BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ HỒNG HIỆP NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN CỦA CÁC DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG QUẬN CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.) CHUYÊN NGÀNH : KHOA HỌC CÂY TRỒNG Mà SỐ : 62.62.01.10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2014 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS Lê Huy Hàm Viện Di truyền Nông nghiệp Phản biện 3: TS Đặng Văn Đông Viện Nghiên cứu Rau Luận án bảo vệ hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi , ngày tháng năm 2014 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Học viện Nơng nghiệp Việt Nam M Đ U Tính c p thi t c a đ tài Cẩm chướng bốn loài hoa cắt cành trồng phổ biến giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012) Đây loại hoa có nhiều triển vọng sản xuất nội tiêu xuất c a Việt Nam nước ta nay, ch yếu trồng giống cẩm chướng nhập nội từ nước ngồi khơng ch động chi phí sản xuất cao, đặc biệt khơng thể m rộng sản xuất xuất b i khơng có quyền giống Vì vậy, việc nghiên c u chọn tạo giống hoa cẩm chướng đáp ng nhu cầu thị trư ng, phù hợp với điều kiện sinh thái có quyền c a Việt Nam yêu cầu b c thiết Đối với hoa việc chọn tạo giống tập trung ch yếu tạo giống có màu sắc Điều thực thông qua đư ng lai xa gây tạo đột biến Tuy nhiên hoa cẩm chướng nước ta việc lai xa khó thực b i khả thụ phấn thụ tinh khó Vì việc tạo giống có màu sắc thực thơng qua đư ng gây tạo đột biến Phương pháp chọn tạo giống gây tạo đột biến phát triển từ kỷ 20 ngày phát triển rộng rãi mang lại thành tựu to lớn công tác chọn tạo giống trồng Hơn nữa, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro tr thành công cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu chi phí th i gian chọn tạo giống trồng Kỹ thuật làm tăng tần số xuất đột biến với tính trạng có giá trị kinh tế lồi thực vật nói chung hoa nói riêng, góp phần khơng nhỏ cho việc cải tiến giống trồng (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013) Xuất phát từ vấn đề nêu thực đề tài “Nghiên c u t o đ t bi n in vitro vƠ đánh giá sinh tr ng, phát triển, sai khác di truy n c a dòng đ t bi n gi ng hoa cẩm ch ớng Qu n Chúa (Dianthus caryophyllus L.)” Mục tiêu c a đ tài Nghiên c u phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định phương pháp xử lý đột biến hiệu tạo dòng biến dị di truyền làm nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng Yêu cầu đề tài - Xác định khả nhân giống in vitro cho cẩm chướng giống Quận Chúa, làm s cho việc tái sinh tạo hoàn chỉnh mẫu xử lý đột biến in vitro tác nhân gây đột biến - Xác định hiệu xử lý gây tạo đột biến cho hoa cẩm chướng nuôi cấy mô mang lại hiệu cao: + Xác định nồng độ, th i gian xử lý EMS thích hợp cho chồi nhân in vitro hoa cẩm chướng + Xác định liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co thích hợp cho chồi nhân in vitro hoa cẩm chướng + Xác định hiệu c a xử lý phối hợp EMS tia gamma nguồn 60Co cho chồi nhân in vitro hoa cẩm chướng - Phân lập thể đột biến qua hệ nhân chồi in vitro - Sàng lọc dạng biến dị c a cẩm chướng sau xử lý điều kiện tự nhiên - Đánh giá sai khác di truyền c a số dịng đột biến có triển vọng phân lập thị SSR - Xác định phương pháp khử trùng mẫu, môi trư ng nhân nhanh, môi trư ng rễ giá thể thích hợp cho số dịng đột biến có tiềm tuyển chọn Ý nghĩa khoa học thực ti n c a đ tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên c u c a đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị việc ng dụng nhân giống in vitro phương pháp tạo giống thông qua xử lý đột biến in vitro c a hoa cẩm chướng Các kết nghiên c u c a đề tài s để tiếp tục nghiên c u tạo dòng đột biến làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo giống cẩm chướng Đồng th i tư liệu có giá trị cho việc nghiên c u lĩnh vực công nghệ sinh học chọn tạo giống trồng 4.2 Ý nghĩa thực ti n Đề tài xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho số dịng, giống hoa cẩm chướng, góp phần giải khó khăn thực tiễn nhân giống nay; ng dụng thành công phương pháp xử lý đột biến in vitro xây dựng quy trình xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro cho hoa cẩm chướng tác nhân EMS chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; tạo vật liệu kh i đầu phục vụ cho công tác nghiên c u chọn tạo giống hoa cẩm chướng chọn lọc số dịng đột biến có triển vọng Những đóng góp c a lu n