Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến T.S Nguyễn Thị Hoài Hà và Th.S Phạm Thị Bích Đào, thành viện nhóm đề tài nhánh: “Phân lập, sàng lọc vi tảo biển dị dưỡng họ Thraustochytrid rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam Định” Phòng Sinh học Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình chỉ bảo, giúp đỡ trình thực tập và thực khóa luận Xin cảm ơn Cô và Chị động viên giúp đỡ từng công việc Tôi học hỏi được ở cô và chị sự cẩn thận, nghiêm túc nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Th.S Mai Thị Đàm Linh người tận tình giảng dạỵ, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hoàn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn tới Thầy, Cô Bộ môn vi sinh vật học, Khoa Sinh Học trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập và thực đề tài Tôi xin cảm ơn đến Gia đình, Anh, Chị, Em và Bạn đồng môn đồng hành và giúp đỡ tơi q trình thực khóa luận và sống Các chị, bạn và em để lại cho nhiều kỷ niệm vui và đáng nhớ thời gian nghiên cứu Hà Nội, tháng năm 2014 Sinh viên Lê Đình Tương MỤC LỤC Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.3.3 Phương pháp lên men thu sinh khối tao hệ thống bình lên men 10 lít .15 2.3.4 phương pháp xác định lipid tách acid béo 16 2.3.4.2 Phương pháp tách acid béo .17 3.3 Lên men 26 3.4 Xác định lipid phân tích thành phẩn acid béo 28 3.4.1 Xác định lipid nội bào 28 Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt Tên đầy đủ ω-3 Omega-3 ω-6 Omega – AA Arachidonic acid DHA Docosahexaenoic acid DPA Docopentaenoic acid EPA Eicosapentaenoic acid LCPUFA MUFA HPLC PCB PUFA VTBDD Long Chain Polyunsanturated fatty acid - Acid béo không no đa nối đôi mạch dài Monounsanturated fatty acid - Acid béo không no nối đôi High performance liquid chromatography - Sắc ký lỏng cao áp Polychlorobiphenyl Polyunsanturated fatty acid - Acid béo không no đa nôi đôi Vi tảo biển dị dưỡng RNM Rừng ngập mặn TLK Trọng lượng khơ Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Chăn ni gia cầm [27] Hình 1.2 Schizochytrium quan sát kính hiển vi (×40) Hình 1.3 Vòng đời Schizochytrium [21] Hình 1.4 Hình dạng tế bào chu kỳ phát triển Schizochytrium A) Sự giải phóng động bào tử, B) Tế bào trưởng thành C) Sự phân chia liên tiếp tế bào, D) Hình thành túi động bào tử, E) Hình thành tế bào dạng amip Hình 3.6 Sơ đồ trình lên men 15 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào VTBDD Schizochytrium XT41 (× 40) 19 Hình 3.2 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng Schizochytrium XT41 .21 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng Schizochytrium XT41 22 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng Schizochytrium XT41 23 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ glucose đến sinh trưởng Schizochytrium XT41 .25 Hình 3.8 Đường cong sinh trưởng VTBDD Schizochytrium XT41 hệ thống bình lên men 10 lít 27 Hình 3.9 Tế bào bắt màu vàng (trái) tế bào trước nhuộm Nile red (phải) hạt lipid tế bào VTBDD Schizochytrium XT41 .28 Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 12 Bảng 3.1 Hàm lượng lipid tổng số trọng lượng khô VTBDD Schizochytrium XT41 phân lập từ RNM Xuân Thủy, Nam Định .20 Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng Schizochytrium XT41 20 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng Schizochytrium XT41 .22 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng Schizochytrium XT41.23 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ glucose đến sinh trưởng VTBDD Schizochytrium XT41 25 Bảng 3.6 Theo dõi trình lên men 26 Bảng 3.7 Thành phần