ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN      TRƯƠNG LÂM SƠN HẢI KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PYROLYSIS GHÉP NỐI SẮC KÝ KHÍ TRONG PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU Chuyên ngành: Hóa Phân Tích Mã số chuyên ngành: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN ÁNH MAI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012 LỜI CẢM ƠN Trải qua hơn một năm làm luận văn tốt nghiệp, tôi đã học, đã rút ra được nhiều kinh nghiệm cùng những kiến thức quý báu, được những thành quả đó là nhờ có sự giúp đỡ nhiệt tình của tất cả thầy cô, anh, chị em trong bộ môn nói riêng cùng các thầy cô trong Khoa Hóa nói chung. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Cô Nguyễn Ánh Mai, người đã tận tình hướng dẫn và chỉ dạy cho tôi mọi thứ, truyền đạt rất nhiều kinh nghiệm không chỉ trong khoa học mà còn cả những điều trong cuộc sống, cho công việc sau này, nhất là Cô luôn giúp đỡ khi tôi gặp rắc rối và những trường hợp gần như không còn cách giải quyết cho các vấn đề thực nghiệm. Tôi đã học hỏi được rất nhiều ở Cô về cách làm việc khoa học và cách suy nghĩ thấu đáo. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến Đại Học Umea - Thụy Điển đặc biệt là Larks - Lundmark, Marcus và Elin đã hỗ trợ thiết bị Pyrola 85 cũng như các kiến thức về lĩnh vực pyrolysis để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Xin cảm ơn đến anh Trần Thanh Tú đã giúp tôi rất nhiều khi bắt đầu làm quen trong lĩnh vực chemometrics, tận tình chỉ bảo tôi về phần mềm SIMCA - P và đặc biệt luôn đưa những lời khuyên hữu ích cho tôi. Tôi cũng xin cảm ơn đến tất cả các anh, chị và các em trong phòng thí nghiệm, luôn quan tâm chia sẻ, động viên, cho tôi thật nhiều kỷ niệm đẹp, vui có, buồn có, nhưng đó điều là những điều đáng nhớ trong suốt cuộc đời tôi. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những người bạn SACUS, luôn chia sẻ, động viên, luôn mang đến những nụ cười cho tôi, giúp đỡ trong những lúc khó khăn nhất. Một lần nữa, cảm ơn “ những người bạn bên tôi - SACUS” Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình. Có thể gia đình tôi chẳng bao giờ đọc được lời cảm ơn này. Ba tôi chỉ nâng niu quyển luận văn, vuốt ve cái bìa xanh nhung, tấm tắc khen dòng chữ mạ vàng, nhưng ba sẽ không lật vào trong để đọc lời cảm ơn của tôi. Nhìn tôi khôn lớn, nhìn tôi mặc áo chùng xanh nhận bằng tốt nghiệp, nhìn tôi ôm quyển luận văn rạng rỡ,… thì vài dòng cảm ơn nhỏ nhoi ấy có đáng là gì! Cũng như nhiều người xuất hiện trong lời cảm ơn của tôi, chắc chẳng bao giờ họ đọc, chắc họ cũng quên mất rằng họ từng góp phần giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này. Nhưng với tôi thì tôi vẫn phải viết lời cảm ơn một cách trân trọng nhất, vẹn tròn nhất! Không chỉ là một “thủ tục luận văn”, không chỉ là một hành động tri ân, mà còn để sau này khi vuốt ve trang đầu tiên ấy tôi sẽ nhớ: ờ, ngày đó, tháng đó, những khó khăn lúc đó, đã có những lòng tốt, những người tốt như thế đó ở bên cạnh tôi,… Thành Phố Hồ Chí Minh, Tháng 9 năm 2012 DANH MỤC VIẾT TẮT EI: (Electron Impact) va chạm electron GC-FID: (Gas chromatography - Flame Ionization Detector) Sắc ký khí đầu dò ion hoá ngọn lửa MS: (Mass Spectrometry) khối phổ PVC: Polyvinyl Chloride RSD: (Relative Standard Deviation) độ lệch chuẩn tương đối MVDA: (Multivariate Data