án Các kết nghiên c u xác định tác nhân gây đột biến EMS tia gamma cho hiệu cao việc gây tạo biến dị có tiềm làm vật iệu cho cơng tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng Đề tài tạo dịng đột biến có tiềm đánh giá đặc điểm sinh trư ng phát triển c a dòng đột biến mầu sắc hoa điều kiện tự nhiên Các dòng đột biến đánh giá sai khác di truyền thị phân tử SSR xác định mối quan hệ di truyền với mẹ Đề tài xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho dịng đột biến có triển vọng (dịng H6 dòng H7) số dòng đột biến nêu trên, phục vụ cho nghiên c u để phát triển hai dòng thành giống hoa cẩm chướng Giới h n c a đ tài - Th i gian nghiên c u từ năm 2009 – 2013 - Địa điểm nghiên c u: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam B cục c a lu n án Nội dung c a luận án thể 130 trang, gồm: trang m đầu, 34 trang tổng quan, 17 trang vật liệu nội dung phương pháp nghiên c u, 73 trang kết thảo luận, trang kết luận kiến nghị 126 tài liệu tham khảo, 32 tài liệu tiếng Việt, 94 tài liệu tiếng Anh Kết nghiên c u có 34 bảng số liệu 41 hình Phần phục lục hình ảnh minh họa kết xử lý số liệu Ch ng T NG QUAN TÀI LI U Cẩm chướng loại hoa có giá trị kinh tế cao, chiếm tỷ lệ lớn loài hoa cắt cành giới (chiếm 17%) loài hoa xuất nước ta Việc đẩy mạnh sản xuất nâng cao chất lượng sản phẩm hoa cẩm chướng Việt Nam cịn nhiều hạn chế, đề quyền giống khó khăn việc tiếp cận thị trư ng hoa giới Đột biến đóng vai trò quan trọng chọn giống trồng, nh vào trình đột biến mà tạo nhiều giống hoa mới, đặc sắc có suất cao, khả chống chịu tốt, kháng sâu bệnh, lĩnh vực hoa cảnh nói riêng ngành chọn giống nói chung Xử lý gây tạo đột biến kết hợp ni cấy in vitro có nhiều ưu điểm so với phương pháp chọn giống truyền thống: tần số đột biến cao khả thu nhận thể đột biến đồng kiểu gen dễ dàng hơn; xử lý số lượng lớn tế bào, mơ, mà khơng địi hỏi diện tích lớn; sử dụng nhiều phận khác c a (tế bào, mô sẹo, chồi in vitro, đoạn thân, hạt, …); có khả rút ngắn th i gian so phương pháp truyền thống (chỉ cần - hệ) Các kết nghiên c u c a tác giả chọn tạo giống đột biến hoa cẩm chướng cho thấy việc ng dụng kỹ thuật gây tạo đột biến nhân tạo trồng nói chung hoa cẩm chướng nói riêng mang lại hiệu lớn Có nhiều giống hoa cẩm chướng với tính trạng tạo nh xử lý gây tạo đột biến Vì vậy, nói rằng, phương pháp chọn giống cẩm chướng loại hoa nói chung xử lý đột biến phương pháp đầy triển vọng công tác chọn tạo giống hoa cho sản xuất Ch ng Đ IT NG, N I DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 V t li u nghiên c u - Mắt ng c a chồi in vitro hoa cẩm chướng thơm giống Quận Chúa (Tên khoa học Dianthus caryophyllus “Princess”; tên thương mại Princess) - Các thiết bị dụng cụ hóa chất ni cấy mô tế bào - Phản ng PCR-SSR tiến hành 20 mồi SSR c a hãng Bioneer (theo Smulders et al., 2003, Tetsuya et al., 2009) - Hóa chất dùng nghiên c u sinh học phân tử Tris bazơ, agarose, isopropanol, Ethanol, chloroform, isoamylalcohol, CH3COONa, SDS, CTAB, Nacl, ETDA,… - Các hóa chất cho phản ng PCR gồm deoxynucleotit triphosphat (dNTPs) c a Sigma, Taq-DNA polymeraza c a Fermentas 2.2 N i dung nghiên c u 2.2.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cẩm chướng giống Quận Chúa - Nghiên c u ảnh hư ng c a phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống c a mẫu - Nghiên c u ảnh hư ng c a môi trư ng nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh trư ng c a chồi in vitro: + Nghiên c u ảnh hư ng c a BA kinetin môi trư ng MS đến hệ số nhân, sinh trư ng c a chồi in vitro + Nghiên c u ảnh hư ng c a tổ hợp cytokinin auxin đến hệ số nhân, sinh trư ng c a chồi in vitro - Nghiên c u ảnh hư ng c a α-NAA than hoạt tính mơi trư ng MS tới khả rễ c a chồi in vitro - Nghiên c u ảnh hư ng c a giá thể đến tỷ lệ sống sinh trư ng c a in vitro vư n ươm 2.2.2 Nghiên cứu phương pháp xử lý gây t o đột biến in vitro cho cẩm chướng - Nghiên c u xử lý EMS cho hoa cẩm chướng in vitro - Nghiên c u xử lý tia gamma nguồn 60Co cho hoa cẩm chướng in vitro - Nghiên c u xử lý kết hợp EMS tia gamma nguồn 60Co cho cẩm chướng in vitro 2.2.3 Nghiên cứu phân lập d ng chồi in vitro biến dị sau xử lý đánh giá sinh trưởng phát triển d ng chồi - Nghiên c u phân lập dạng chồi biến dị mặt hình thái - Nghiên c u khả rễ c a dạng chồi phân lập sau xử lý - Nghiên c u khả sinh trư ng phát triển c a dạng chồi điều kiện vư n ươm 2.2.4 Nghiên cứu sinh trưởng phát triển