Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ GIANG NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG VÀ GIÁ THỂ MÔ RỄ ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN SINH KHỐI CỘNG SINH NẤM RỄ AM (ARBUSCULAR MYCORRHIZA)IN VITRO Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.LÊ QUỐC HUY Hà Nội– Năm 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và gia đình. Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quốc Huy, Phòng Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường, Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi hoàn thiện luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể cán bộ, giáo viên bộ môn Vi sinh vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, những người Thầy đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo sau Đại Học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn,giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Ngô Thị Thanh Huệ và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường cũng như tập thể cán bộ thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài. Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của tôi,những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ, động viên và là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập hoàn thành khóa học này./. Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Giang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác./. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Giang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………………. 1 1.1. Đặt vấn đề……………………………………………………………… 2 1.2. Mục tiêu đề tài………………………………………………………… 2 1.2.1. Mục tiêu chung………………….……….……………………… 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể………… … ………………………………… 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài……………………………… 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học…………………………………………………. 2 1.3.1. Ý nghĩa thực tiễn…………………………………………………. 2 1.4. Phạm vi nghiên cứu…………………………………………………… 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU……………………… 3 1.1. Tổng quan về nấm rễ nội cộng sinh AM ……………………………… 3 1.1.1. Khái niệm…………………………………………………………. 3 1.1.2. Đặc điểm của Nấm rễ nội cộng sinh AM(Arbuscular mycorrhiza)……. 4 1.1.3. Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh với cây chủ…………………… 9 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Agrobacterium rhizogense…………………… 12 1.3. Nghiên cứu nẫm rễ nội cộng sinh trên Thế giới và Việt Nam………… 13 1.3.1. Trên thế giới …………………………………………………… 13 1.3.2. Trong nước ……………………………………………………… 19 Chƣơng 2. VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu…………… ……………………………………… 22 2.2. Nội dung nghiên cứu …………………………………………………. 23 2.2.1. Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro………………… 23 2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro………………….…………………… 23 2.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro………………………………… 23 2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro………………………………… ………… 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………. 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………… 24 2.3.2. Phương pháp tạo vật liệu mô rễ in vitro ………………………… 24 2.3.3. Phương pháp cấy chuyển và nhân sinh khối mô rễ ……………… 28 2.3.4. Phương pháp tạo cộng sinh AM in vitro………………………… 28 2.3.5. Phương pháp nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro …………… 29 2.3.6. Phương pháp thu thập, phân tích và xử lý thống kê số liệu thí nghiệm…………………………………………………………………………. 29 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………………………………… 31 3.1. Kết quả tạo vật liệu giá thể mô rễin vitro ……… …………………… 31 3.2.Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro……………………………………………………………… 32 3.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro………………………………………………………… 38 3.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro……………………………………………………………………. 