Analysis) phân tích dữ liệu đa biến PCA: (Principle Component Analysis) phân tích thành phần (cấu tử) chính PC: (Principle Component) thành phần (cấu tử) chính PLS - DA: (Partial Least Square - Discrimination Analysis) bình phương cực tiểu từng phần dùng để phân loại SPSS: (Statistical Package for the Social Sciences) phần mềm thống kê phục vụ ngành khoa học xã hội STATISTICA: phần mềm xử lý số liệu thống kê SIMCA: Soft independent modeling of class analogy QSAR: (Quantitative Structure - Activity Relationship) Quan hệ tuyến tính giữa cấu trúc và hoạt tính HQ: Hàn Quốc NIR: (Near - infrared spectroscopy) Cận hồng ngoại FT - IR: (Fourier transform infrared spectroscopy) Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1-1: Sơ đồ thiết bị của Furnace Pyrolyzer ghép nối máy sắc ký khí 2 Hình 1-2: Sơ đồ pyrolyzer sử dụng kỹ thuật Curie - point 3 Hình 1-3: Sơ đồ pyrolyzer kỹ thuật gia nhiệt điện trở filament 5 Hình 1-4: Sơ đồ các bộ phận của máy Pyrolysis ghép trực tiếp MS 1 Hình 1-5: Sơ đồ mặt cắt ngang của hệ thống inlet 1 Hình 1-6: Sắc ký đồ nhiệt phân của polyvinyl chloride ở nhiệt độ 600 o C 1 Hình 1-7: Cấu trúc Polyurethane 8 Hình 1-8: Hệ thống GC - FID 9 Hình 1-9: Cấu tạo buồng tiêm chia dòng 1 Hình 1-10: Cấu tạo của cột mao quản 1 Hình 1-11: Các loại cột mao quản dùng trong sắc ký 1 Hình 1-12: Cấu tạo đầu dò FID 14 Hình 1-13: Sơ đồ hệ thống buồng nhiệt phân 15 Hình 1-14: (a) Bộ điều khiển (Control unit); (b) Buồng nhiệt phân được gắn trực tiếp trên GC (c) Lá platin được đặt bên trong cuvet thủy tinh; (d) Vị trí kim tiêm vào GC của hệ Pyrola 85 16 Hình 1-15: Bộ dữ liệu đa biến và khó khăn trong việc phân tích các bộ dữ liệu này 1 Hình 1-16: Ba ứng dụng cơ bản của MVDA từ trái sang phải (1) Khái quát bộ dữ liệu, (2) Phân loại và (3) Mô hình hoá quan hệ giữa khối dữ liệu X và khối dữ liệu Y 18 Hình 1-17: Điểm i trong không gian 3 chiều 19 Hình 1-18: Đồ thị biễu diễn cách hiệu chuẩn điểm trung bình về 0 (mean - centering) 1 Hình 1-19: Thể hiện sự thay đổi của các biến sau khi xử lý sơ bộ dữ liệu (hiệu chỉnh phương sai bằng 1 và giá trị trung bình bằng 0) 1 Hình 1-20: (a) PC1 và PC2 trong không gian; (b) Mặt phẳng tạo bởi PC1 và PC 2 22 Hình 1-21: Biểu đồ score biễu diễn phân bố tập quán ăn uống của 16 nước châu Âu. Trong đó Thụy Điển (Swe), Đan Mạch (Den), Phần Lan (Fin), Na Uy (Nor), Bỉ (Bel), Đức (Ger), Anh (Eng), Áo (Aus), Ý (Ita), Tây Ban Nha (Spa), Bồ Đào Nha (Por), Pháp (Fra), Hà Lan (Hol) 1 Hình 1-22: Điểm lệch mạnh của tập hợp mẫu nghiên cứu 23 Hình 1-23: Biểu đồ loading của 20 loại thực phẩm thường sử dụng của người châu Âu. Trong đó Tỏi (Garlic), Dầu olive (Olive_oil), Chất tạo ngọt (Sweetner), Bánh mì dòn (Crisp_Brea), Cá đông lạnh (Fro_Fish) 1 Hình 1-24: Sự phụ thuộc Q 2 và R 2 theo số cấu tử PC 25 Hình 1-25: Chức năng xây dựng quan hệ định lượng giữa hai bộ dữ liệu X (biến dự đoán) và Y (biến đáp ứng) 25 Hình 1-26: Khái quát về PLS 27 Hình 1-27: Mức độ chặt chẽ trong mối tương quan giữa X và Y giải thích bởi thành phần PLS thứ nhất (trái) và PLS thứ hai (phải) 27 Hình 1-28: Thí dụ về biểu đồ trọng số trong PLS 1 Hình 1-29: Bài toán phân loại mẫu khi sử dụng PLS - DA 29 Hình 1-30: Biểu đồ score theo PC1 và PC2 của nhân sâm vùng Ganghwa và Punggi.29 Hình 2-1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa điện trở Ro và nhiệt độ T C 35 Hình 2-2: Đường chuẩn (1) biểu diễn sự phụ thuộc giữa điện trở Ro và nhiệt độ lá Platin 35 Hình 2-3: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa E diod và nhiệt độ nhiệt phân Tp 36 Hình 2-4: Đường chuẩn (2) biểu diễn sự phụ thuộc của E diod tuyến tính nhiệt độ nhiệt phân T R 37 Hình 2-5: Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ oven của hệ Pyrolysis 38 Hình 2-6: Ảnh hưởng của nhiệt độ nhiệt phân trên sản phẩm nhiệt phân của mẫu nhân sâm HQ khi phân tích bằng GC - FID 39 Hình 2-7: Sắc ký đồ tương ứng với các loại khí mang He, Ar, N 2 cho hệ Pyrolyzer 40 Hình 2-8: Sơ đồ hệ thống khí mang kết nối với Pyrola 85 thông qua bộ điều chỉnh lưu lượng 41 Hình 2-9: Sắc ký đồ tương ứng với các tốc độ dòng khí mang cung cấp cho hệ Pyrola 85 42 Hình 2-10: Biểu đồ biểu diễn thời gian và cường độ dòng tạo xung khi thực hiện quá trình pyrolysis 43 Hình 2-11: Sắc ký đồ khảo sát các tỷ lệ tiêm chia dòng 44 Hình 2-12: Sắc ký đồ khảo sát tiêm không chia dòng 44 Hình 2-13: Sắc ký đồ khảo sát chương trình nhiệt trên mẫu nhân Sâm Hàn Quốc 6 tuổi. Trong đó (a) Chương trình nhiệt (1) và (2), (b) Chương trình nhiệt (3) 46 Hình 2-14: Hình dạng của các đối tượng dược liệu, (a): Cát cánh, (b): Đảng sâm, (c): Hồng sâm; (d): Sâm Ngọc Linh, (e): Tam thất, (f): Huyền sâm 51 Hình 2-15: Sắc ký đồ của sâm HQ 6, 5, 4 tuổi và sâm HQ 6 tuổi chiết 1 lần 51 Hình 2-16: (a) Biểu đồ score của 2 thành phần chính PC1 và PC2 của các mẫu sâm HQ và các loại giả sâm; (b) Giá trị R 2 và Q 2 cuả mô hình ứng với 1PC, 2PC và 3PC 32 Hình 2-17: Biểu đồ score (a), R 2 và Q 2 (b) và loading (c) của 2 thành phần chính PC1 và PC2 của các mẫu sâm và giả sâm HQ. Trong đó, nhóm (2), (3) và (5) là sâm HQ 6, 5 và 4 tuổi; nhóm (4), (6) và (7) là sâm HQ 6, 5, và 4 tuổi bị chiết 1 lần, nhóm (8) là sâm HQ bị chiết 2 lần, nhóm (1) là các mẫu giả sâm 32 Hình 2-18: Biểu đồ score (a), R 2 và Q 2 (b) và loading (c) của 2 thành phần chính PC1 và PC2 của các mẫu sâm HQ. Trong đó, nhóm (1), (3) và (4) là sâm HQ 6, 5 và 4 tuổi; nhóm (2), (5) và (6) là sâm HQ 6, 5 và 4 tuổi bị chiết 1 lần, nhóm (7) là sâm HQ bị chiết 2 lần 32 Hình 2-19: a) Biểu đồ score của 2 thành phần chính PC1 và PC2 của các loại mẫu Sâm Hàn Quốc với nhóm (1), (2), (3) nhân sâm 6, 5 và 4 tuổi và nhóm (4) nhân sâm 6 tuổi đã chiết 1 lần b) Biểu đồ sự thay đổi của R 2 và Q 2 theo số lượng thành phần chính của mô hình 32 DANH MỤC BẢNG Bảng 2-1: Ảnh hưởng của nhiệt độ buồng nhiệt phân trên điện trở R o của lá Pt 34 Bảng 2-2: Ba chương trình nhiệt khảo sát trên mẫu nhân sâm 6 tuổi 46 Bảng 2-3: Khảo sát độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích peak 48 Bảng 2-4: Tên, phân loại và công dụng của các loại dược liệu 50 Bảng 2-5: Thành phần các hợp chất trong nhân Sâm Hàn Quốc 56 Bảng 2-6: Phần trăm dự đoán một số mẫu sâm HQ thuộc nhóm 4, 5 và 6 tuổi và 6 tuổi chiết 1 lần 57 Bảng 2-7: Phần trăm dự đoán một số mẫu sâm HQ 4, 5 tuổi chiết 1 lần và các mẫu giả sâm 59 LỜI MỞ ĐẦU Khi đời sống con người không ngừng đựơc nâng cao thì sức khỏe chính là mối quan tâm hàng đầu. Bên cạnh các loại tân dược thì các loại thảo dược thiên nhiên ngày càng được sử dụng nhiều do có khả năng điều trị bệnh tốt mà lại ít gây tác dụng phụ. Hơn thế nữa, thị trường thảo dược ngày càng phức tạp với hiện tựơng cung không đủ cầu đã gây nên tình trạng các thảo dược này bị