phân lập d ng biến dị cẩm chướng sau xử lý điều kiện tự nhiên Cây cẩm chướng sau xử lý đưa trồng nhà lưới, theo dõi phân lập dạng biến dị 2.2.5 Nghiên cứu đánh giá sai khác di truyền số dịng biến dị có triển vọng đ̃ phân lập thị SSR Chọn lọc số dịng biến dị có tiềm đánh giá sai khác di truyền m c độ phân tử thị SSR 2.2.6 Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho số dòng đột biến tuyển chọn - Nghiên c u ảnh hư ng c a th i gian khử trùng đến tỷ lệ sống c a mẫu - Nghiên c u ảnh hư ng c a môi trư ng nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh trư ng c a chồi in vitro - Nghiên c u ảnh hư ng c a auxin môi trư ng MS tới khả rễ c a chồi in vitro - Nghiên c u ảnh hư ng c a giá thể đến tỷ lệ sống sinh trư ng c a in vitro vư n ươm 2.3 Ph ng pháp nghiên c u 2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với lần nhắc lại 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro môi trư ng MS (Murahige and Skoog, 1962) với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose 100 mg/l innositol) có bổ sung chất điều tiết sinh trư ng Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo hồn chỉnh mẫu nuôi cấy nhiệt độ 20 – 220C, cư ng độ chiếu sáng 2.000 lux, th i gian chiếu sáng 16 gi /ngày Các cơng th c thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, cơng th c thí nghiệm bố trí 150 mẫu, chia làm lần nhắc lại 2.3.3 Phương pháp gây t o đột biến in vitro Phương pháp gây tạo đột biến tiến hành theo quy trình c a Novak and Brunner (1992) có cải tiến Mỗi cơng th c thí nghiệm xử lý lần nhắc lại lần 60 mẫu với liều lượng xử lý sau: - Xử lý gây t o đột biến tác nhân EMS: Mẫu xử lý m c nồng độ EMS 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0% với m c th i gian 1, gi - Xử lý gây t o đột biến tia gamma nguồn 60Co: Mẫu xử lý với liều hấp thụ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 Gᵧ - Xử lý gây t o đột biến EMS kết hợp tia gamma nguồn 60 Co: Mẫu xử lý EMS với nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% th i gian gi kết hợp tia gamma nguồn Co60 với liều hấp thụ 10, 20, 30 Gᵧ 2.3.4 Phương pháp đánh giá sai khác di truyền dòng đột biến thị phân tử SSR Để tiến hành phân tích đánh giá sai khác di truyền c a giống hoa cẩm chướng m c độ phân tử, DNA c a mẫu hoa cẩm chướng nhân phương pháp PCR với 20 mồi SSR Các sản phẩm điện di gel agarose 3,5% 2.3.4.1 Phương pháp chiết tách DNA Trong thí nghiệm chiết tách DNA tổng số c a mẫu cẩm chướng dựa theo phương pháp c a Obara – Okeyo P and Kako (1998) có cải tiến 2.3.4.2 Phương pháp PCR – SSR Phản ng PCR thực với nhiều chu kì, nhiệt độ biến tính DNA 950C, nhiệt độ gắn mồi 37- 550C tuỳ theo mồi, nhiệt độ tổng hợp chuỗi DNA 720C 2.3.4.3 Phương pháp điện di gel agarose Sản phẩm c a phản ng PCR-SSR kiểm tra gel agarose 1% soi gel ánh sáng đèn UV, nhận biết sản phẩm khuếch đại dựa vào thang chuẩn DNA 1Kb 2.3.4.4 Phương pháp phân tích số liệu Các số liệu đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.1 c a Rohlf (2002) để tính ma trận tương đồng cặp mẫu ảệ số PIC - Chỉ số thơng tin đa hình (Nei, 1973) ��� = − ∑ ��2 Trong đó: pi tần số xuất alen th i Tỷ lệ dị hợp tử (ả%) Số mồi xuất ≥2 alen/ 1locus SSR H%= x 100 Tổng số mồi sử dụng-Số mồi khuyết số liệu 2.3.5 Phương pháp theo dõi, đánh giá đặc điểm nông, sinh học Các tiêu đánh giá ngồi đồng ruộng theo Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng tính ổn định c a Hiệp hội Quốc tế bảo hộ giống trồng (Hiệp hội Quốc tế bảo hộ giống trồng mới, 2008) 2.4 Ph ng pháp xử lý s li u Số liệu xử lý theo phương phân tích phương sai (ANOVA) theo chương trình Irristat 5.0S Excel Số liệu phân tích SSR xử lý phần mềm NTSYS pc2.1 Sử dụng thuật toán nội suy lagrange để xây dựng mơ hình tốn học Sử dụng phương pháp Reed and Muench (1983), Behrens and Karber (1935) để xác định liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50) Ch ng K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 3.1 Nghiên c u nhân gi ng in vitro cho cẩm ch ớng gi ng Qu n Chúa 3.1.1 Nghiên cứu t o vật liệu khởi đầu Kết nghiên c u cho thấy, cẩm chướng giống Quận Chúa sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% để khử trùng mẫu có hiệu tốt so với NaOCl (5%) Trong công th c thí nghiệm nghiên c u cơng th c (sử dụng HgCl2 0,1% th i gian phút) cho hiệu tốt 3.1.2 Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro 3.1.2.1 nh hưởng BA kinetin môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng chồi in vitro cẩm chướng Kết nghiên c u cho thấy: công th c có bổ sung kinetin BA cho phát sinh chồi cao đối ch ng Tuy nhiên, nồng độ BA kinetin bổ sung khác số chồi phát c a chồi biến đổi hình thái c a chồi cơng th c thí nghiệm, tỷ lệ chồi biến dị tăng dần theo tăng c a nồng độ th i gian xử lý EMS Sự phân bố c a dạng chồi công th c không giống Khi xử lý nồng độ 0,2% xuất dạng chồi: A, B, C D Khi tăng nồng độ EMS lên 0,4; 0,6; 0,8% kết cho dạng chồi A, B, C, D, E nồng độ xử lý 1,0 % số dạng chồi xuất lại giảm có dạng: A, B, C D B ng 3.1 nh h ng c a EMS đ n phát sinh hình thái c a ch i in vitro cẩm ch ớng với th i gian xử lý gi Tỷ lệ dạng chồi (%) Nồng độ Công Tỷ lệ EMS Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng th c chồi (%) A B C D E biến dị ĐC 0,0 97,76 2,24 0,00 0,00 0,00 2,24 CT1.1 0,2 86,75 8,10 2,16 3,00 0,00 13,20 CT1.2 0,4 74,40 17,32 2,54 4,19 1,55 15,60 CT1.3 0,6 64,91 22,32 4,78 4,28 3,70 34,75 CT1.4 0,8 54,62 33,25 6,12 3,82 2,19 45,72 CT1.5 1,0 47,50 34,72 15,45 2,33 0,00 52,50 B ng 3.2 nh h ng c a EMS đ n phát sinh hình thái c a ch i in vitro cẩm ch ớng với th i gian xử lý gi Tỷ lệ dạng chồi (%) Nồng độ Công Tỷ lệ Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng th c EMS chồi biến A B C D E (%) dị ĐC 0,0 95,81 4,19 0,00 0,00 0,00 4,19 CT2.1 0,2 81,82 10,08 3,13 3,29 1,69 18,51 CT2.2 0,4 70,24 17,55 3,75 4,64 3,81 28,25 CT2.3 0,6 61,36 27,11 5,42 3,69 2,41 38,53 CT2.4 0,8 51,15 32,51 10,63 3,47 2,25 49,53 CT2.5 1,0 42,12 36,42 21,46 0,00 0,00 57,88 11 Khi xử lý nồng độ cao th i gian dài cho tỷ lệ chồi biến dị nhiều nhiên số dạng chồi biến dị xuất lại giảm, đa số chồi bị chết Dạng biến dị tăng ch yếu dạng biến dị B, C, dạng chồi C có khả sinh trư ng phát triển Nồng độ EMS thích hợp cho xử lý gây tạo đột biến in vitro cẩm chướng giống Quận Chúa 0,4% th i gian gi B ng 3.3 nh h ng c a EMS đ n phát sinh hình thái c a ch i in vitro cẩm ch ớng với th i gian xử lý gi Tỷ lệ dạng chồi (%) Công th c Nồng độ EMS (%) Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E ĐC CT3.1 CT3.2 CT3.3 CT3.4 CT3.5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 94,13 69,71 66,33 53,59 44,71 34,76 5,87 19,71 21,73 31,46 38,06 35,44 0,00 4,69 5,39 9,31 14,33 29,80 0,00 3,50 4,36 3,57 2,90 0,00 0,00 2,39 2,20 2,08 0,00 0,00 Tỷ lệ chồi biến dị 5,87 29,93 33,33 46,01 56,33 64,49 Từ kết thu được, xác định hệ số tương quan nồng độ EMS xử lý tỷ lệ chồi biến dị xây dựng mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ nồng độ EMS tỷ lệ biến dị c a chồi với m c th i gian xử lý 1, gi sau: Y = 2,24 + 266,34x-1823,63x2+4983,33x3-5431,25x4+2061,46x5 Y = 4,19+99,15x-192,33x2+311,72x3-201,04x4+36,20x5 Y = 5,87+327,25x-1665,40x2+3870,73x3-3865,10x4+1391,15x5 Trong : Y tỷ lệ chồi biến dị; x Nồng độ EMS xử lý 3.2.2 Nghiên cứu xử lý gây t o đột biến cho hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro chiếu x tia gamma nguồn 60Co 3.2.2.1 Nghiên cứu nh hưởng xử lý chiếu x tia gamma nguồn 60 Co tới phát sinh sinh trưởng hoa cẩm chướng in vitro Kết nghiên c u cho thấy, cơng th c thí nghiệm cho 12 thấy có phụ thuộc tuyến tính liều lượng xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi Khi liều lượng xử lý tăng, tỷ lệ mẫu sống phát sinh chồi giảm Trong cơng th c thí nghiệm, tỷ lệ mẫu sống phát sinh chồi đạt cao CT1 (tỷ lệ sống đạt 91,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt 91,99%), xử lý liều hấp thu 70 Gᵧ 100% mẫu bị chết Từ kết thu được, thuật tốn nội suy Lagrange chúng tơi xây dựng mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ liều lượng xử lý gamma với tỷ lệ mẫu chết Y= 57,83.10-10 x7 + 1,42.10-6 x6 - 1,38.10-4 x5 + 6,65.10-3 x4 - 0,166x3 + 1,995x2 - 8,096x + Trong đó: Y : Tỷ lệ mẫu chết (%); x: Liều lượng xử lý gamma (Gᵧ) Bằng phương pháp Behrens and Karber (1935), xác định liều lượng gây chết 50% mẫu thí nghiệm LD50= 38,57Gᵧ 3.2.2.2 nh hưởng chiếu x tia gamma nguồn 60Co đến phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro cẩm chướng Sau xử lý phân lập dạng chồi (Dạng A, dạng F, dạng G, dạng H, dạng I dạng K) Dạng A Dạng F Dạng G Dạng H Dạng I Dạng K Hình 3.2 Các d ng chồi thu sau xử lý tia gamma nguồn 60Co Số liệu thực nghiệm cho thấy có phụ thuộc tuyến tính c a tỷ lệ chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng cao tỷ lệ chồi biến dị lớn Sự phân bố c a dạng chồi cơng th c thí nghiệm khơng giống Khi xử lý liều hấp thu 20Gᵧ đến 13 50Gᵧ xuất dạng chồi: A, F, G, H, I K liều hấp thu thấp 10Gᵧ thu dạng chồi A, F, H Đặc biệt tăng liều lượng xử lý lên 60Gᵧ thu dạng chồi I K liều lượng xử lý cao, tỷ lệ chồi biến dị cao nhiên số dạng chồi biến dị lại giảm Đặc biệt dạng chồi G, H (chồi có khả sinh trư ng phát triển tốt) có xu hướng giảm mạnh B ng 3.4 Tỷ l ch i bi n d vƠ d ng ch i sau xử lý tia gamma ngu n 60Co Liều Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Tỷ lệ hấp thu A F G H I K biến (Gᵧ) (%) (%) (%) (%) (%) (%) dị (%) 10 20 30 40 50 60 70 96,20 89,68 64,04 52,99 41,54 22,34 0,00 0,00 3,80 6,53 9,53 10,72 18,00 25,12 0,00 0,00 0,00 0,00 7,39 13,69 8,92 8,37 0,00 0,00 0,00 3,79 7,39 8,93 6,77 8,37 0,00 0,00 0,00 0,00 6,35 6,54 10,16 13,71 16,67 0,00 0,00 0,00 5,29 7,14 14,61 22,09 83,33 0,00 3,80 10,32 35,96 47,01 58,46 77,66 100,0 0,00 Từ kết nghiên c u xây dựng mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co tỷ lệ chồi biến dị Y= 7,255.10-8 x6 - 15,533.10-6 x5 + 12,865.10-4 x4 - 5,05.10-2 x3 + 0,92x2 - 4,639x + 3,80 Trong đó: Y tỷ lệ chồi biến dị (%); X liều hấp thu (Gᵧ) 3.2.3 Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS chiếu x tia gamma ngu n 60Co cho hoa cẩm chướng in vitro 3.2.3.1 Nghiên cứu nh hưởng xử lý kết hợp EMS tia gamma nguồn 60Co tới sinh trưởng chồi in vitro hoa cẩm chướng Kết thí nghiệm cho thấy tăng liều xử lý lên tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi giảm dần Trong cơng th c thí 14 nghiệm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt cao công th c CT1 (Tỷ lệ mẫu sống 87,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 89,33%), tỷ lệ mẫu sống thấp công th c CT12 (Tỷ lệ mẫu sống 24,67%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 60,00%) 3.2.3.2 nh hưởng xử lý kết hợp EMS tia gamma nguồn 60Co đến phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro Sau xử lý phân lập dạng chồi (Dạng A, dạng F, dạng G, dạng L, dạng M, dạng N, dạng O dạng P) Dạng A Dạng E Dạng G Dạng L Dạng M Dạng N Dạng O Dạng P Hình 3.3 Các d ng ch i sau xử lý k t h p EMS vƠ tia gamma ngu n 60Co Số liệu thực nghiệm cho thấy có phụ thuộc tuyến tính c a tỷ lệ chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng cao tỷ lệ chồi biến dị lớn Sự biến động số dạng chồi biến dị có xu hướng tương tự xử lý riêng rẽ EMS chiếu xạ tia gamma Khi tăng liều xử lý tỷ lệ chồi biến dị có xu hướng tăng lên, nhiên số dạng chồi lại có xu hướng giảm công th c xử lý với liều lượng cao Đặc biệt dạng chồi G (chồi có khả sinh trư ng phát triển tốt) xuất công th c CT4 đến CT10 Công th c CT5 xuất nhiều dạng chồi, dạng chồi tiềm có tỷ lệ cao (Dạng G: 9,12%) Xử lý kết hợp EMS tia gamma xuất nhiều dạng chồi biến dị hơn so với xử lý riêng rẽ hai tác nhân (Nguyễn Thị Lý Anh cs., 2009) 15 16 B ng 3.5 Tỷ l ch i bi n d vƠ d ng ch i in vitro sau xử lý k t h p EMS vƠ tia gamma ngu Nồng Liều Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Công độ hấp thụ A F G L M N O P th c EMS gamma (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (Gᵧ) ĐC 0,0 0,0 95,92 0,00 0,00 0,00 4,08 0,00 0,00 0,00 CT1 0,1 10 86,79 4,73 0,00 0,00 8,50 0,00 0,00 0,00 CT2 0,1 20 79,65 5,33 0,00 0,00 10,18 4,84 0,00 0,00 CT3 0,1 30 71,26 11,63 0,00 0,00 10,95 6,17 0,00 0,00 CT4 0,2 10 72,66 8,48 3,26 0,00 8,36 7,26 0,00 0,00 CT5 0,2 20 57,50 7,98 9,12 0,00 11,30 8,72 0,00 5,37 CT6 0,2 30 37,89 18,40 6,90 0,00 9,20 6,90 6,90 13,80 CT7 0,3 10 45,96 13,27 6,60 0,00 9,32 11,18 11,18 2,49 CT8 0,3 20 34,34 15,48 7,16 4,78 9,39 11,13 11,45 6,26 CT9 0,3 30 29,49 18,49 5,44 6,54 9,95 12,04 12,04 6,02 CT10 0,4 10 39,62 16,36 4,36 7,38 8,90 12,26 11,12 0,00 CT11 0,4 20 28,90 25,52 0,00 7,82 7,82 3,91 10,36 15,65 CT12 0,4 30 27,77 27,87 0,00 8,96 0,00 8,62 8,62 18,15 16 n 60Co Tỷ lệ chồi biến dị (%) 4,08 13.21 20,35 28,74 27,34 42,50 62,11 54,04 65,66 70,51 60,38 71,10 72,23 3.3 Nghiên c u kh sinh tr ng c a d ng ch i in vitro 3.3.1 Nghiên cứu kh rễ d ng chồi in vitro cẩm chướng sau xử lý Trong môi trư ng rễ, trừ dạng chồi G, dạng chồi biến dị có khả rễ thấp so với dạng chồi bình thư ng Khả rễ cao dạng G (100%) thấp dạng chồi C (37,78%), đặc biệt dạng chồi I dạng chồi M khơng có khả sống cấy sang môi trư ng rễ 3.3.2 Nghiên cứu sinh trưởng phát triển d ng chồi in vitro cẩm chướng sau xử lý điều kiện khí canh Các dạng chồi biến dị có khả sống sinh trư ng thân thấp nhiều so với dạng chồi bình thư ng Tỷ lệ sống c a dạng chồi khác nhau, cao chồi dạng G (100%) sau chồi dạng A, B, H, D, E, F, L, P, K, Chồi dạng C, K có khả sống thấp (Dạng C: 3,33%; dạng K: 13,33%) Chồi dạng I, M, O khơng có khả sống điều kiện vư n ươm 3.3.3 Nghiên cứu sinh trưởng phát triển d ng chồi in vitro cẩm chướng sau xử lý giai đo n đồng ruộng Hầu hết dạng chồi khả điều kiện vư n ươm (dạng C, K, P) bị chết sau trồng ruộng Khả sống sinh trư ng c a dạng chồi giai đoạn đồng ruộng có tương đồng với giai đoạn phịng thí nghiệm giai đoạn khí canh Cụ thể dạng chồi G, A có khả sinh trư ng phát triển tương đối tốt, cho tỷ lệ sống cao 80%, thân phát triển tốt Các dạng chồi D, E, F, H, L, N có tỷ lệ sống thấp 3.4 Nghiên cứu nh hưởng xử lý gây t o đột biến đến phát sinh biến dị cẩm chướng giai đo n đồng ru ng Để đánh giá hiệu c a tác động c a tác nhân gây đột biến tiến hành phân lập dạng biến dị mặt hình thái khả sinh trư ng phát triển c a cẩm chướng giai đoạn đồng ruộng Qua theo dõi phân lập số dạng biến dị th i gian sinh trư ng, hình thái màu sắc hoa phân nhóm sau: 17 Nhóm 1: Biến dị hình thái lá: cuộn, hình ống Nhóm 2: Chồi nách phát triển Nhóm 3: Biến dị màu sắc hoa: H1: Hoa màu tím; H2: Hoa màu phấn hồng viền tím; H3: Hoa màu trắng viền đỏ; H4: Hoa màu trắng sọc tím; H5: Hoa màu trắng viền tím nhẹ, số cánh hoa khơng có viền tím; H6: Hoa trắng viền phấn hồng; H7: Hoa màu tím nhạt viền tím đậm Đối ch ng Lá hình ống Đầu cuộn Chồi nách phát triển Hình 3.10 M t s d ng bi n d v hình thái thơn Đối ch ng H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 Hình 3.4 Hình nh m t s d ng bi n d v màu sắc hoa 3.4.1 nh hưởng xử lý EMS đến phát sinh biến dị cẩm chướng giai đo n đồng ruộng Khi xử lý EMS xuất nhóm biến dị, có dạng biến dị màu sắc hoa (H1, H2, H4, H5, H7), dạng H3, H6 không xuất xử lý EMS công th c xử lý nồng độ cao th i gian dài, biến dị hình thái thân xuất nhiều hơn, biến dị hoa tăng ch yếu dạng H5 (dạng biến dị lợi) Trong cơng th c thí nghiệm cơng th c CT7 (xử lý EMS nồng độ 0,4% th i gian gi ) cho biến dị màu sắc hoa nhiều Đặc biệt dạng hoa H7 xuất công th c 18 3.4.2 nh hưởng xử lý chiếu x tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị cẩm chướng sau xử lý giai đo n đồng ruộng Kết nghiên c u cho thấy xử lý chiếu xạ gamma xuất nhóm biến dị (biến dị hình thái biến dị màu sắc hoa), biến dị khả phát triển chồi nách mạnh khơng xuất Trong nhóm biến dị màu sắc hoa thu dạng (H4, H5, H6), dạng H1, H2, H3 H7 không xuất xử lý chiếu xạ gamma riêng rẽ Trong công th c thí nghiệm cơng th c CT3 (xử lý liều 30Gᵧ) cho biến dị màu sắc hoa nhiều Đặc biệt dạng hoa H7 xuất công th c 3.4.3 nh hưởng xử lý kết hợp EMS chiếu x tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị cẩm chướng sau xử lý giai đo n đồng ruộng Kết nghiên c u cho thấy việc xử lý kết hợp EMS chiếu xạ gamma làm tăng tỷ lệ biến dị lên nhiều so với xử lý riêng rẽ EMS gamma Tỷ lệ biến dị đạt cao công th c CT5 (24,66%) thấp công th c CT1 (4,0%) Xử lý kết hợp EMS chiếu xạ gamma cho kết xuất nhóm biến dị (biến dị hình thái lá, biến dị phát triển chồi nách biến dị màu sắc hoa) Tuy nhiên, nhóm biến dị màu sắc hoa thu dạng (H1, H3, H4, H5 H7), dạng H2 H6 không xuất Kết nghiên c u cho thấy xử lý kết hợp làm xuất thêm dạng (H3) Kết thực nghiệm cho thấy, dạng biến dị màu sắc tập chung ch yếu dạng chồi A (dạng chồi bình thư ng), số xuất dạng chồi B, F, G, H Dạng biến dị H5 chiếm tỷ lệ cao dạng chồi F Các dạng chồi D, E, L xuất biến dị hình thái khả phát triển chồi nách mạnh 3.4.4 Đặc điểm hình thái số d ng biến dị màu sắc hoa sau xử lý giai đo n đồng ruộng Về đặc điểm hình thái c a số dạng biến dị màu sắc hoa tiêu khác có khác Trong giai đoạn phát triển khác nhau, cá thể dịng đột biến có tốc độ tăng trư ng tương tự Trong giai đoạn 19 chuyển sang giai đoạn sinh trư ng sinh thực dịng bắt đầu có tốc độ phát triển khác dẫn đến chiều cao trung bình c a dịng bắt đầu có thay đổi Chiều cao c a dạng H1, H3, H4, H6, H7 dạng đối ch ng tương đối đồng Dạng H5 có chiều cao trung bình thấp (98 ± 9,23cm) Kích thước hoa n dao động từ 5,2 đến 7,1 cm Dạng H2, H3, H4 có kích thước lớn dạng đối ch ng dạng lại Cấu trúc cánh hoa có khác biệt, bề mặt cánh hoa dạng đối ch ng, H4 H5 gấp nếp, dạng H1, H2, H3, H6, H7 bề mặt cánh hoa phẳng; Rìa cánh hoa dạng H2 dạng H7 có khác biệt so với đối ch ng dạng cịn lại (rìa cánh hoa cưa nhẹ, nơng) Độ rộng c a cánh hoa ngồi c a dạng đột biến có khác nhau, dạng H2, H3 H4 có độ rộng cm, dạng lại biến động từ 2,1 đến 2,8 cm Số lượng vòi nhụy dạng khơng có khác nhiên độ dài c a vòi nhụy c a dạng H1 dạng H3 vòi nhụy dài 3.5 Nghiên c u đánh giá sai khác di truy n c a m t s dòng cẩm ch ớng kỹ thu t SSR 3.5.1 Kết qu phân tích nhân b n DNA với cặp mồi Kết phân tích đánh giá sai khác di truyền c a giống hoa cẩm chướng m c độ phân tử, DNA c a mẫu hoa cẩm chướng (gồm dòng đột biến H1, H2, H3, H4, H6, H7 giống Quận Chúa) nhân phương pháp PCR với 20 mồi SSR thu tổng số 150 băng với kích thước chiều dài nhỏ khoảng 100bp băng có kích thước lớn khoảng 1200bp Kết nghiên c u cho thấy: Các dịng đột biến có khác biệt mặt di truyền so với giống gốc, sai khác lớn dịng H3 (hệ số tương đồng di truyền H3-H1: 0,5098) thấp dòng H4 (hệ số tương đồng di truyền H4-ĐC: 0,8293) Trong 20 cặp mồi SSR lựa chọn để nghiên c u, mồi CB001a, CDB221 không phân biệt sai khác mặt di truyền dòng, giống hoa cẩm chướng nghiên c u Mồi CB016a 20 cho sai khác mẫu đối ch ng dịng khác, khơng có sai khác dòng biến dị nghiên c u Mồi DCA221, CB047a, sử dụng để phân biệt dòng H7 với dòng khác đối ch ng Cặp mồi cho kết đa hình cao CB004a, CB026a với tổng số băng thu tương ng 13 11 3.5.2 Kết qu phân tích hệ số PIC với cặp mồi Kết cho thấy hệ số PIC dao động từ 0,0 (các cặp mồi có đơn hình) đến giá trị cao 0,83 cặp mồi CB004a Hệ số PIC trung bình c a 20 cặp mồi dòng cẩm chướng nghiên c u 0,26 cho thấy locus gen đa dạng 3.5.3 Đánh giá độ di truyền dòng cẩm chướng nghiên cứu Các dòng, giống cẩm chướng nghiên c u có tỷ lệ dị hợp tử (H%) thay đổi từ 14,29% đến 29,41% Tỷ lệ dị hợp tử cao dòng đột biến H3 (29,41%) dòng H2, H6, H1, H4, ĐC H7 Tỷ lệ dị hợp tử thấp dòng H7 (14,29%) Kết cho thấy dòng, giống cẩm chướng nghiên c u có độ di truyền cao 3.5.4 ảệ số đồng d ng mối quan hệ di truyền dòng, giống cẩm chướng Kết nghiên c u cho thấy hệ số tương đồng di truyền c a dòng đột biến giống Quận Chúa dao động khoảng 0,5098 đến 0,8293 M c sai khác di truyền lớn dòng H1-H3 (khoảng cách di truyển 0,4902) Cặp giống ĐC dòng H4 có tương đồng di truyền cao (khoảng cách di truyền 0,1707) Từ sơ đồ hình mối quan hệ di truyền mẫu giống cẩm chướng cho thấy m c độ sai khác di truyền giống có khác m c tương đồng 0,75 chia dịng, giống cẩm chướng thành nhóm: Nhóm 1: Gồm giống ĐC dịng H4; Nhóm 2: Dịng H1; Nhóm 3: Dịng H2; Nhóm 4: Dịng H3; Nhóm 5: Dịng H6; Nhóm 6: Dịng H7 Kết phân tích DNA hồn tồn phù hợp với khác biệt dòng, giống nghiên c u mặt hình thái đặc điểm thân lá, màu sắc, cấu trúc cánh hoa 21 Hình 3.5 Mối quan hệ di truyền dòng, giống cẩm chướng 3.6 Nghiên c u nhân gi ng in vitro m t s dòng đ t bi n đ c tuyển chọn 3.6.1 nh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống mẫu dòng H6 H7, cơng th c thí nghiệm, cơng th c sử dụng HgCl2 0,1% th i gian phút cho hiệu tốt (tỷ lệ mẫu sống đạt 76,33%; tỷ lệ mẫu nhiễm có 7,67%; th i gian phát sinh chồi sớm) 3.6.2 Đánh giá kh nhân nhanh in vitro dòng cẩm chướng đột biến đ̃ chọn lọc sau xử lý in vitro Kết cho thấy dịng H6, cơng th c bổ sung 0,5 mg/l kinetin + 0,5 mg/l BA thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro Đối với dịng H7, cơng th c bổ sung 1,0 mg/l kinetin thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro 3.6.3 Nghiên cứu nh hưởng auxin đến kh t o in vitro hồn chỉnh hai dịng cẩm chướng H6 H7 Môi trư ng tạo rễ tối ưu c a dịng H6 H7 có khác Đối với dịng H6 cơng th c (MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA) tốt rễ c a dòng đột biến này, với dòng H7 môi trư ng tốt cho rễ in vitro MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA Trên môi trư ng chồi in vitro không rễ thuận lợi mà chồi sinh trư ng phát triển tốt 22 3.6.4 Nghiên cứu nh hưởng phương pháp đến tỷ lệ sống sinh trưởng in vitro vườn ươm Qua kết nghiên cho thấy công th c cho tỷ lệ sống cao đồng th i sinh trư ng phát triển tốt Trong loại giá thể nghiên c u phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) cho dòng H6 H7 cho kết tốt K T LU N VÀ Đ NGH K t lu n 1) Để nhân giống in vitro cho hoa cẩm chướng giống Quận Chúa sử dụng quy trình ni cấy sau: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) th i gian phút; giai đoạn nhân nhanh dùng mơi trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l kinetin; giai đoạn tạo hồn chỉnh dùng mơi trư ng dinh dưỡng MS có bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA; thích ng in vitro điều kiện tự nhiên phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) cho hiệu tốt 2) Xử lý gây tạo đột biến in vitro tác nhân gây đột biến EMS tia gamma làm giảm khả sống, khả phát sinh chồi, sinh trư ng c a đoạn thân mang mắt ng cẩm chướng giống Quận Chúa (tỷ lệ sống giảm so với đối ch ng từ 8,89 đến 78,89% xử lý EMS; từ 6,67 đến 98,0% xử lý chiếu xạ tia gamma; từ 8,00 đến 70,66% xử lý kết hợp EMS chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co 3) Xử lý gây tạo đột biến in vitro tác nhân gây đột biến EMS tia gamma nguồn 60Co làm làm tăng tỷ lệ biến dị cho cẩm chướng nuôi cấy in vitro (từ 2,0 đến 18,66 lần so với đối ch ng xử lý EMS; từ 2,67 đến 16,67 lần so với đối ch ng xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; từ 1,5 đến 9,24 lần so với đối ch ng xử lý kết hợp EMS chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co) 4) Để gây tạo đột biến cho hoa cẩm chướng in vitro giống Quận Chúa đạt hiệu cao phương pháp xử lý hóa chất EMS, nồng độ th i gian xử lý thích hợp 0,4% th i gian gi ; phương pháp xử lý tia gamma nguồn 60Co, xử lý với liều 23 hấp thu 30 Gγ; phương pháp xử lý kết hợp EMS tia gamma nguồn 60Co nên xử lý EMS nồng độ 0,2% th i gian gi kết hợp chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với liều hấp thu 20 Gγ Trong phương pháp gây tạo đột biến in vitro nghiên c u, phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro hóa chất EMS cho hiệu tốt hơn, cho tỷ lệ biến dị cao xuất nhiều biến dị có tiềm 5) Đề tài chọn lọc dịng đột biến màu sắc có tiềm phát triển thành giống (dòng H1, H2, H3, H4, H6 H7) Đánh giá sai khác di truyền dòng đột biến thị phân tử SSR cho thấy, dịng đột biến màu sắc có khác biệt mặt di truyền so với giống gốc Trong dịng H3 có sai khác di truyền lớn (hệ số tương đồng di truyền H3 - H1: 0,5098) sai khác di truyền thấp dòng H4 (hệ số tương đồng di truyền H4 - ĐC: 0,8293) 6) Do có khác cấu trúc di truyền nên cảm ng với môi trư ng ni cấy in vitro dịng H6 H7 có khác Để nhân giống in vitro cho dòng đột biến H6 H7 sử dụng mơi trư ng sau: Đối với dịng H6: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) th i gian phút; môi trư ng nhân nhanh phù hợp MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l kinetin; môi trư ng phù hợp để tạo hoàn chỉnh MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA Khi đưa vư n ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1); Đối với dòng H7: Khử trùng mẫu dùng HgCl2 (0,1%) th i gian phút; môi trư ng nhân nhanh tạo hồn chỉnh thích hợp là: MS + 1,0 mg/l kinetin MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA Khi đưa ngồi vư n ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) Đ ngh 1) Bổ sung kết nghiên c u nuôi cấy in vitro vào quy trình vi nhân giống hoa cẩm chướng 2) ng dụng dòng đột biến gây tạo vào công tác chọn giống hoa cẩm chướng 3) M rộng phổ xử lý EMS tia gamma cho giống khác để tìm chế độ xử lý thích hợp cho giống nhằm tạo nguồn vật liệu cho ý nghĩa cho công tác chọn tạo giống cẩm chướng 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH Đà CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Vũ Hồng Hiệp Nguyễn Thị Lý Anh (2013) Ảnh hưởng xử lý đột biến in vitro chiếu xạ gamma hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.), Báo cáo khoa học Proceedings, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học tồn quốc 2013, Quyển 2: Cơng nghệ sinh học Vi sinh, công nghệ sinh học Thực vật, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ: 817 - 821 Vũ Hoàng Hiệp Nguyễn Thị Lý Anh (2013) Ảnh hưởng xử lý đột biến in vitro Ethyl methane sulphonate (EMS) kết hợp chiếu xạ tia gamma đến biến dị hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.), Tạp chí Khoa học phát triển, 8: 1092 - 1100 ... Nguyễn Thị Lý Anh (2 013) Ảnh hưởng xử lý đột biến in vitro chiếu xạ gamma hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.), Báo cáo khoa học Proceedings, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc... sung kinetin BA cho phát sinh chồi cao đối ch ng Tuy nhiên, nồng độ BA kinetin bổ sung khác số chồi phát sinh sinh trư ng thân c a chồi có khác khác Trong cơng th c thí nghiệm cơng th c CT6 (MS... mẫu - Nghiên c u ảnh hư ng c a môi trư ng nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh trư ng c a chồi in vitro: + Nghiên c u ảnh hư ng c a BA kinetin môi trư ng MS đến hệ số nhân, sinh trư ng c a chồi in vitro