44 Chƣơng 4. KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ……………………… 50 4.1. Kết luận………………………………………………………………… 50 4.2. Tồn tại và kiến nghị……………………………………………… 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………… 52 PHỤ LỤC……………………… 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN STT Viết tắt Viết đầy đủ 1 AM Arbuscular mycorrhiza 2 EM Ectomycorrhiza 3 IBA Indole butylic acid 4 IP Infective propagules 5 M Minimal medium 6 MS Murashige and Skoog medium 7 MSR Strullu and Romand medium 8 PCR Polymerase chain reaction 9 Ri-tDNA Root inducing –transfer Deoxyribonucleic acid 10 rRNA Ribosomal Ribonucleic acid 11 TY trypton-yeast extract medium 12 VAM Vesicular arbuscular mycorrhiza 13 VM Vesicular mycorrhiza Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA………………………………………………………………………… 32 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 34 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………… 35 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 36 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA………………………………………………………………………… 38 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA………………………………………………………………………… 40 Bảng 3.7:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………… 41 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………… 42 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro trên chủng 41833……………………………… 45 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro trên chủng M7………………………………… 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 33 Biểu đồ3.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 35 Biểu đồ3.3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 36 Biểu đồ3.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 37 Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA……………………………………………………………………… 39 Biểu đồ3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA……………………………………………………………………… 41 Biểu đồ3.7:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA…. 42 Biểu đồ3.8: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………. 43 Biểu đồ3.9: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 41833-Cà rốt Ri-tDNA, M7-Cà rốt Ri-tDNA, 41833-Medicago Ri-tDNA, M7-Medicago Ri-tDNA trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5…………………………………… 44 Biểu đồ3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro trên chủng 41833……………………………… 46 Biểu đồ3.11: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn cộng sinh với chủng 41833 trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5……… 47 Biểu đồ3.12: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro trên chủng M7………………………………… 49 Biểu đồ3.13: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ cộng sinh với chủng M7 trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5…………. 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây phân loại nấm rễ nội cộng sinh AM…………………… … ….5 Hình 1.2.a: Búi sợi nấm (Arbuscules)………………… ………………… ……6 Hình 1.2.b: Túi sợi nấm (Vesicules)………………… ………… …6 Hình 1.3.a : Sợi nấm ngoại bào(extraradical hyphae) ………………… ……… 7 Hình 1.3.b : Bào tử (spores) …………………………………… …………… 7 Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc AM điển hình……………………………………………8 Hình 1.5.a: Cây Medicago truncatula phát triển bình thường………… … 11 Hình 1.5.b: Cây Medicago truncatula có cộng sinh nấm rễ…………….…… 11 Hình 1.6: Cấu trúc vòng Ri-plasmids của vi khuẩn A. rhizogenes(Veena and Taylor 2007)……… …………………………………………………… ………13 Hình 2.1.a: Gieo hạt Medicago…………………… …………… ……… … 24 Hình 2.1.b: Rễ Medicago phát triển sau 5 ngày……………… …….……… 24 Hình 2.2.a: Hạt Cà rốt nảy mầm sau 4 ngày gieo hạt 25 Hình 2.2.b: Rễ Cà rốt không chuyển gen Ri-tDNA phát triển sau 30 ngày 25 Hình 3.1.a : Rễ Cà rốt không có gen Ri-tDNA 31 Hình 3.1.b :Rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA 31 Hình 3.2. Phân tích PCR cho mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA và không chuyển gen Ri-tDNA. Băng 1: có gen rolB; băng 2: có gen rolC (cho mẫu chuyển gen); băng 3 và 4: không có gen rolB và rolC (cho mẫu không chuyển gen); M: DNA thang chuẩn 100 bp (Fermentas) 32 Hình 3.3.a: Rễ Medicago không có gen Ri-tDNA 32 Hình 3.3.b: Rễ Medicago có gen Ri-tDNA 32 Hình 3.4.a: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR 0,5% agar……… ….37 Hình 3.4.b: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR lỏng…… …… … 37 Hình 3.4.c: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MS 0,5% agar ……….….37 Hình 3.5.a: AM cộng sinh vào rễ Cà rốt và sinh trưởng sợi nấm mới…… … 45 Hình 3.5.b: AM cộng sinh vào rễ Medicago và sinh trưởng sợi nấm mới…… 45 Hình 3.6.a: Sinh sản bào tử AM trên giá thể Cà rốt có Ri-tDNA sau 1 tháng 50 Hình 3.6.b: Sinh sản bào tử AM trên giá thể Cà rốt có Ri-tDNA sau 4 tháng 50 [...]... 0,5% agar 2.