì loài cây nào Tuy nhiên, việc nuôi cấy protoplast cũng nhƣ việc tái sinh cây. .. nhiễm cho phép các nhà khoa học có thể tạo ra đƣợc các loài cây mới mang những tính trạng này bằng việc sử dụng các kỹ thuật hiện đại của công nghệ sinh học, cụ thể là chuyển gen Hiện nay có nhiều phƣơng pháp chuyển gen vào thực vật nhƣng có thể chia thành hai nhóm phƣơng pháp chính dựa vào cách thức đƣa gen vào tế bào thực vật đó là: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp [1] 29Số hóa bởi Trung... nhiễm Hƣớng nghiên cứu mới hiện nay là tạo ra những cây trồng chuyển gen có khả năng xử lý ô nhiễm vƣợt trội hơn Đã có nhiều nghiên cứu nhƣ vậy đƣợc tiến hành ở các nƣớc trên thế giới nhƣ: Pháp, Mỹ, Trung Quốc Năm 2008 một nhóm các nhà khoa học Trung Quốc công bố đã chuyển thành công gen OPHC2 phân lập từ vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcagenes vào cây thuốc lá Kết quả cho thấy cây này có khả năng kháng . NGUYỄN MẠNH CƯỜNG THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ORGANOPHOSPHORUS HYDROLASE (OPHC2) PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU LUẬN VĂN THẠC SỸ. NGUYỄN MẠNH CƯỜNG THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ORGANOPHOSPHORUS HYDROLASE (OPHC2) PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã. (OPHC2) phục vụ tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu 2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế đƣợc cấu trúc mang gen OPHC2opt tối ƣu phù hợp với biểu hiện trong thực vật. Thiết kế đƣợc vector