Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Hán Thị Hƣơng Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt tại Việt Nam qua khảo sát các gen UL5, UL32 và DNA-polymerase Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Lê Thanh Hòa Hà Nội – 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS.Lê Thanh Hòa - Trƣởng phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn TS.Lê Thị Kim Xuyến - phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học đã hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn NCS.Tạ Hoàng Long - Giám đốc trung tâm kiểm nghiêm thuốc thú y trung ƣơng 1 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này. Em xin cảm ơn sự hỗ chợ kinh phí của đề tài nhánh “Giải mã gen đặc trƣng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của 5 chủng virus gia cầm quốc gia” do PGS.TS Lê Thanh Hòa làm chủ nhiệm thuộc đề tài “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xây dụng danh mục giống virus gia cầm quốc gia” năm 2011 do Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y chủ trì nằm trong “Chƣơng trình công nghệ sinh học Nông nghiệp” của bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Em xin chân thành cảm ơn Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật cùng các thầy cô đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Em xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tất cả các cô chú, anh chị phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình tiến hành thí nghiệm cũng nhƣ tạo mọi điều kiện để luận văn đƣợc hoàn thiện. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ngƣời thân, gia đình và bạn bè đã luôn khuyến khích, động viên cũng nhƣ chia sẻ những khó khăn với em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình. Học viên Hán Thị Hƣơng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cảm ơn…………………………………………………………………….…….i Mục lục………………………………………………………………………… iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ……………………………… ….…iv Danh mục các bảng…………………………………………………………… …v Danh mục các hình…………………………………………………………… …vi ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu về bệnh dịch tả vịt và virus gây bệnh 3 1.1.1. Lịch sử và địa dƣ bệnh 4 1.1.2. Đƣờng xâm nhập, cách lây lan và cơ chế gây bệnh 5 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng 6 1.1.4. Bệnh tích 8 1.1.5. Vaccine phòng bệnh 9 1.2. Sinh học phân tử virus dịch tả vịt 11 1.2.1. Cấu trúc hệ gen của virus dịch tả vịt 11 1.2.2. Sự nhân lên của virus 16 1.3. Tình hình nghiên cứu virus dịch tả vịt trên thế giới và tại Việt Nam 18 CHƢƠNG 2 20 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Vật liệu 20 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Phƣơng pháp tiếp truyền 21 2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 22 2.2.3. Kỹ thuật PCR 23 2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR 24 2.2.5. Phƣơng pháp giải trình tự 25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin-sinh học 26 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Kết quả tiếp truyền virus 28 3.2. Kết quả thu nhận chuỗi gen nghiên cứu 30 3.2.1. Kết quả thu nhận chuỗi gen DNA-polymerase và giải trình tự 30 3.2.2. Kết quả thu nhận chuỗi gen helicase (UL5) và giải trình tự 32 3.2.3. Kết quả thu nhận chuỗi gen kháng nguyên (UL32) và giải trình tự 35 3.3. Kết quả phân tích, so sánh thành phần gen của các chủng virus dịch tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen UL5 và UL32 39 3.3.1. Kết quả phân tích gen UL5 40 3.3.2. Kết quả phân tích gen UL32 46 3.4. Bàn