TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI BAN ðÀO TẠO SAU ðẠI HỌC          TRƯƠNG THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME α - AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN Bacillus subtilis . LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 60.42.02.01 Giảng viên hướng dẫn : 1. PGS.TS. LƯƠNG ðỨC PHẨM 2. TS. NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI - 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Trương Thị Nguyệt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô cùng toàn thể cán bộ bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ vi sinh – khoa Công nghệ Sinh học – Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô trường Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến thầy giáo PGS.TS. Lương ðức Phẩm và TS. Nguyễn Văn Giang ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn tới cùng các thầy cô trong bộ môn, các bạn sinh viên, gia ñình và bạn bè ñã tạo rất nhiều ñiều kiện ñể tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Mặc dù tôi ñã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận ñược những ñóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn. Hà Nội, Ngày 24 tháng 06 năm 2013 Học viên Trương Thị Nguyệt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Danh mục biểu ñồ x 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2. Nội dung ñề tài 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2.1.1 ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus 3 2.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 4 2.1.3 Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên 8 2.2 Enzyme α - amylase 10 2.2.1 Cấu tạo α - amylase 10 2.2.2 Tính chất 11 2.2.3 Cơ chế xúc tác 12 2.2.4 Nguồn thu nhận enzyme α - amylase 14 2.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh tổng hợp α - amylase của vi sinh vật 16 2.2.6 Tách và làm sạch enzyme 18 2.2.7 Ứng dụng enzyme α - amylase 18 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu 21 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 3.1.1 ðối tượng 21 3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 21 3.1.3 Hóa chất 21 3.2 Các môi trường ñược sử dụng 21 3.2.1 Môi trường phân lập và nuôi Bacillus 21 3.2.2 Môi trường cảm ứng sinh tổng hợp amylase của Bacillus 22 3.2.3 Môi trường thử hoạt tính amylase 22 3.3 Các phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Phương pháp phân lập các chủng Bacillus từ ñất vườn qua trung gian cỏ khô 22 3.3.2 Phương pháp giữ giống cấy chuyền 22 3.3.3 Phương pháp nuôi cấy bề sâu 23 3.3.4 Một số phương pháp nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học của Bacillus 23 3.3.5 Thử các phản ứng sinh hoá 26 3.3.6 Phương pháp ñếm khuẩn lạc 29 3.3.7 Phương pháp ño ñộ ñục 29 3.3.8 Phương pháp xác ñịnh sự sinh trưởng của vi khuẩn theo mật ñộ quang 30 3.3.9 Phương pháp nghiên cứu khả năng phân hủy tinh bột. 30 3.3.10 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase theo Heinkel, 1956 31 3.3.11 Phương pháp nghiên cứu xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy tối ưu 33 3.3.12 Phương pháp nhiên cứu ñộng học 34 3.3.13 Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy 35 3.3.14 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme amylase từ dịch chiết enzyme thô bằng các tác nhân kết tủa 35 3.3.15 Xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase của chế phẩm enzyme thu ñược từ các tác nhân tủa 37 3.3.16 Xác ñịnh ñộ bền α - amylase thủy phân nguyên liệu nếp trắng. 37 3.3.17 Xác ñịnh ñường khử theo phương pháp acid initrosalicylic(DNS) 39 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 4.