Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI NGỌC BÍCH SO SÁNH SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ VÀ PHÂN LẬP GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KÉO DÀI RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cám ơn TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã đóng góp những ý kiến quý báu và tận tình chỉ bảo, hết lòng giúp đỡ tôi trong qúa trình hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Phòng thí nghiệm sinh học, khoa Khoa học sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên, các cán bộ trung tâm Kiểm nghiệm Dƣợc phẩm- Hoá mỹ phẩm Lạng Sơn Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám hiệu trƣờng THPT Lộc Bình Lạng Sơn đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành khoá học. Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên khuyến khích giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn. Tác giả luận văn Bùi Ngọc Bích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1.1. Lý do chọn đề tài 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3. Nội dung nghiên cứu 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và vị trí cây đậu tƣơng 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng 5 1.2. ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN VÀ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 6 1.2.1. Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 6 1.2.2 Mối liên quan giữa tính chịu hạn và sự phát triển bộ rễ của cây đậu tƣơng 10 1.3. GEN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 11 1.3.1. Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 11 1.3.2 Gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tƣơng 14 1.3.3. Biện pháp công nghệ sinh học trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng 15 1.3.4. Expansin và gen expansin ở cây đậu tƣơng 17 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25 2.1.1. Vật liệu 26 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 26 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 26 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v 2.2.1. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng non trong điều kiện hạn nhân tạo 27 2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá sự phát triển của bộ rễ trong điều kiện hạn nhân tạo thông qua chiều dài rễ 28 2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá sự phát triển của bộ rễ trong điều kiện hạn nhân tạo thông qua số lƣơng rễ con 28 2.2.4. Xác định chỉ số chịu hạn tƣơng đối thông qua sự phát triển bộ rễ 28 2.2.5 . Phƣơng pháp sinh học phân tử 29 2.2.6. Xử lý kết quả và tính toán số liệu 35 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. SỰ PHÁT TRIỂN CỦA BỘ RỄ VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 36 3.1.1. Sự phát triển của bộ rễ của cây đậu tƣơng non trong điều kiện không xử lý và xử lý bởi hạn 36 3.1.2. Khả năng chịu hạn của ba giống đậu tƣơng nghiên cứu 39 3.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA CẤU TRÚC GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG LƠ BẮC GIANG VÀ XUÂN LẠNG SƠN 41 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá non đậu tƣơng 41 3.2.2. Kết quả nhân bản gen GmEXP1 từ DNA hệ gen của hai giống đậu tƣơng XLS và LBG 43 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 45 3.2.4. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu 45 3.2.5 Kết quả xác định và so sánh trình tự nucleotide của gen GmEXP1 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid ASTT Áp suất thẩm thấu Bp Cặp bazơ cDNA Sợi ADN bổ sung đƣợc tổng hợp từ mARN nhờ Enzym phiên mã ngƣợc dNTP Deoxynucleotide đtg Đồng tác giả DHA Docosa Hexaenoic acid HSP Heat Shock protein - Protein sốc nhiệt HSG Heat Shock Granules - Hạt sốc nhiệt HSPL Hệ số pha loãng Kb Kilo Bazo = 1000 bp LEA Late embryogenesis abundant (Protein đƣợc hình thành với số lƣợng lớn trong quá trình hình thành phôi). LBG Đậu tƣơng lơ Bắc Giang MGPT Môi giới phân tử - Molecular chaperone MW Molecular weight - Khối lƣợng phân tử PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polymerase XLS Đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Nguôn gốc các giống đậu tƣơng nghiên cứu 25 2.2 Trình tự cặp mồi nhân gen GmEXP1 30 2.3 Thành phần phản ứng PCR 31 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 31 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT 33 3.1 Số lƣợng rễ con và kích thƣớc rễ của ba giống đậu tƣơng trong điều kiện không xử lý và xử lý bởi hạn 37 3.2 Chỉ số chịu hạn tƣơng đối của ba giốngđậu tƣơng nghiên cứu 40 3.3 Giá trị mật độ quang của phổ hấp thụ DNA ở bƣớc sóng 260nm và 280nm của giống đậu tƣơng XLS và LBG 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Trình tự của vùng mã hóa của gen GmEXP1 ở đậu tƣơng 22 1.2 Sơ đồ về gen và protein EXP1 ở cây đậu tƣơng 22 1.3 Trình tự amino acid vùng bảo thủ DPBB của protein EXP1 23 1.4 Trình tự amino acid vùng bảo thủ DPBB của protein EXP1 23 1.5 Trình tự amino acid của vùng Pollen allerg của protein EXP1 24 1.6 Mô hình cấu trúc không gian vùng Pollen allerg của protein EXP1 24 2.1 Hạt của các giống đậu tƣơng nghiên cứu 26 2.2 Sơ đồ vector pBT 33 3.1 Hình ảnh các giống đậu tƣơng giai đoạn 3 lá trƣớc hạn 38 3.2 Hình ảnh rễ của ba giống đậu tƣơng nghiên cứu sau 7 hạn 38 3.3 Đồ thị hình rada biểu diễn khả năng chịu hạn cuả ba giống đậu tƣơng nghiên cứu 43 3.4 Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ lá non đậu tƣơng 43 3.5 Hình ảnh điện di kết quả nhân gen Gm EXP1 44 3.6 Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biế n E.coli chủ ng DH5α chƣ́ a vector tá i tổ hợ p mang gen GmEXP1 45 3.7 Plasmid mang gen GmEXP1 46 3.8 Trình tự gen GmEXP1 phân lập từ giống đậu tƣơng XLS 48 3.9 So sánh trình tự nucleotide vùng mã hóa của gen GmEXP1 phân lập từ giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn với trình tự nucleotide mã số AF516879 công bố trên NCBI 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ix 3.10 So sánh trình tự amino acid của protein EXP1 do gen GmEXP1 mã hoá phân lập từ giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn với trình tự amino acid của protein EXP1 do gen có mã số AF516879 công bố trên NCBI 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1.1. Lý do chọn đề tài Cây đậu tƣơng hay đỗ tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là một loại cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế và hàm lƣợng dinh dƣỡng cao. Hạt đậu tƣơng giàu hàm lƣợng protein (từ 32% - 52% ) và chứa nhiều amino acid không thay thế ( lysin, triptophan,metionin, cystein, leucin ), 12% -25% lipit và các vitamin ( B1, B2, C, D, E, K ) cần thiết cho cơ thể ngƣời và động vật. một đặc tính quan trọng nữa của đậu tƣơng là có nốt sần ở rễ tạo khả năng cố định nitơ trong không khí vì vậy trồng đậu tƣơng còn góp phần cải tạo đất và bảo vệ môi trƣờng [5]. Cây đậu tƣơng là loại cây trồng có tầm quan trọng thứ ba trong nhóm cây lấy hạt ở Việt Nam sau lúa và ngô. Sản lƣợng đậu tƣơng trên thế giới đạt hàng trăm triệu tấn /năm. Trong khi đó ở Việt Nam chỉ đạt vài trăm nghìn tấn /năm, điều này cho thấy tình hình sản xuất đậu tƣơng ở nƣớc ta so với khu vực vẫn còn ở mức thấp. Một trong những nguyên nhân là do hạn hán đã ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây đậu tƣơng. Đậu tƣơng là cây tƣơng đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Biến đổi khí hậu, hạn hán xảy ra liên tục và kéo dài, cho nên công tác tuyển chọn giống đậu tƣơng có kiểu gen chịu hạn ngày càng đƣợc quan tâm nghiên cứu [6], [13], [14]. Hai cơ chế chính liên quan đến khả năng chiụ hạn của cây đậu tƣơng, đó là sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu và sự phát triển bộ rễ. Khả năng thu nhận nƣớc của cây phụ thuộc chủ yếu vào bộ rễ. Để tránh mất nƣớc những cây chịu hạn thƣờng có bộ rễ khoẻ, dài, mập có sức xuyên sâu sẽ hút đƣợc nƣớc ở những nơi sâu trong đất hoặc rễ lan rộng với số lƣợng lớn. Thực vật nói chung [...]