trà trộn với các loại thuốc giả, cây thuốc không rõ nguồn gốc, pha trộn với các loại thuốc khác, nguồn nguyên liệu bị nhiễm bẩn, cũng như dược liệu đã bị chiết xuất hết các hợp chất có hoạt tính và được tái sử dụng. Ngoài ra, những cơ sở sản xuất dược liệu ở nước ta lại không đảm bảo vệ sinh, phơi trực tiếp dược liệu trên mặt đất hoặc mọi chỗ trống nên dược liệu có tốt cũng nhanh mất chất lượng. Song, năng lực kiểm tra và giám sát chất lượng thuốc của các cơ quan chức năng còn nhiều bất cập. Chính vì thế, sự an toàn và chất lượng của các loại thảo dược đã ngày càng trở thành những mối quan ngại lớn cho cộng đồng vì gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng. Trước nhu cầu cần thiết về việc quản lý chất lượng dược liệu cần xây dựng các phương pháp phân tích có khả năng xác định nhanh nguồn gốc, phẩm chất thành phần dược liệu, tránh loại bỏ các bước xử lý mẫu phức tạp, tiêu tốn nhiều loại dung môi độc hại gây ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường. Với mục đích trên trong luận văn cao học này chúng tôi tập trung vào việc phát triển một phương pháp phân tích nhanh kết hợp pyrolysis và sắc ký khí nhằm góp phần phát triển và bảo vệ ngành công nghiệp dược của nước ta. Kỹ thuật pyrolysis, đơn giản là sự nhiệt phân trong môi trường khí trơ để chuyển hóa các hợp chất khó bay hơi trong mẫu rắn thành các chất có phân tử lượng nhỏ hơn, dễ bay hơi hơn. Mỗi loại vật liệu khi phân hủy ở một nhiệt độ nhất định sẽ tạo thành một hỗn hợp các sản phẩm đặc trưng có thể sử dụng như dấu vân tay để định danh vật liệu ấy. Kết hợp giữa kỹ thuật pyrolysis và sắc ký khí với khả năng phân tách rất cao và các đầu dò nhạy như đầu dò ion hóa ngọn lửa hoặc chọn lọc như đầu dò khối phổ cho phép việc định danh các vật liệu được chắc chắn hơn. Phương pháp pyrolysis ghép nối sắc ký đã được phát triển và đưa vào ứng dụng trong các lĩnh vực polymer, công nghệ dệt, vật liệu, dược liệu,… ở các nước phát triển như Trung Quốc, Thụy Điển, Pháp, Mỹ, Anh, Đức,… Tại Trung Quốc, kỹ thuật này được ứng dụng rất mạnh trong việc xác định thành phần, chất lượng, nguồn gốc dược liệu đặc biệt là các sản phẩm đông dược. Pyrolysis ghép nối sắc ký khí tuy không phải là vấn đề mới đối với thế giới nhưng ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu sâu về kỹ thuật này, đặc biệt là kết hợp với phương pháp thống kê (như phân tích dữ liệu đa biến) để xử lý số liệu phân tích giúp việc phân biệt độ tuổi và giống cây của các loại dược liệu quý được dễ dàng hơn (nhân sâm, trầm hương,…). Mặt khác, phương pháp này sẽ giúp các cơ quan chức năng quản lý được chất lượng cũng như phân biệt dược liệu giả trên những đối tượng dược liệu đặc thù cho Việt Nam. . PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN      TRƯƠNG LÂM SƠN HẢI KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PYROLYSIS GHÉP NỐI SẮC KÝ KHÍ TRONG PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU Chuyên ngành: Hóa Phân. sản phẩm nhiệt phân. 1.2.3. Ứng dụng pyrolysis trong hoá học [4] 1.2.3.1. Ứng dụng pyrolysis để kiểm tra nhựa polvinyl chloride Nhựa polyvinyl chloride (PVC) được ứng dụng rất nhiều trong đời sống. chính xác và rõ ràng hơn. 1.2. Phân loại các kỹ thuật nhiệt phân [1,2] Ba kỹ thuật pyrolysis sử dụng phổ biến là: Curie - point (gia nhiệt filament cảm ứng) , lò đẳng nhiệt (isothermal furnace),