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng trực khuẩn có hoạt tính amylase cao 41 4.2 Xác ñịnh sự sinh trưởng và hoạt ñộ α - amylase của 3 chủng LB ñã chọn 46 4.2.1 Xác ñịnh sự sinh trưởng của 3 chủng LB 46 4.2.2 Xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase của 3 chủng LB 47 4.3 Một số ñặc ñiểm sinh học của chủng LB3 47 4.3.1 ðặc ñiểm hình thái tế bào chủng LB3 47 4.3.3 Khả năng hình thành bào tử của chủng LB3 48 4.3.4 Nghiên cứu khả năng sinh enzyme catalase 49 4.4 Khảo sát các ñặc ñiểm sinh hóa của vi khuẩn LB3 50 4.5 Nghiên cứu các ñiều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp α – amylase của chủng B. subtilis LB3. 51 4.5.1 Loại cơ chất 51 4.5.2 Ảnh hưởng nồng ñộ tinh bột tan. 53 4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ. 53 4.4.4 Ảnh hưởng của pH ban ñầu 54 4.4.6 Ảnh hưởng của các loại muối. 55 4.4.7 Nồng ñộ NaCl cao nhất ức chế sinh trưởng. 56 4.5 Nghiên cứu ñộng học của quá trình lên men trong bình tam giác 1 lít. 58 4.6 Tách enzyme từ dịch nuôi cấy, xác ñịnh hoạt ñộ và ñộ bền của enzyme. 59 4.6.1 Tách enzyme từ dịch nuôi cấy với các tác nhân tủa khác nhau. 59 4.6.2 Hoạt ñộ α – amylase của CPE amylase thu ñược bởi các tác nhân kết tủa. 59 4.6.3 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối thích của α - amylase 60 4.6.4 Xác ñịnh pH tối thích của α - amylase 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi 4.7 Thử nghiệm khả năng thủy phân enzyme α – amylase trên nguyên liệu gạo nếp trắng. 62 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 5.1 Kết luận 64 5.2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT B. : Bacillus CPE : Chế phẩm enzyme OD : Giá trị mật ñộ quang dOD : Hiệu số giá trị mật ñộ quang v/p : Vòng/phút Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis 6 2.2 ðộ bền nhiệt của - amylase từ các nguồn khác nhau 12 3.1 ðặc ñiểm hình thái khuẩn lạc các chủng phân lập 41 3.2 ðặc ñiểm tế bào của khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường 44 3.3 ðường kính vòng phân giải tinh bột của 3 chủng LB 45 3.4 So sánh hoạt ñộ α - amylase của 3 chủng LB 47 3.3 Tóm tắt một số ñặc ñiểm của chủng LB3 49 3.4 Các phản ứng sinh hoá của LB3 50 3.5 Sự sinh trưởng của chủng LB3 trên các loại cơ chất 51 3.6 Nồng ñộ tinh bột tan ảnh hưởng ñến hoạt ñộ α - amylase 53 3.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ muối NaCl ñến hoạt ñộ α - amylase 56 3.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ muối CaCl 2 ñến hoạt ñộ α - amylase 58 3.9 Hiệu suất thu nhận CPE α - amylase từ các tác nhân tủa 59 3.10 Hoạt ñộ α – amylase thu ñược bởi các tác nhân kết tủa 60 3.11 Nhiệt ñộ tối thích của CPE α - amylase 60 3.12 pH tối thích của CPE α - amylase 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Tế bào Bacillus subtilis 5 2.2 Cấu trúc không gian của α - amylase. 11 2.3 Vị trí cắt của α - amylase trên phân tử tinh bột 14 4.1 Vòng phân giải tinh bột của 3 chủng LB3, LB4, LB8 47 4.2 Hình thái tế bào chủng LB3 48 4.3 Bào tử của chủng LB3 48 4.4 Hình ảnh thử catalase của chủng LB3 49 4.5 Một số phản ứng sinh hóa của chủng LB3 51 [...]... sinh trư ng, sinh t ng h p enzyme α - amylase c a các ch ng tuy n ch n 3 Nghiên c u m t s ñ c ñi m sinh h c c a ch ng tuy n ch n 4 Nghiên c u m t s ñ c ñi m sinh hóa c a ch ng tuy n ch n 5 Kh o sát các ñi u ki n nuôi c y t i ưu ñ thu ñư c d ch enzyme α - amylase có ho t ñ cao 5 Tách chi t enzyme α – amylase t d ch lên men, nghiên c u ñ nhi t ñ và pH t i thích c a enzyme α – amylase 6 Th nghi m kh năng... dùng nhi t ñ cao, ho c nư c ta ða s các ch ph m enzyme thương m i thu c nhóm α - amylase ñ u có tính ch u nhi t cao B ng 1: ð b n nhi t c a α - amylase t các ngu n khác nhau STT 1 2 3 4 Enzym Ngu n α - amylase vi Bacillus subtilis khu n α - amylase vi Bac licheniformic khu n ch u nhi t α - amylase n m Aspergillus orizae s i Aspergillus niger Dich malt α - amylase malt B t Malt Kho ng pH t i thích 4,5... ñã công b vi c s n xu t α - amylase b i B licheniform B subtilis là loài có ti m năng l n v các enzyme ngo i bào Nhi u