acid béo VTBDD Schizochytrium XT41 29 Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học MỞ ĐẦU Ngày nay, xã hội phát triển càng cao, vấn đề chất lượng và an toàn thực phẩm ngày càng chiếm vị trí quan trọng.Tuy lĩnh vực sản xuất, kinh doanh và chăn nuôi gia cầm tồn nhiều vấn đề đáng lo ngại Thức ăn chăn ni được sử dụng chất kích thích tăng trưởng, hormone tăng trọng thúc đẩy sinh trưởng để tạo những sản phẩm "siêu nạc" Theo đó, lượng lớn hóa chất, kháng sinh tồn dư sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng Vì vậy, việc chủ động tìm nguồn dinh dưỡng thay thế bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để đảm bảo chất lượng thực phẩm là vô cần thiết Theo nhiều nghiên cứu, vi tảo có giá trị sử dụng khơng giới hạn thực phẩm sấy khô và thức ăn chăn nuôi Vi tảo có tốc độ sinh trưởng nhanh, suất tạo sinh khối cao, dễ ni trồng, cạnh tranh với đất nông nghiệp, đặc biệt giàu chất dinh dưỡng có khả tiêu hóa cao, đa phần là acid béo không no đa nối đôi (Polyunsanturated fatty acid - PUFAs) và carbohydrates ở dạng tinh bột, glucose, polysaccharides Trong số khác vi tảo được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi, loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) được sử dụng rộng rãi Một số loài VTBDD sản xuất nhiều ω-3 như: Thrautochytrium aureum, Schizochytrium spp., Crypthecodinium cohnii, Ulkenia spp., Amphidinium carterae và Labyrinthula spp., loài Schizochytrium cho sản lượng DHA cao nhất, đạt đến 138 mg/l/h Mặt khác, việc sử dụng VTBDD để sản xuất DHA có nhiều ưu điểm như: dễ dàng trì điều kiện nuôi cấy tối ưu và thuần, không bị ảnh hưởng bởi mùa vụ và khí hậu, có thể kiểm soát được trình sản xuất và chất lượng sản phẩm.Vì vậy, việc sàng lọc được vi tảo cho sản xuất thức ăn chăn nuôi là hết sức quan trọng Tuy nhiên, giá trị dinh dưỡng loại vi tảo này thay đổi tùy theo điều kiện môi trường và yếu tố ngoại cảnh nhiệt độ, độ mặn, ánh sáng Xuất phát từ thực tế tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium XT41 ứng dụng thức ăn chăn nuôi gia cầm " Với mục đích: xác địch điều kiện tối ưu cho Schyzochytrium sinh trưởng và phát triển Tách chiết được hợp chất quan trọng bổ sung vào thức ăn chăn ni PUFAs, Asthaxanthin Lê Đình Tương Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thức ăn chăn nuôi gia cầm 1.1.1 Tình hình thức ăn chăn ni gia cầm tại Việt Nam Trong 10 năm gần đây, chăn nuôi nước ta phát triển mạnh, với tốc độ tăng trưởng 6%/năm Theo thống kê Phịng Thức ăn chăn ni (Cục Chăn nuôi - Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn), giai đoạn 2002 - 2011, mức tăng trưởng trung bình sản lượng toàn ngành thức ăn chăn nuôi công nghiệp đạt khoảng 13,5%/năm Đây là minh chứng đáng mừng cho sự phát triển ngành chăn ni nói chung và chăn ni cơng nghiệp nói riêng nước ta [18] Hình 1.1 Chăn nuôi gia cầm [27] Nguyên liệu để sản xuất thức ăn chăn ni là ngơ, thóc, gạo, khoai, sắn chiếm từ 70-80% khối lượng thức ăn hỗn hợp, nhóm thức ăn giàu protein, khoáng chất, vitamin và amino acid chiếm 20-30% khối lượng thức ăn hỗn hợp gồm có lạc, cá, bột xương Trên thực tế, nguồn cung cấp nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi phong phú bao gồm sản phẩm khai thác nuôi trồng và sản phẩm phụ ngành cơng nghiệp thủy sản Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả cung ứng nguồn này đến ngành sản xuất thức ăn chăn ni nước Cụ thể, diện tích ngơ và sắn khó mở rộng thêm, đậu tương cho suất thấp, khơng có quỹ đất chun canh, diện tích vụ đơng khó mở rộng giá lao động nơng thơn tăng cao Chính vì nhiều năm qua, ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi nước ta phải phụ thuộc nhiều vào nhập khẩu Theo Cục Chăn nuôi, năm 2011, nước ta nhập khẩu xấp xỉ 8.9 triệu nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, tăng lần so với năm Lê Đình Tương Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học 2006 Trong đó, nhóm thức ăn giàu lượng ngô, lúa mỳ, cám mỳ là 3.86 triệu (chiếm khoảng 43%), thức ăn giàu đạm đỗ tương, khô dầu loại, bột cá, bột thịt xương chiếm gần triệu (khoảng 54%), thức ăn bổ sung khoảng 0.2 triệu (chiếm 3%) Riêng tháng đầu năm 2012 nước nhập 1.1 triệu ngô và 1.8 triệu lúa mỳ Việc phụ thuộc nhiều vào nguyên liệu nhập khẩu khiến cho giá thành sản xuất bị đẩy lên cao, doanh nghiệp buộc phải nhiều lần điều chỉnh giá bán sản phẩm, khiến cho thị trường thức ăn liên tục biến động [19] Một những giải pháp quan trọng là tìm nguồn nguyên liệu mới bổ sung lúa, ngô và giải quyết tình trạng phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu nhập khẩu Việc chủ động tối ưu hóa nguồn nguyên liệu nước để sản xuất và cung cấp nguồn thức ăn giàu protein là cần thiết Do nhu cầu sử dụng protein thức ăn cho gia cầm ngày tăng cao nên nhiều nguồn dinh dưỡng từ VTBDD với hàm lượng docosahexaenoic acid (DHA) và acid béo có chất lượng cao được xem xét để bổ sung vào chế độ ăn cho gia cầm 1.1.2 Sử dụng vi tảo biển dị dưỡng thức ăn chăn nuôi gia cầm Các vấn đề liên quan đến sức khỏe và an toàn thực phẩm gây áp lực đến việc tìm kiếm loại nguyên liệu tốt mở thị trường rộng lớn cho sinh khối vi tảo Ngoài việc cải thiện dinh dưỡng, bổ sung vi tảo vào thức ăn cịn có thể mang lại sức khỏe cho động vật Đây là nguyên liệu có thể thu hoạch quanh năm chúng có thể cung cấp nguồn nguyên liệu cho thị trường thức ăn chăn nuôi ổn định và an toàn Vi tảo là sinh vật thủy sinh có thể sản xuất tinh bột, dầu, protein, vitamin, sắc tố và chất hữu Chúng phát triển nhanh nhiều so với trồng vì không cần sử dụng lượng cho rễ, thân, Tuy không được cung cấp nhiều nguồn lượng ngày sinh khối chúng có thể tăng gấp lần Tảo có thể phát triển theo tất hướng nên tốn diện tích ni trồng, hecta ni trồng tảo có thể sản xuất lượng protein năm so với 21 hecta đậu nành 49 hecta ngô [24] Ở điều kiện phát triển hệ thống mở, hầu hết vi tảo tự dưỡng phải phụ Lê Đình Tương Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học thuộc chặt chẽ vào nguồn lượng ánh sáng để cố định CO tạo nguồn cung cấp carbon Tuy nhiên, hệ thống này gặp phải số nhược điểm lớn như: ánh sáng khuyếch tán không khắp hệ thống nuôi cấy, dễ nhiễm loại vi sinh vật khác hay sinh vật phù du Do đó, loại VTBDD với khả chuyển hóa trao đổi lượng từ hợp chất hữu đơn giản, và phát triển với số lượng tế bào cao trình lên men được xem xét để sản xuất sinh khối lớn, sử dụng trình lên men để làm giảm chi phí ni trồng Ước tính chi phí cho việc sản xuất 1kg sinh khối VTBDD thấp dollar so với chi phí sản xuất ở hệ thống quang sinh học đối với tảo tự dưỡng [26] VTBDD được sử dụng cho sản xuất DHA thương mại Cryptothecodinium cohnii thuộc ngành Dinophyta, và Schizochytrium spp., thuộc ngành Heterokonta Việc sử dụng loài khác thuộc chi Thraustochytrium và Ulkenia ngành Heterokonta với mục đích được nghiên cứu Tuy nhiên, nguồn gốc VTBDD là loài sống cộng sinh nên sinh khối khó thuần và lưu giữ Nguyên nhân là chưa có phương pháp phân lập tối ưu, ni giữ giống th̀n chủng điều kiện phịng thí nghiệm và quy trình cơng nghệ ni chưa thích hợp để đảm bảo nhân nhanh sinh khối từ giống ban đầu Hiện nay, ở Việt Nam, chủng giống tảo sử dụng ngành chế biến thức ăn chăn ni chủ ́u có nguồn gốc nhập ngoại, quy trình cơng nghệ ni