BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO MÔN HỌC Kiểm Nghiệm Vi Sinh Thực phẩm Khoa: Công nghệ Thực Phẩm Lớp: DH07VT Nhóm thực hiện:1. Nguyễn Thị Ngọc Mai _ MSSV: 071560 2. Nguyễn Thị Thảo_ MSSV: 07156038 Mục lục: 1. Giới tiệu về Bacillus cereus: Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, theo phân loại quốc tế thuộc giới Bacteria, ngành: firmicutes, lớp: Bacilli, bộ: Bacillales, họ: Bacillaceaem, chi: Bacillus, loài: Cereus.Trong chi Bacillus này ngoài loài cereus còn có một số loài như: Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus thuringiensis, Bacillus natto, Paenibacillus larvae . Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều. 1.1. Đặc điểm Bacillus cereus: Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5–1,5 x 2-4 µ. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động. Hình 1: Hình ảnh Bacillus cereus trên kính hiển vi Hình 2: Hình ảnh Bacillus cereus trên môi trường BA 1.2. Đặc điểm nuôi cấy: • Là loại vi khuẩn dễ mọc. • Hiếu khí và kị khí tùy nghi. • Nhiệt độ 5-50 o C, tối ưu 35-40 o C. • pH 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2 trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì. • Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng. • Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh có vòng sáng. • Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng. • Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn 1.3. Tính chất sinh hóa: • Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên men mannitol. • Khử nitrat thành nitrit. • Phản ứng VP (+) • Phân giải Tyroxin • Catalase (+), Citrate (+) • Mọc trên NB + 0,001% lyzozym 1.4. Tính chất gây bệnh- Độc tố-Triệu chứng: Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm. Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố • Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng. • Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày. Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn. Triệu chứng trúng độc: • Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc. Biểu hiện đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn. Bệnh có thể kéo dài 24 giờ. Trường hợp nhiễm type 1 có triệu chứng đau bụng tiêu chảy nhưng không sốt. Bắt đầu sau 4-16 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn và kéo dài 12-24 giờ. Phòng: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn hâm nóng trên 80 o C trước khi ăn So sánh độc tố type 1 và type 2: 2.Đặc tính 3. Type 1 4. Type 2 5. Bền với nhiệt 6. 45 o C/30 phút 7. 120 o C/90 phút 8. pH 9. ổn định pH 4-11 10. ổn định pH 2-11 11. Tính nhạy 12. Nhạy với enzym protease và trysin 13. Kháng pepsin và trypsin 1. Cơ chế sản sinh độc tố Bacillus cereus: 1.1Giới thiệu chung về độ tố của B.cereus Vì ngộ độc thực phẩm do B.cereus không phải là loại bệnh được nói đến nhiều, sự thật là phạm vi ảnh hưởng của loại bệnh này ít được biết đến, được báo cáo là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và chiếm khoảng 33% trong tổng số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm (đa số các nguyên nhân là do vi rút) ở Norway (1988-1993), 47% ở Iceland (1985-1992). Tỷ lệ thấp hơn nhiều được báo cáo ở các quốc gia khác bao gồm U.S (1.3%) và Canada (2.2%). Ở Anh và xứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995. Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau, thêm vào đó, những ngộ độc khác doB.cer eus gây ra là sự nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng mắt. Hai loại ngộ độc thực phẩm là nguyên nhân bởi rất nhiều nhấn tố gây độc hại khác nhau. Bệnh nôn mửa được mô tả với thời kỳ ủ bệnh ngắn (1-5h), nguyên nhân gây ra ngộ độc này là do chuỗi polypeptide nhỏ (cereulide) đã hình thành trước ở trong thực phẩm (ví dụ như Gạo). Triệu chứng bao gồm sự buồn nôn, sự nôn mửa ra và đau dạ dày (bảng 1-1). Bệnh tiêu chảy được mô tả với thời kỳ ủ bệnh từ 8 – 16h, triệu chứng bao gồm đau bụng, đi tiêu ra nhiều nước và đau thắt trực tràng (bảng 1-2). Nguyên nhân của triệu chứng này là do sự sản sinh ra độc tố đường ruột trong thời kỳ sinh trưởng củaB.cer eus trong ruột non từ việc ăn vào bụng các tế bào hay bào tử của vi khuẩn. Thông thường cả hai triệu chứng này là tương đối nhẹ, kéo dài ít nhất là 24h và không phải luôn luôn đòi hỏi phải dùng thuốc. Tuy nhiên, nhiều trường hợp ngộ độc gây tiêu chảy có thể xảy ra, nguyên nhân có lẻ là do các tế bào biểu mô chiếm đa số trong ruột non khi các bào tử củaB.cer eus sinh sôi nảy nở và sản sinh ra độc tố đường ruột. Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B. Cereus Tính chất/ Hoạt động Mô tả Liều nhiễm độc Số lượng B.cereus: 105 - 108 tb/g thực phẩm Khối lượng độc tố: 12 - 32 μg/kg Độc tố được sản sinh ra Trong thực phẩm (25 - 30oC) Thời kỳ ủ bệnh ½ đến 5h Khoảng thời gian mang bệnh 6 - 24h Triệu chứng Buồn nôn, nôn mửa Loại thực phẩm thường gặp nhất Cơm nấu chin / chiên, mì ống, phở Tên của độc tố Cereulide Cấu trúc của độc tố Chuỗi polypeptide [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] Khối lượng phân tử 1.2 kDa Sinh kháng thể Không (none) Hoạt động sinh học trên người Gây nôn Cơ quan nhận cảm 5-HT3 Cytotoxic No Hoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bào Khả năng chịu nhiệt 90 phút ở 121oC Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không Việc sản sinh ra độc tố như thế nào Chưa biết, nhưng có thể liên quan đến enzyme 2.2. Cơ chế gây bệnh 2.2.1 Triệu chứng nôn mửa Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của độc tố gây nôn mửa đã được thể hiện ở bảng 1-1. Sự giải thích về cấu trúc của độc tố emetic đã đưa đến những hiểu biết sâu sắc hơn về triệu chứng này. Độc tố emetic có tên là cereulide và là một chuỗi polypeptide ba lần lặp lại của bốn amino và/hoặc oxy-acid (bảng 1-1) Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng nôn mửa do Bacillus cereus sản sinh ra. Bài báo này giải quyết được nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp độc tố này dựa trên sự bất thường của độc tố depsipeptide từ Cacbon số 13 (13C) liệt kê ra trên 3 loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) trên môi trường tổng hợp trung gian. Sự phân tích này được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino hay oxy acid qua NMR và ESI – MS của phương pháp kính quang phổ trên cereulide và sản phẩm thủy phân là các dipeptide của nó. Sự hợp nhất của nguyên tử cacbon số 13 (13C) là chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu và L-Val, trong khi đó chỉ có 40%13C là kết hợp trong D-Ala của Cereulide. Bacillus cereus được biết là nguyên nhân gây ra hai loại ngộ độc thực phẩm, đó là triệu chứng nôn mửa và triệu chứng tiêu chảy. Phần lớn những ngộ độc do Bacillus cereus gây ra chỉ mới phát hiện sau này. 2.1.1 Triệu chứng tiêu chảy Triệu chứng tiêu chảy do ít nhất hai loại độc tố đường ruột sản sinh ra trong suốt quá trình sinh trưởng của B.cereus trong ruột non. Sự hình thành độc tố đường ruột đầy đủ trong thực phẩm để dẫn đến ngộ độc thực phẩm về lý thuyết mà nói là có thể, nhưng đối với thực phẩm phục vụ cho con người thì đây là điều không thể chấp nhận. Điều này xảy ra khi, số lượng B.cereus tồn tại trong thực phẩm thấp nhất là 106/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường ruột phải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và enzyme proteolytic của tá tràng. Những nhân tố này sẽ làm giảm một cách nhanh chóng hoạt động của độc tố đường ruột thấp ơn 1% sơ với mức độ ban đầu. Thời gian tương đối dài giữa việc ăn vào những sinh vật này với việc xuất hiện những triệu chứng của bệnh. Đặc điểm của triệu chứng tiêu chảy được thể hiện trong bảng 1-3. Mức độ biến đổi của liều lây nhiễm có lẽ do khả năng sản sinh ra các độc tố đường ruột khác nhau và do tính nhạy cảm của mỗi cá nhân là khác nhau. Bảng 1-2 Đặc điểm bệnh tiêu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B. cereus Đặc tính Liều gây nhiễm Thông thường là 105/g hoặc /ml Độc tố được sản sinh ra Trong ruột non Loại độc tố Protein Thời kỳ ủ bệnh 8 – 16h Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24h Triệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi tiêu nhiều nước, thỉnh thoảng buồn nôn Bào tử của B. cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là được phân biệt để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế bào biểu mô của người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B. cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng. Một điều có thể xảy ra đối với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn như đã quan sát. Số lượng và loại độc tố liên quan đến triệu chứng tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm từ B. cereus là đề tài tranh cải từ nhiều năm qua và cho đến nay vẫn còn đang tranh luận. Cả dạng đơn và dạng phức của độc tố đường ruột được xác định là nguyê nhân gây ra bệnh tiêu chảy. Có hai sự khác biệt trong ba hợp phần của độc tố đường ruột được sản sinh bởi các thực phẩm nhiễm B. cereus, một số nhóm cũng được mô tả độc tố đường ruột một hợp phần với các phân tử trọng lượng khoảng từ 40 – 100 kDa. Một số hiểu biết hiện tại về độc tố đường ruột của B. cereus được thể hiện ở bảng 1-3 Bảng 1-3 Properties of Enterotoxin Isolated from Bacillus cereus Enterotoxin/Reference Molecular Weight Biogogical Test Used DNA Sequenced Once main Pro 50 kDa Positive on: rabit loop tests No and two other pro vascular permeability tests component and mouse lethality Three component 38.0 kDa Positive on: rabit loop tests, No 39.5 kDa vascular permeability tests, 43 kDa and Vero call test One component 45 kDa Positive on: rabit loop tests No vascular permeability tests, and mouse lethality tests One toxin component 40 kDa Positive on: Vero cell test No and one non-toxin 48 kDa and Ca-co2 (human intestinal component epithelial cells) cell tests One component 41 kDa Positive on: mouse loop tests, Yes vascular permeability tests and mouse lethality tests Những nghiên cứu gần đây về độc tố đường ruột đã khẳng định rằng cả độc tố chỉ có một hợp phần và độc tố nhiều hợp phần đều có liên quan. Những nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp giúp thiết lập nên các giải pháp ngăn ngừa các độc tố sinh ra từ B.cereus trong tương lai gần. Hoặc có thể đưa ra các phương pháp giúp phát hiện ra độc tố cereulide trong tự nhiên bất cứ lúc nào. 3.Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm Để kiểm soát Bacillus cereus thì có nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào thời gian cho kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính là phương pháp truyền thống và phương pháp phân tích nhanh. 3.1. Các phương pháp truyền thống: Đặc điểm và nguyên tắc: Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật trên các môi trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các loài vi sinh vật khác nhau. Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này còn một số hạn chế như độ nhạy không cao, tốn nhiều nhân công và thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa. Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây bệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng, B.mycoides, B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa. Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0.001% lysozyme, được trình bày trong bảng sau: Đặc tính Loài B.cereus B.thuringiensis B.mycoides B.anthracis B.megaterium Gram + (a) + + + + Catalase + + + + + Di động +/- (b) +/- _ (c) _ +/- Khử nitrate + + + + _ (d) Phân hủy Tyrosine + + +/- _ (d) +/- Kháng lysozyme + + + + _ Phản ứng với lòng đỏ trứng + + + + _ Lên men glucose + + + + _ Phản ứng VP + + + + _ Sinh acid từ manitol _ _ _ _ + Tan máu + + + _ (d) _ Các đặc tính của Bacillus nhóm I a + :90 - 100% các chủng dương tính ; b +/- : 50% các chủng dương tính; c - : 90 – 100% : các chủng âm tính;d - : Hầu hết các chủng âm tính. Do có hình thái đặc trưng trên các môi trường thạch chọn lọc như : Mannitol-Egg Yolk- Polymycin (MYP), Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA), nên B.cereus còn được phát hiện và định lượng bằng môi trường này. Ngoài ra B.cereus cũng được định lượng bằng phương pháp MPN. Qui trình phân tích: 25g mẫu + 225ml môi trường pepton đệm (BPW) -> đồng nhất bằng Stomacher/1 phút để có độ pha loãng 10-1 -> pha loãng thành dãy thập phân để có các độ pha loãng thích hợp. Định lượng B.cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: Phát hiện bằng môi trường chọn lọc: Trải 0.1ml mỗi độ pha loãng lên các môi trường thạch rồi ủ 24h ở 30oC: MYP: do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạo thành MOSSE: khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng. Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiên chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định B.cereus. Các phản ứng khẳng định: Nhuộm Gram: [...]... vực y học, dược học hay thực phẩm dựa trên liên kết kháng thể và kháng nguyên như: chuẩn đoán bệnh ung thư, HIV, các bệnh do vi sinh vật khác hay trong xét nghiệm nhanh sự nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là độ nhạy cao, phát hiện được liên kết kháng thể-kháng nguyên ở mức độ nhất nhỏ, thời gian cho kết quả nhanh hơn các phương pháp xét nghiệm hóa sinh, vi sinh truyền... Tecra, A.Tan thuộc vi n công nghệ ứng dụng vi sinh đã xét nghiệm trên các mẫu thực phẩm và bệnh phẩm có độc tố BDE của loài Bacillus cereus Ưu điểm của Kit Tecra® Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immuno Assay là phát hiện độc tố BDE nhanh chỉ sau 4 giờ với độ nhạy cao nhỏ nước vơ trùng lên kính hiển vi, đặt sinh khối vi khuẩn vào -> quan sát dưới kính hiển vi để kiểm tra sự di động Hầu hết các chủng B ,cereus, B.thuringiensis là di động; B.anthracis và B.mycoides khơng di động Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ lên giữa đĩa Nutrient agar -> ủ ở 30oC/48-72h -> kiểm tra sự phát triển của rễ giả (B .cereus khơng tạo cấu trúc rễ giả, thường... Broth chứa 0.001% lysozyme, thực hiện tương tự với mơi trường khơng chứa lysozyme -> ủ ở 35oC/24h -> kiểm tra sự tăng trưởng trong mơi trường chứa và khơng chứa lysozyme -> những ống có kết quả âm tính ủ thêm 24h -> kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay khơng Dựa vào bảng để khẳng định dòng đã chọn là B .cereus hay khơng Các thử nghiệm phân biệt các lồi trong Bacillus nhóm I: Thử nghiệm tính di động: •... vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh dưỡng vào 0.5ml BPW vơ trùng Tạo huyền phù hóa dịch cho các phản ứng sinh hóa phía sau Thử nghiệm lên men glucose: Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth -> ủ ở 35oC/ 24h, kị khí -> lắc mạnh ống nghiệm -> quan sát độ đục ( sự phát triển); sự chuyển màu mơi trường từ đỏ sang vàng ( chứng tỏ có sự sinh acid glucose trong . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO MÔN HỌC Kiểm Nghiệm Vi Sinh Thực phẩm Khoa: Công nghệ Thực Phẩm Lớp: DH07VT Nhóm thực hiện:1. Nguyễn Thị Ngọc Mai. học, dược học hay thực phẩm dựa trên liên kết kháng thể và kháng nguyên như: chuẩn đoán bệnh ung thư, HIV, các bệnh do vi sinh vật khác hay trong xét nghiệm nhanh sự nhiễm vi sinh vật trong thực. triển của vi khuẩn. Triệu chứng trúng độc: • Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc. Biểu hiện đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn.