ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BẾ BÍCH ĐÀO ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ SO SÁNH GEN DREB5 CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2011 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BẾ BÍCH ĐÀO ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ SO SÁNH GEN DREB5 CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU THÁI NGUYÊN - 2011 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill), là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Hạt đậu tương chứa 30% - 56% protein, chứa 12% - 25% lipid, chứa 36% - 40% hydrat cacbon và các loại amino acid cần thiết cho cơ thể con người như: cystein, lysine, triptophan, leucine, methyonine…. Ngoài ra trong đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K…) cần thiết cho cơ thể người và động vật. Một đặc tính quan trọng nữa của cây đậu tương là có nốt sần ở rễ tạo khả năng cố định nitơ không khí. Vì vậy, trồng đậu tương góp phần cải tạo đất và bảo vệ môi trường. Trên phương diện hóa sinh, đậu tương là loại hạt được đánh giá đồng thời cả về protein và lipid. Protein của hạt đậu tương có phẩm chất tốt và hoàn toàn có thể thay thế đạm động vật trong bữa ăn hàng ngày của con người. Sử dụng trong y học tránh được hiện tượng suy dinh dưỡng ở trẻ em, cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho động vật còn non rất tốt. Cây đậu tương phân bố từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới, từ độ cao thấp hơn so với mực nước biển đến độ cao gần 2000 m và được phân bố rộng rãi từ 55 vĩ độ Bắc đến 55 vĩ độ Nam, với diện tích đạt khoảng hơn 74,7 triệu ha. Ở Việt Nam cây đậu tương được gieo trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước, trong đó vùng núi phía bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất (46,6%), đồng bằng Sông Hồng (19,3%), vùng Tây Nguyên (11%), miền Đông Nam Bộ (10,2%), đồng bằng Sông Cửu Long (8,9%), khu Bốn (2,3%) và vùng Duyên Hải Miền Trung (1,6%) [2]. Nước ta có hệ sinh thái rất đa dạng, khí hậu giữa các vùng, là không giống nhau, do vậy vấn đề thích ứng của cây trồng với điều kiện ngoại cảnh là một vấn đề có tầm quan trọng quyết định sự phát triển của ngành trồng trọt. Các nghiên cứu trong lĩnh vực nông nghiệp đều cho thấy tổng sản lượng các cây lương thực trên thế giới chỉ đạt 20% tiềm năng di truyền. Nguyên nhân chính cho là do các stress của môi trường tác động lên cây trồng, hạn mất nước, hạn mặn và lạnh đều gây lên sự mất nước nội bào trong mô thực vật [11]. Trước thực trạng đó, công tác chọn, tạo và nhân giống các giống đậu tương có kiểu gen chống chịu ngày càng được quan tâm, trong đó tính chịu hạn được đặc biệt quan tâm trong điều kiện biến đổi khí hậu hiện nay. Các protein DREB là nhân tố tham gia vào quá trình phiên mã của nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương. Protein DREB là nhân tố kích thích các gen cùng hoạt động và không phụ thuộc vào ABA. Hiện nay đã có những nghiên cứu trong các đối tượng như: lúa, khoai tây, cúc, lạc…, còn ở đậu tương nghiên cứu về DREB mới chỉ là bước đầu. Ở đậu tương và thấy rằng phân họ DREB gồm GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7. Mặc dù DREB không trực tiếp tham gia vào quá trình chống chịu hạn nhưng nó là nhân tố kích hoạt đồng thời sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn. Như vậy, có thể nói nghiên cứu DREB là cơ sở để cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương thông qua việc chuyển gen. Với mục đích xác định chỉ thị phân tử liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương trên cơ sở phân lập, so sánh gen DREB5 chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Đánh giá khả năng chịu hạn và so sánh gen DREB5 của một số giống đậu tương địa phương”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được mức độ chịu hạn và sự sai khác về trình tự gen DREB5 của một số giống đậu tương địa phương. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân tích hình thái kích thước hạt, khối lượng 1000 hạt và xác định hàm lượng protein, lipid trong hạt của một số giống đậu tương địa phương; - Đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương trong điều kiện gây hạn nhân tạo. - Khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen DREB5 của một số giống đậu tương địa phương. - So sánh trình tự gen DREB5, trình tự amino acid của protein DREB5 giữa các giống đậu tương khác nhau về khả năng chịu hạn. Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ĐẬU T Ƣ ƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU T Ƣ ƠNG 1.1.1. Cây đậu tƣơng 1.1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây đậu tương Đậu tương có tên khoa học là (Glycine max (L) Merrill ), có bộ nhiễm sắc thể 2n=40, thuộc cây thân thảo, họ Đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidea). Cây đậu tương được thuần hóa ở Trung Quốc và được đưa đến Triều Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Nam Á qua Con đường tơ lụa. Ở Việt Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu vực Trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ [2]. Về hình thái, cây đậu tương có các bộ phận chính là rễ, thân, lá, hoa, quả. Rễ của cây đậu tương là rễ cọc gồm rễ cái và rễ bên, trên rễ của cây đậu tương có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định nitơ trong không khí, cung cấp đạm cho cây, có vai trò cải tạo đất [5]. Thân cây đậu tương có hình tròn, có màu xanh hoặc tím, khi quả chín thì thân ngả sang màu vàng nâu. Lá cây đậu tương gồm 3 loại: Lá mầm, lá đơn và lá kép (có 3 lá chét đôi khi có 4-5 lá chét). Hoa mọc thành chùm ở nách lá, mỗi chùm hoa có từ 10-15 hoa, có màu trắng hoặc tím, hoa đậu tương tự thụ phấn và 1% giao phấn. Quả có thể thẳng hoặc cong có nhiều lông, mỗi quả chứa 1-5 hạt nhưng thông thường là từ 2- 3 hạt. Hạt đậu tương không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ mỏng bao quanh phôi và 2 lá mầm. Hạt có hình tròn, ovan, tròn dài, tròn dẹt, vỏ hạt đậu tương có màu nâu, đen, vàng, xanh. Căn cứ vào thời gian sinh trưởng của cây đậu tương người ta ch ia làm 3 loại: giống chín sớm (75-85) ngày, giống chín trung bình (80-100) ngày, giống chín muộn (110-120) ngày. Thời gian sinh trưởng là một yếu tố quan trọng để lựa chọn cây trồng luân canh tăng vụ [13]. 1.1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tương Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, là loại cây trồng có tác dụng nhiều mặt và hiệu quả kinh tế cao. Về thực phẩm, hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao [2]. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các protein của thực vật, có đầy đủ và cân đ ối các loại amino acid cần thiết. Protein của đậu tương lại dễ tiêu hóa và không có các t hành phần tạo cholesterol. Lipid của đậu tương chứa tỷ lệ lớn các axit béo chưa no, có hệ thống đồng hóa lớn (98%), chỉ số iot cao (121 - 137) có tác dụng phòng chống bệnh bướu cổ cho người, đặc biệt đối với vùng trung du và miền núi. Hạt đậu tương còn chứa nhiều loại muối khoáng và có khả năng cung cấp năng lượng khá lớn (4.710 kcal/ kg), cho nên người ta đã chế biến hạt đậu tương thành hơn 600 sản phẩm khác nhau. M ặt khác, sử dụng protein và lipid đậu tương còn có tác dụng phòng chống bệnh đái tháo đường, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não,… Ngày nay người ta mới biết thêm trong hạt đậu tương có chất lecithin có tác dụng làm cơ thể trẻ lâu, tăng trí nhớ và tái sinh các mô, làm cứng xương, tăng sức đề kháng. Ngoài ra, nó còn chứa nhiều loại vitamin, là vị thuốc để chữa bệnh [12]. Về mặt công nghiệp, những sản phẩm của đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp ép dầu, công nghiệp sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp nguyên liệu từ đậu tương. Về xuất khẩu, đậu tương là mặt hàng nông sản có giá trị ổn định trên thị trường thế giới. Lượng hạt đậu tương xuất khẩu hàng năm là 24-26 triệu tấn hạt/ năm và 2- 4 triệu tấn dầu/ năm. Từ sau đại chiến thế giới thứ nhất, đậu tương giữ vị trí hàng đầu trên thị trường nông sản thế giới [2]. Trong chăn nuôi, đậu tương là nguồn thức ăn rất cần thiết cho gia súc rất tốt, 1 kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn. Trong lĩnh vực trồng trọt, đậu tương có khả năng tích lũy đạm từ nitơ trong tự nhiên để nuôi cây và làm giàu cho đất nhờ cộng sinh của vi khuẩn Rhizobium ở bộ rễ, cùng với thân và lá, các chất hữu cơ này góp phần làm thay đổi tính chất lý hóa và tăng độ phì nhiêu cho đất. Trong hệ thống thâm canh,trồng đậu tương có tác dụng làm cho cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kì sâu bệnh, chống nạn ô nhiễm do lạm dụng bón phân hóa học và thuốc trừ sâu. Cây đậu tương có thể trồng trên nhiều loại đất, nhiều vụ trong năm, có thể xen canh, gối vụ rất thuận lợi. Sự phát triển của nghành sản xuất đậu tương là biện pháp nhằm khai thác lợi thế của vùng khí hậu nhiệt đới. 1.1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới Do khả năng thích ứng khá rộng, cây đậu tương đã được trồng khắp năm châu lục, tập trung nhiều nhất là Châu Mỹ 75,68%, tiếp đến là Châu Á 21,27% và một số nước khác trên thế giới. Cùng với khả năng thích nghi với các đặc điểm điều kiện thời tiết, khí hậu, đất đai, việc ứng dụng tiến bộ công nghệ sinh học từ chọn, tạo giống đến sản xuất làm tăng năng suất đậu tương trong những năm gần đây đã đưa đậu tương trở thành cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây trồng. Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu t ƣ ơng trên thế giới những năm gần đây Năm Diện tích (triệu ha) Sản lƣợng (triệu tấn) Năng suất (tạ/h 2003 83,6 6 227,8 9 27,2 4 2004 91,6 0 224,3 7 24,4 9 2005 92,5 1 231,6 5 25,0 4 2006 95,2 5 229,2 4 24,0 7 2007 90,1 1 243,6 3 27,0 4 2008 96,8 7 238,4 1 24,6 1 (Nguồn: FAOSTAT, 2009) Qua bảng 1.1 cho thấy, trong khoảng thời gian từ năm 2000 đến năm 2008, sản xuất đậu tương trên thế giới đã có những bước tăng đáng kể cả về diện tích, năng suất và sản lượng. Năm 2003, diện tích mới đạt 83,66 triệu ha nhưng đến năm 2008 đã đạt 96,87 triệu ha tăng 15,8%. Hiện nay, đậu tương đã được trồng ở gần 80 nước khác nhau trên khắp các châu lục. Đậu tương là nguồn cung cấp dầu và protein quan trọng, trên thế giới, 4 nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là: Mỹ, Brazil, Achentina và Trung Quốc. Bảng 1.2. Tình hình sản xuất đậu t ƣ ơng của các n ƣ ớc đứng đầu thế giới Quốc gia Năm 2008 Năm 2009 Diện tích (triệu Sản l ƣ ợng (triệu Năng suất (tạ/h Diện tích (triệu Sản l ƣ ợng (triệu Năng suất (tạ/h Mỹ 30,2 26,67 80,53 28,84 28,72 82,83 Brazil 21,27 28,17 59,92 22,89 21,92 50,17 Argentina 16,38 28,22 46,23 14,03 27,28 38,27 Trung Quốc 9,13 17,02 15,54 9,500 17,79 16,90 (Nguồn:United States Department of Agriculture, May 2010) Theo dự báo của Bộ Nông Nghiệp Mỹ (USDA) Tổng sản lượng của niên vụ 2010-2011 sẽ đạt 249,93 triệu tấn giảm 9,27 triệu tấn (-3,6%) so với sản lượng 259,20 triệu tấn niên vụ 2009-2010. Tổng diện tích đậu tương thế giới đạt 101,37 triệu ha, giảm so với 102,12 triệu ha của niên vụ 2009-2010. Năng suất bình quân sẽ đạt 247 tấn/ha so với 2,54 tấn/ ha của niên vụ 2009-2010. Bảng 1.3. Sản lƣợng đậu tƣơng niên vụ 2010 - 2011 của một số nƣớc trên thế giới dự tính Tên nƣ ớc Sản lƣợng (triệu tấn) Mỹ 90,0 8 Braxin 65,0 0 Achentina 50,0 0 Trung Quốc 14,6 0 Ấn Độ 8,8 0 Paragoay 6,5 0 [...]... chịu hạn tốt và cho đến nay đã có một số công trình tiêu biểu nghiên cứu về vấn đề này Đó là nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [5], nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103 [6], phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị Phương Liên và đtg... xuất đậu tương ở Việt Nam Việt Nam có lịch sử trồng đậu tương lâu đời, một số tài liệu cho rằng cây đậu tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng và xác định rằng nhân dân ta trồng cây đậu tương trước cây đậu xanh và các cây họ đậu khác [3] Các giống đậu tương ở nước ta hiện nay rất phong phú gồm các giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến và tập đoàn các giống đậu tương. .. gen trên, gen DREB5 có trình tự khoảng hơn 900 bp tham gia tích cực vào việc chống hạn của đậu tương, sản phẩm của gen này được thấy nhiều khi đậu tương gặp hạn, lạnh, mặn Chen và đtg (2007) đã phân lập gen DREB5 từ mRNA ở cây đậu tương có kích thước là 927 bp Nguyễn Hiệp Hòa và đtg (2010) đã khuếch đại thành công gen DREB5 từ mRNA của giống đậu tương Xanh Tiên Đài, tách dòng và xác định trình tự gen. .. cho mỗi giống Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trong điều kiện và chế độ chăm sóc như nhau Thời gian đầu tưới nước cho đủ ẩm, khi cây đậu tương được 3 lá tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương: - Chỉ số chịu hạn tương đối (S) được xác định thông qua tỉ lệ sống sót (%), khả năng giữ nước (%) của cây non trước và sau khi xử lý bởi hạn - Xác định tỷ lệ cây sống sót... xuất phương án cải thiện khả năng chống chịu thông qua việc cải tiến ở mức phân tử của cơ chế chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường sống đó là chuyển gen mục tiêu từ loài chống chịu tốt vào loài chống chịu kém Zhaoshi và đtg (2008) phân tích chức năng của gen GmDREB3, trong đậu tương (Glycine max L.), Shahrokhabadi và đtg (2008) đã xác định các gen trong họ gen DREB ở cây đậu tương, Dubouzet và. .. làm tăng sự phát triển rễ của hạt cây thuốc lá chuyển gen và ít bị tác động từ bên ngoài Các kết quả này cho thấy gen GmEXP1 đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển rễ của cây đậu tương, đặc biệt là trong quá trình kéo dài của rễ chính và rễ thứ cấp [24] Một số gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương Các gen chức năng Các gen chức năng có liên qua n đên kha năng chiu han bao gôm : HSP,... hại do hạn gây ra (%); b: Trị số thiệt hại của mỗi cấp; (%) c: Trị số thiệt hại của cấp cao nhất; N0: Số cây của mỗi cấp thiệt hại; N: Tổng số cây xử lý Các trị số: Số cây chết: trị số 3; Số cây héo: trị số 1; Số cây không bị ảnh hưởng: trị số 0 - Chỉ số chịu hạn tương đối được tính theo công thức: Sn = 1 sin (ab + bc + 2 cd α + de + eg + ga) Trong đó: a: % cây sống sau 3 ngày hạn; b: % khả năng giữ... ngày hạn; b: % khả năng giữ nước sau 3 ngày hạn; c: % cây sống sau 5 ngày hạn; d: % khả năng giữ nước sau 5 ngày hạn; e: % cây sống sau 7 ngày hạn; g: % khả năng giữ nước sau 7 ngày hạn; α: góc tạo bởi 2 trục mang trị số gần nhau và tính bằng 360/x; Sn: chỉ số chịu hạn tương đối của các giống đậu tương * Xác định hàm lượng lipid Dựa vào tính chất hoà tan của dung môi hữu cơ để chiết lipid, dung môi... các giống đậu tương địa phương Trong những năm gần đây cùng với việc tạo ra các giống đậu tương mới cho năng suất cao, các nhà chọn giống đậu tương còn quan tâm nghiên cứu các giống đậu tương địa phương, có năng suất thấp nhưng lại có chất lượng hạt cao và có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi như nóng, lạnh, phèn, mặn, hạn [2] Hiện nay, diện tích gieo trồng đậu tương ở nước ta đã... nâng cao tính chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm của Chu Hoàng Mậu (2000) [10] Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có nhiều thành công khi nghiên cứu về vai trò của bộ rễ trong việc nâng cao khả năng chịu hạn của đậu tương Lee và đtg (2003) đã nghiên cứu biểu hiện của gen Expansin (EXP1) từ mRNA của cây đậu tương có kích thước 1089 bp [23] Năm 2011 Lee và đtg đã nghiên . (tạ/ha) 2003 165 , 6 219, 7 13 ,2 6 2004 183, 8 245, 9 13 ,3 7 2005 204, 1 292, 7 14 ,3 4 20 06 185, 6 258, 1 13 ,9 0 2007 187, 4 275, 2 14 ,6 9 2008 191, 5 268 , 6 14 ,0 3 2009 1 46, 4 213, 6 14 ,5 9 (Nguồn:. suất (tạ/h 2003 83 ,6 6 227,8 9 27,2 4 2004 91 ,6 0 224,3 7 24,4 9 2005 92,5 1 231 ,6 5 25,0 4 20 06 95,2 5 229,2 4 24,0 7 2007 90,1 1 243 ,6 3 27,0 4 2008 96, 8 7 238,4 1 24 ,6 1 (Nguồn: FAOSTAT,. suất (tạ/h Mỹ 30,2 26, 67 80,53 28,84 28,72 82,83 Brazil 21,27 28,17 59,92 22,89 21,92 50,17 Argentina 16, 38 28,22 46, 23 14,03 27,28 38,27 Trung Quốc 9,13 17,02 15,54 9,500 17,79 16, 90 (Nguồn:United