trồng chưa thích hợp với điều kiện khí hậu nước nên hiệu đem lại chưa cao Do vậy, việc phân lập, định loại và sử dụng vi tảo làm thức ăn gặp nhiều khó khăn, chưa khai thác hết vai trò vi tảo chưa đáp ứng được nhu cầu thực tế 1.1.3 Nhu cầu sử dụng VTBDD Schizochytrium thức ăn chăn nuôi gia cầm Sử dụng vi tảo làm thức ăn chăn nuôi cho động vật được bắt đầu từ đầu những năm 70, ước tính có khoảng 30% sản lượng vi tảo thế giới được dùng cho sản xuất thức ăn chăn nuôi Một số nghiên cứu chỉ chất béo có VTBDD bao gồm: glycerol có khả este hóa acid béo no và khơng no, số khác có tầm quan trọng đặc biệt ω-3 và ω-6 Ngoài ra, tảo là nguồn cung cấp vitamin thiết yếu như: A, B1, B2, B3, B12, C, E, nicotinic acid, biotin, folic acid, và bantothinic acid, và giàu sắc tố chlorophyl (chiếm 0.5% đến 0.1% trọng lượng khô) và carotenoids (chiếm 0.1% đến 0.2% trọng lượng khô) Trong khẩu phần ăn Lê Đình Tương Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học gia cầm, có thể sử dụng 5-10% sinh khối vi tảo thay thế phần protein thông thường Chất béo cung cấp acid béo thiết yếu acid linoleic, acid linolenic và acid arachidonic Chất béo giúp hòa tan vitamin A, D, E và K, sắc tố để cho thể dễ hấp thu làm da và mỡ vàng, tăng màu vàng lịng đỏ trứng Gà được ni sinh khối vi tảo thì đặc điểm màu vàng da, lòng đỏ trứng được cải thiện đáng kể [4] Ngoài chất béo thức ăn có tác dụng làm giảm độ bụi giúp giảm thiếu bệnh đường hô hấp Khi bổ sung chất béo vào thức ăn cần ý bổ sung chất chống oxy hóa để bảo vệ axit béo không no, bảo vệ vitamin thức ăn Vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium là lựa chọn thay thế lý tưởng cho nguồn ω-3 truyền thống (dầu cá) chế độ ăn cho gà thịt Theo nhiều báo cáo, Schizochytrium khơng những giàu DHA, mà cịn khơng chứa chất độc hại khơng có khả gây bệnh Các phân tích hóa sinh cho thấy chủng Schizochytrium khơng có sự xuất loại độc tố tảo thông thường [17] Hàm lượng PUFA n-3 và DHA gà Broiler tăng từ 2.8 đến 4.0 lần ni với chế độ ăn có bổ sung 2.2% Schizochytrium Đối với gà mái đẻ trứng, chế độ ăn có bổ sung Schizochytrium với hàm lượng tương đương 165mg DHA/con/ ngày, hàm lượng DHA trứng tăng lên 135mg/trứng, tăng gấp lần so với trứng thường (28mg DHA/trứng) Ngoài ra, hàm lượng DHA trứng có thể tăng lên đến 220mg/ trứng đối với gà cho ăn Schizochytrium tương đương với 825mg DHA/con/ngày [14] 1.2 Vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium 1.2.1 Vị trí phân loại Thraustochytrids là nhóm sinh vật biển nguyên sinh, khơng có khả quang hợp bao gồm bảy chi: Althornia, Diplophrys, Elina, Japonochytrium, Thraustochytrium, Schizochytrium, Ulkenia, và khoảng 35 loài [6] Chúng sử dụng nitơ cho sự tăng trưởng và sử dụng carbon để tích lũy acid béo Trước kia, Thraustochytrids được xếp vào họ nấm bởi vì có khả sống dị dưỡng và có hình thái tương đối giống so với họ nấm, nhiên vài năm trở lại đây, dựa kết nghiên cứu gene và hệ protein, người ta thống Lê Đình Tương ... Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội 2.1.2 Máy móc và dụng cụ Sử dụng máy móc và dụng cụ có phịng Sinh học Tảo và phịng thí nghiệm thuộc Viện Vi sinh vật và Công. .. Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học 1.2.5 Một số nghiên cứu vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium Ở Việt Nam, năm 2005, Viện Công nghệ sinh học phân lập thành công loại vi tảo biển dị dưỡng... Tương Khóa luận tốt nghiệp 2014 Khoa Sinh Học Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thức ăn chăn ni gia cầm 1.1.1 Tình hình thức ăn chăn ni gia cầm tại Việt Nam Trong 10 năm gần đây, chăn nuôi nước