luận chung 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC……………………………………………… ………………… 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt bp base pair Cặp bazơ cDNA complementary DNA DNA bổ sung Da dalton DEV Duck Enteritis Virus Virus gây bệnh dịch tả trên vịt DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic kDa kilo dalton nm nanometer ORF Open Reading Frame Khung đọc mở RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic PCR Polymerase chain reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi gen UL Unique long Vùng dài US Unique short Vùng ngắn UTR Untranslated region Vùng không mã hóa IRS short internal repeat vùng lặp ngắn trong TRS short terminal repeat vùng lặp ngắn cuối Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt trong nghiên cứu sinh học phân tử virus dịch tả vịt. 23 Bảng 2.2 Các cặp mồi (primer) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Kết quả tiếp truyền virus cƣờng độc dịch tả vịt trên vịt 27 Bảng 3.2 Danh sách các chủng Dịch tả vịt của Việt Nam và thế giới sử dụng trong phân tích so sánh 39 Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đƣờng chéo) và tƣơng đồng về amino acid (dƣới đƣờng chéo) của gen UL5 của chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN (Việt Nam) và 07 chủng DTV của thế giới 44 Bảng 3.4 Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đƣờng chéo) và tƣơng đồng về amino acid (dƣới đƣờng chéo) của gen UL32 của chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN (Việt Nam) và 07 chủng DEV của thế giới 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Triệu chứng vịt bị bệnh dịch tả 8 Hình 1.2 Bệnh tích vịt bị bệnh dịch tả vịt 9 Hình 1.3 Cấu trúc không gian của Herpesviruses 11 Hình 1.4 Cấu tạo hạt virus dịch tả vịt 12 Hình 1.5 Chu trình nhân lên của Herpesvirus trong tế bào vật chủ 18 Hình 3.1 Triệu chứng và bệnh tích vịt bệnh dịch tả vịt 28 Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch agarrose 1% 29 Hình 3.3 Trình tự gen DNA-polymerase của chủng DTVCDKN 30 Hình 3.4 Trình tự gen DNA-polymerase của chủng DTVVXKN 31 Hình 3.5 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch agarrose 1% 32 Hình 3.6 Trình tự gen UL5 của chủng DTVCDKN 33 Hình 3.7 Trình tự gen UL5 của chủng DTVVXKN 34 Hình 3.8 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch agarrose 1% 35 Hình 3.9 Trình tự gen UL32 của chủng DTVCĐKN 36 Hình 3.10 Trình tự gen UL32 của chủng DTVVXKN 37 Hình 3.11 Kết quả so sánh thành phần nucleotide của các chủng dịch tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen Helicase (UL5) 42 Hình 3.12 Kết quả so sánh thành phần amino acid của các chủng dịch tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen Helicase (UL5) 43 Hình 3.13 Kết quả so sánh thành phần nucleotide của các chủng dịch tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen kháng nguyên (UL32) 48 Hình 3.14 Kết quả so sánh thành phần amino acid của các chủng dịch tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen kháng nguyên (UL32) 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch tả vịt (duck plague) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh, gây bệnh cho nhiều loài thuỷ cầm, trƣớc hết là loài vịt, ngỗng, ngan, thiên nga, ở hầu hết mọi lứa tuổi từ vài ngày cho đến vài tháng tuổi, thậm chí ở vịt giống nuôi hàng năm (Wobeser, 1997), gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi trên thế giới cũng nhƣ tại Việt Nam. Virus dịch tả vịt (duck enteritis virus-DEV) là thành viên của họ Herpesviridae, có hệ gen là DNA sợi đôi