... biệt về sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tƣơng nghiên cứu Phân tích đặc điểm của trình tự gen liên quan đến khả năng kéo dài của rễ phân lập từ cây đậu tƣơng 1.3 Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng thông qua sự phát triển của bộ rễ; - Khuếch đại gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài của rễ ở cây đậu tƣơng bằng kỹ thuật PCR từ DNA hệ gen; -.. .và cây đậu tƣơng nói riêng khi ở giai đoạn cây non thƣờng chịu tác động mạnh của hạn vì bộ rễ phát triển chƣa đầy đủ và còn yếu [5], [6], [13], [14] Xuất phát từ lí do trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: So sánh sự phát triển bộ rễ và phân lập gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài rễ của cây đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill)” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc sự. .. tự cis riêng biệt và promotor trên mỗi gen chức năng chứa một hay nhiều nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã [9] 1.3.2 Gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tƣơng Khả năng nhận nƣớc của cây phụ thuộc vào bộ rễ Nhiều nghiên cứu cho thấy cây nào có bộ rễ dài, khoẻ, mập thì có khả năng hút nƣớc ở những tầng đất sâu, vì vậy cây nào có bộ rễ dài, ăn sâu xuống các tầng đất sẽ có khả năng lấy đƣợc nhiều... và sự phát triển bộ rễ của cây đậu tƣơng Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nƣớc cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật Ở cây đậu tƣơng sự thích nghi với các điều kiện hạn hán chủ yếu thông qua sự phát triển của rễ cọc để có thể tiếp tục tìm kiếm nguồn nƣớc từ các lớp đất sâu Bên cạnh đó sự phát triển hệ thống rễ con cũng giúp cho cây. .. Tách dòng và xác định trình tự gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài của rễ ở cây đậu tƣơng; - So sánh trình tự gen GmEXP1 của giống đậu tƣơng nghiên cứu với trình tự gen đã công bố Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và vị trí cây đậu tƣơng Cây đậu tƣơng hay đậu nành (Glycine max L... các gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tƣơng đã phát hiện một số gen và nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tƣơng nhƣ: gen cystatin, gen chaperonin, protein LEA, gen P5CS Theo các nhà khoa học, tính chống chịu của đậu tƣơng nói riêng và tính chống chịu của thực vật nói chung rất phức tạp liên quan đến đặc điểm sinh lý, hoá sinh và do nhiều gen quy định Đã có nhiều cơ chế phân tử liên quan. .. cứu về gen GmEXP1 đã gợi ý rằng sự biểu hiện của gen GmEXP1 xảy ra trong thời gian và không gian xác định của quá trình phát triển của rễ cây đậu tƣơng Hiện nay, vai trò của expansin trong quá trình phát triển rễ của cây đậu tƣơng vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ mặc dù đã có nhiều nỗ lực nghiên cứu Tuy nhiên, hƣớng tiếp cận nghiên cứu chức năng của họ gen expansin trong quá trình phát triển của rễ là sự tham... khi phân tích RNA bằng Northern blot cho thấy rằng gen GmEXP1 đƣợc biểu hiện mạnh ở rễ, đặc biệt khi quá trình hình thành các rễ chính và rễ phụ Hơn nữa, ở mầm 5 ngày tuổi, sự tăng trƣởng của rễ chính giảm và các rễ phụ lai đƣợc phát triển mạnh Những kết quả nghiên cứu cho rằng gen GmEXP1 có liên quan đến sự kéo dài rễ cây đậu tƣơng Phân tử mRNA của gen GmEXP1 thƣờng đƣợc các Số hóa bởi Trung tâm Học... (EXP) liên quan đến việc kéo dài rễ của cây đậu tƣơng Expansin là một họ protein tác động trong việc mở rộng của thành tế bào thực vật và đƣợc coi là một protein chủ yếu ảnh hƣởng đến sự mở rộng của tế bào thực vật Mức độ biểu hiện của gen GmEXP1 rất mạnh trong khoảng thời gian hạt nảy mầm từ 1 ngày đến 5 ngày tuổi và giai đoạn kéo dài rễ diễn ra rất nhanh Biểu hiện của gen GmEXP1 làm tăng sự phát triển. .. Việt Nam đã có một số công trình phân lập các gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng Nghiên cứu phân lập và đọc trình tự gen chaperonin từ giống đậu tƣơng chịu lạnh Bonmironi - Nhật bản với kích thƣớc phân tử 1,6kb của Nông Văn Hải và đtg (1997) Nghiên cứu của Trần Thị Phƣơng Liên (1999) đã phân lập và đọc trình tự gen chaperonin ở tế bào chất của giống đậu tƣơng đột biến M103 với kích . tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: So sánh sự phát triển bộ rễ và phân lập gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài rễ của cây đậu tƣơng (Glycine max (L. ) Merrill)”. 1.2. Mục. PHẠM BÙI NGỌC BÍCH SO SÁNH SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ VÀ PHÂN LẬP GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KÉO DÀI RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L. ) Merrill Chuyên ngành: Di truyền. Xác định đƣợc sự khác biệt về sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tƣơng nghiên cứu. Phân tích đặc điểm của trình tự gen liên quan đến khả năng kéo dài của rễ phân lập từ cây đậu tƣơng. 1.3.