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro CTTN CT1 CT2 CT3 pH 5,0 5,5 6,0 2.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro CTTN CT1.1 CT1.2 CT2.1 CT2.2 Loại giá thể mô rễ Mô rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA Mô rễ Cà rốt không gen Mô rễ Medicago có gen Ri-tDNA Mô rễ Medicago không gen... - Trong thí nghiệm về Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, sử dụng giá thể là mô rễ Cà rốt và Medicago có chuyển gen Ri-tDNA cộng sinh với chủng 41833 và chủng M7 - Trong thí nghiệm về Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, sử dụng môi trưởng MSR 0,5% agar (là loại môi trường đã được lựa chọn với... đã được lựa chọn với mục đích tối ưu hóa cho khả năng nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro trong thí nghiệm ở mục 2.2.2) - Trong thí nghiệm về Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, sử dụng môi trường nuôi cấy là môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5 2.3.2 Phương pháp tạo vật liệu mô rễ in vitro a Tạo vật liệu mô rễ không chuyển gen Ri-tDNA(Abdoulaye 2003,... Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro - Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ Cà rốt (Daucus carrota L.) và Medicago (Medicago truncatula) in vitro không có gen Ri-tDNA - Nghiên cứu tạo vật liệu mô rễ Cà rốt (Daucus carrota L.) in vitro có gen Ri-tDNA 2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro CTTN CT1 CT2 CT3 Môi trƣờng MSR 0,5% agar... vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu chung Nhằm nghiên cứu một số cơ sở khoa học cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM invitro và sản xuất chế phẩm ứng dụng cho cây trồng và bảo vệ môi trường 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Nhằm nghiên cứu lựa chọn được môi trường phù hợp cho hình thành cộng sinh và nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro - Nhằm nghiên... ―Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng và giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM (Arbuscular mycorhiza) in vitro ‖đã được đề xuất thực hiện Đề tài Thạc sĩ này của tôi được thực hiện trong khuôn khổ Đề tài cấp Nhà nước về ―Nghiên cứu sản xuất nấm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza) cho cây Lâm nghiệp‖thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong... giá thể mô rễ phù hợp cho nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.3.1.Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các cơ sở khoa học quan trọng cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM invitro và sản xuất chế phẩm ứng dụng cho cây trồng và bảo vệ môi trường 1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đề xuất được loại môi. .. rễ nội cộng sinh AM, đó là, trong bất kỳ điều kiện nuôi cấy nào, ở bên ngoài môi trường đất (in vivo) hay trong điều kiện nuôi cấy vô trùng (invitro), sinh khối của chúng chỉ có thể được nhân lên khi hình thành được cộng sinh với tế bào vỏ rễ của các thực vật chủ Do đó, việc sử dụng môi trường dinh dưỡng nhân tạo không có giá thể mô rễ không đáp ứng được nhu cầu sinh trưởng, phát triển của AM (Roger... và cũng thấy sự hình thành cộng sinh ít hơn (0,13g sinh khối khô trong 1 lít môi trường) Kết quả nghiên cứu đã mở ra khả năng nhân nhanh bào tử AM bằng bioreactor Gần đây, tháng 1 năm 2009, nhóm tác giả Venter, Marianne, Wilma đã báo cáo kết quả nghiên cứu trình bày thông tin khá đầy đủ và toàn diện về nhân sinh khối AMin vitro, bao gồm: phương pháp tạo cộng sinh AM, nhân sinh khối bào tử AM trong môi. .. đã quan sát thấy có sự hình thành nhiều lông rễ trong môi trường nhân tạo và đã thúc đẩy cơ sở cho nhân sinh khối AM in vitro Tác giả đã quan sát thấy sự cộng sinh hình thành giữa AM và rễ chuyển gen khi nuôi cấy cùng với bào tử Glomus mosseae Tuy nhiên đã có sự sinh trưởng giới hạn và chu trình sinh trưởng phát triển hoàn chỉnh của AM trong môi trường in vitro chưa được hoàn thiện Trong nhiều nghiên . hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro ……………………………… 23 2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm. hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro ……………………………………………………… 38 3.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro ………………………………………………………………… liệu giá thể mô rễ in vitro ……………… 23 2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro ……………….…………………… 23 2.2.3. Đánh giá ảnh hưởng