có độ dài khoảng 150-170kb giống nhƣ nhiều loại virus thuộc họ Herpesviridae khác. Phân bố thành phần nucleotide trong hệ gen thiên về G+C (Guanine và Cytosine), chiếm tỷ lệ 64,3%, cao hơn rất nhiều so với các Herpesvirus khác của gia cầm (Gardner và cs., 1993). Mặc dù cho đến nay, virus gây bệnh dịch tả vịt đƣợc phân nhóm vào dƣới họ Alphaherpesvirinae (Shawky và Schat, 2002) nhƣng do đặc tính sinh học và phân loại học của loại virus này còn gặp nhiều vấn đề, nên hiện nay Ủy ban phân loại virus học quốc tế (ICTV) đã tạm thời xếp vào nhóm virus chƣa xác định cụ thể thuộc họ Herpesviridae (Fauquet và cs., 2005; Liu và cs., 2008). Về cấu trúc phân tử, hệ gen của DEV chia làm hai vùng gen quan trọng hay còn gọi là vùng độc nhất (unique region, U), bao gồm UL (vùng dài) và US (vùng ngắn), và bao bọc hai đầu của vùng ngắn là hai vùng lặp ký hiệu IRS và TRS. Vì hệ gen của virus dịch tả vịt tƣơng đối lớn nên đến nay mới chỉ có một vài hệ gen đƣợc giải mã (Wang và cs., 2011), tuy nhiên một số hợp phần gen quan trọng đã đƣợc giải mã và phân tích. Trong số các gen của hệ gen virus dịch tả vịt, ngƣời ta thƣờng sử dụng một số gen đặc thù để làm chỉ thị phân tử chẩn đoán, giám định và xác định đặc tính sinh học hệ gen virus dịch tả vịt, trƣớc hết là gen DNA-polymerase (DNA-pol), gen UL32 mã hoá cho glycoprotein vỏ hay còn đƣợc coi là gen kháng nguyên (Hansen và cs., 2000) và gen UL5 (Pan và cs., 2008). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Cho đến nay virus dịch tả vịt vẫn diễn biến hết sức phức tạp và gây nhiều ổ dịch ở khắp các địa phƣơng trong cả nƣớc. Tuy nhiên, tại Việt Nam lại chƣa có một nghiên cứu đầy đủ nào về đặc tính phân tử, nguồn gốc phả hệ, tính tƣơng đồng giữa các chủng virus cƣờng độc và các chủng virus vaccine. Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt tại Việt Nam qua khảo sát các gen UL5, UL32 và DNA-polymerase”. - Đối tƣợng nghiên cứu: - Chủng virus cƣờng độc dịch tả vịt do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ƣơng cung cấp, đƣợc kí hiệu là DTVCDKN. - Chủng virus nhƣợc độc vaccine do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ƣơng cung cấp, đƣợc kí hiệu là DTVVXKN. - Mục tiêu của đề tài là: Giải mã các gen UL5, UL32 và DNA-polymerase của chủng virus cƣờng độc và nhƣợc độc vaccine tại Việt Nam; phân tích và so sánh đặc điểm sinh học phân tử với các chủng của thế giới. [...]... phát triển của sinh học phân tử, các nghiên cứu sâu hơn về gen/ hệ gen của virus dịch tả vịt đã đƣợc tiến hành (Cheng, 2006 ; Liu và cs., 2008; Li và cs., 2009; Xiang và cs., 2011; Wang và cs., 2011; Liu và cs., 2010; Wu và cs., 2012) Các nghiên cứu trƣớc hết tập trung về đặc điểm sinh học phân tử của các gen/ hợp phần gen quan trọng trong hệ gen của virus Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên... với các virus thuộc chi Mardivirus (Liu và cs., 2008; Wu và cs., 2012) Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2011) cũng đã chỉ ra có sự khác nhau rõ rệt về nguồn gốc giữa các chủng của Châu Á và châu Âu (Wang và cs., 2011) Trong số các gen của hệ gen virus dịch tả vịt, ngƣời ta thƣờng sử dụng một số gen đặc thù để làm chỉ thị phân tử chẩn đoán, giám định và xác định đặc tính sinh học hệ gen virus dịch tả vịt, ... số của mẫu virus cƣờng độc và mẫu virus nhƣợc độc dịch tả vịt nghiên cứu 3 Thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu để thu các gen: DNA- polymerase; gen UL5 và gen UL32 4 Giải mã gen DNA- polymerase, UL5, UL32 của chủng cƣờng độc và chủng vaccine nghiên cứu 5 So sánh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và tƣơng đồng về amino aicd giữa chủng cƣờng độc và nhƣợc độc vaccine của Việt Nam với các chủng của... UL51 (Shen và cs., 2009), gen UL53 (Zhang và cs., 2010; 2011), gen UL55 (Wu và cs., 2012) và một số phân đoạn khác Cho đến nay, đã có 4 hệ gen của virus dịch tả vịt đƣợc giải mã toàn bộ hệ gen, bao gồm 3 chủng vaccine và một chủng cƣờng độc (Wu và cs., 2012) Các nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử đã chứng minh virus dịch tả vịt là thành viên của họ Herpesviridae, mang những đặc điểm đặc trƣng của... sinh học quan trọng của virus nhƣ quá trình sao chép, sửa chữa, tái tổ hợp, sao mã cắt ghép và dịch mã DNA của Herpesvirus.(Marintcheva và Weller, 2001) Bên cạnh gen UL5, gen UL32 cũng đóng vai trò quan trọng, liên quan đến việc phân cắt DNA và bao gói virus (An và cs., 2008; Chang và cs., 2009; Zhu và cs., 2011), tuy nhiên những nghiên cứu về gen này chƣa nhiều Việc bổ sung các thông tin về gen này... của họ này Tuy nhiên do đặc tính sinh học và phân loại học của loại virus này còn chƣa hoàn toàn sáng tỏ, nên Ủy ban phân loại virus học quốc tế (ICTV) đã tạm thời xếp vào nhóm virus chƣa đƣợc xác định cụ thể, thuộc họ Herpesviridae (Liu và cs., 2008;; Nicole, Keith, 2009; Olsson và cs., 2009; Wang và cs., 2011) Tại Việt Nam, những nghiên cứu về virus dịch tả vịt còn chƣa nhiều và chỉ mới tập trung ở... dịch tả vịt nhƣợc độc đông khô Nobilis Duck Plague nhập khẩu từ Hà Lan 5 Vaccine dịch tả vịt đông khô Vaxiduk chủng Jansen nhập khẩu từ Pháp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.2 Sinh học phân tử virus dịch tả vịt Virus dịch tả vịt (duck enteritis virus- DEV) hay anatid herpesvirus 1 (AnHV-1), là thành viên của họ Herpesviridae Tuy nhiên do đặc tính sinh học. .. nhóm vào dƣới họ Alphaherpesvirinae (Shawky và Schat, 2002) 1.2.1 Cấu trúc hệ gen của virus dịch tả vịt Virus dịch tả vịt có kích thƣớc khoảng 160.000bp (Li và cs., 2009; Wu và cs., 2012), bao gồm hai vùng gen là vùng gen dài (UL) và vùng gen ngắn (US) với tổng số 78 khung đọc mở (ORF) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 1.4 Cấu tạo hạt virus dịch tả vịt. .. Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 1.5 Chu trình nhân lên của Herpesvirus trong tế bào vật chủ (Nguồn: Nguyễn thị Chính, Ngô Tiến Hiển, 2001) 1.3 Tình hình nghiên cứu virus dịch tả vịt trên thế giới và tại Việt Nam Virus dịch tả vịt đƣợc Dardiri và Hwang tập trung nghiên cứu vào năm 1968, (Dardiri, Gailunas, 1968; Hwang, 1968) Tiếp theo khoảng thời gian đó, nhiều nghiên cứu. .. hình dịch bệnh và các biểu hiện bệnh tích, triệu chứng lâm sàng (Nguyễn Ngọc Điểm, 2005) Một số công bố về kiểm tra đáp ứng miễn dịch của vaccine và giới thiệu một số vaccine có nguồn gốc từ nƣớc ngoài (Lê Văn Lãnh, 1991; Nguyễn Đức Hiền, 1999) Đặc biệt chƣa có công bố nào về sinh học phân tử virus dịch tả vịt ở mức độ gen và so sánh phân tích hệ gen tại Việt Nam Chính vì vậy mà việc bắt đầu và đẩy . 1.2. Sinh học phân tử virus dịch tả vịt 11 1.2.1. Cấu trúc hệ gen của virus dịch tả vịt 11 1.2.2. Sự nhân lên của virus 16 1.3. Tình hình nghiên cứu virus dịch tả vịt trên thế giới và tại Việt. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt tại Việt Nam qua khảo sát các gen UL5, UL32 và DNA- polymerase Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30. gen virus dịch tả vịt, ngƣời ta thƣờng sử dụng một số gen đặc thù để làm chỉ thị phân tử chẩn đoán, giám định và xác định đặc tính sinh học hệ gen virus dịch tả vịt, trƣớc hết là gen DNA- polymerase