trong s các enzyme ngo i bào này là nh ng enzyme th y phân các phân t h u cơ l n như amylase, protease Ngu n enzyme α - amylase s d ng trong nư c ta hi n nay ch y u nh p kh u c a hãng NOVO ðan M ch V n ñ thu nh n và tinh s ch enzyme α - amylase t các loài B subtilis chưa ñư c quan... th ng d ng enzyme α - amylase sinh t ng h p b i loài này s làm gi m ñáng k chi phí s n xu t Xu t phát t th c t ñó chúng tôi ñã ti n hành nghiên c u ñ tài "Nghiên Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 1 c u thu nh n enzyme α - amylase t Bacillus subtilis 1.2 N i dung ñ tài 1 Phân l p và tuy n ch n các ch ng vi khu n Bacillus t ñ t có ho t tính amylase m nh... dung enzyme α – amylase phá h y nhanh lư ng tinh b t th a Ngư i ta ñưa nhi t ñ ñ n nhi t ñ sôi sau ñó làm gi m xu ng 50°C hay 60°C và cho enzyme α - amylase vào 2.2.7.5 ng d ng trong s n xu t ch t t y r a: Enzyme α - amylase c a vi khu n là m t trong nh ng enzyme thư ng ñư c ng d ng trong công nghi p s n xu t ch t t y r a, do enzyme này có kh năng ch u nhi t cao (kho ng 90°C), pH cao (pH = 8) Enzyme α. .. c Nông nghi p ……………………… 11 c u thành phân t enzyme • α - amylase c a n m m c có kh năng dextrin hóa (d ch hóa) cao l i v a t o ra m t lư ng l n glucose và maltose Amylase c a vi khu n l i có hai lo i amylase d ch hóa và amylase ñư ng hóa • Nhi t ñ ho t ñ ng c a α - amylase t các ngu n khác nhau là khác nhau α - amylase c a vi khu n thư ng b n nhi t hơn α - amylase t các loài vi sinh v t khác và cây... y nên nhu c u ch ph m enzyme này hi n nay r t l n (ð ng Th Thanh Thu, 2004) Amylase có th ñư c thu nh n t nhi u ngu n khác nhau như vi khu n, n m m c, th c v t và ñ ng v t Tuy nhiên, các ch ph m α - amylase thương m i ñư c ng d ng nhi u trong công nghi p ch y u ñư c s n xu t t Bacillus sp ðã có nhi u nhà khoa h c trên th gi i t p trung nghiên c u thu nh n ch ph m α - amylase t Bacillus sp Dharani Aiyer... aslersporus nh , màu tr ng hay màu l c nh t, ph ng, m m, nhày, ñ ng nh t 2.2 Enzyme α - amylase 2.2.1 C u t o α - amylase Enzyme α - amylase là enzyme th y phân tinh b t ñư c ng d ng khá r ng rãi trong công nghi p, y h c và các lĩnh v c khác ñ ng th i nó cũng là m t trong nh ng enzyme ñ u tiên ñư c nghiên c u M ñ u là công trình nghiên c u c a Kirchoff, vi n sĩ Saint Petercburg (1814) ch ng minh nư c chi... ít nh hư ng ñ n ho t tính enzyme, d tách dung môi kh i enzyme b ng cách s y nh Có th thu h i dung môi b ng chưng c t Phương pháp ph bi n th hai ñ tách enzyme là dùng mu i trung tính ñ k t t a Mu i trung tính thư ng dùng là (NH4)2SO4 v i t l 50 – 60 % so v i d ch chi t enzyme (Lương ð c Ph m, 2010) 2.2.7 ng d ng enzyme α - amylase Hi n nay, vi c s n xu t ch ph m enzyme α - amylase các lo i ñã và ñang... trong nhi u gi 2.2.4 Ngu n thu nh n enzyme α - amylase Ngư i ta ñã bi t nhi u lo i vi sinh v t có kh năng t ng h p α - amylase, trong ñó ñư c s d ng nhi u hơn c là n m s i, gi n m men và vi khu n, còn x khu n thì ít hơn (Lương ð c Ph m; 2010) • Các gi ng n m s i thư ng ñư c dung ñ thu α - amylase là aspergillus, rhizopus • Nhi u ch ng vi khu n cũng có kh năng t o lư ng l n α - amylase Trư ng ð i h c Nông . ðẠI HỌC          TRƯƠNG THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME α - AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN Bacillus subtilis . LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành. LIỆU 3 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2.1.1 ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus 3 2.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 4 2.1.3 Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên 8 2.2 Enzyme α - amylase. pháp nghiên cứu xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy tối ưu 33 3.3.12 Phương pháp nhiên cứu ñộng học 34 3.3.13 Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy 35 3.3.14 Phương pháp thu nhận