CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.1. Giới thiệu • Việc nuôi cấy in vitro mô và tế bào động vật đã được tiến hành hơn 100 năm nay. Việc này được sử dụng như là 1 phương pháp NC về đặc tính của TB động vật một cách độc lập, tách khỏi những biến đổi của hệ thống in vivo. Kỹ thuật này được thực hiện đầu tiên với các mẫu mô. • Từ những năm 1950 trở đi, các tế bào nuôi cấy tách rời bắt đầu được • Từ những năm 1950 trở đi, các tế bào nuôi cấy tách rời bắt đầu được sử dụng. • Các kiểu nuôi cấy: – Nuôi cấy cơ quan – Nuôi cấy mô – Nuôi cấy tế bào CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.1. Giới thiệu • Nuôi cấy cơ quan Nuôi cấy phôi hay cơ quan tách khỏi cơ thể +/ Thuận lợi – Chức năng sinh lí bình thường được duy trì – Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hoàn toàn – Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hoàn toàn +/ Bất lợi – Khó có thể nuôi cấy quy mô lớn – Phát triển chậm – Fresh explantation is required for every experiment. CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.1. Giới thiệu • Nuôi cấy mô Các mảnh của mô được phát triển trong môi trường nuôi cấy +/ Thuận lợi – Một số chức năng bình thường được duy trì – Có thể nuôi cấy quy mô lớn (nhưng khó tiến hành) – Có thể nuôi cấy quy mô lớn (nhưng khó tiến hành) +/ Bất lợi – Tổ chức ban đầu của mô mất CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.1. Giới thiệu • Nuôi cấy tế bào Mô được tách thành tế bào đơn, hầu hết là bằng enzyme, thành huyền phù tế bào được nuôi cấy in vitro như monolayer hay nuôi cấy huyền phù +/ Thuận lợi – Phát triển một dòng tế bào thuần chủng qua nhiều thế hệ – Có thể nuôi cấy quy mô lớn +/ Bất lợi – Tế bào mất một số đặc tính đã biệt hóa trong mô CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.1. Giới thiệu • Nuôi cấy tế bào CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.1. Giới thiệu CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.1. Giới thiệu • Tại sao cần nuôi cấy mô? +/ Nghiên cứu – Vượt qua các vấn đề trong nghiên cứu như: - Các tác động của các mô xung quanh - Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật - Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật – Giảm các động vật sử dụng +/ Sản xuất các sản phẩm thương mại – vaccine, antibody, hormone – Tế bào sử dụng cho cấy ghép CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.1. Giới thiệu CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.2. Các kiểu nuôi cấy tế bào a/ Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture) – Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu như • Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy • Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học) – Thuận lợi : – Thuận lợi : • Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in vivo. – Bất lợi: •Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các fibroblast •Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức •Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.2. Các kiểu nuôi cấy tế bào a/ Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture) – Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu như • Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy • Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học) – Thuận lợi : – Thuận lợi : • Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in vivo. – Bất lợi: •Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các fibroblast •Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức •Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn [...]... Hela-Epithelial BAE1-Endothelial CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.2 Các kiểu nuôi cấy tế bào • Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính: MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.3 Sinh học của tế bào nuôi cấy • Sự phát triển và tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc: –Trạng thái tự nhiên của tế bào – Môi trường nuôi cấy: - Cơ chất tế bào bám - Thành sinh...CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.2 Các kiểu nuôi cấy tế bào b/ Nuôi cấy thứ cấp – Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy – Thường chứa kiểu tế bào đơn – Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ – Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy: • Dòng tế bào • Dòng tế bào liên... cao – Kìm hãm tiếp xúc: tương tác tế bào – Các tín hiệu từ môi trường: p53 gene product CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.3 Sinh học của tế bào nuôi cấy • Nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa +/ Sự biệt hóa tế bào là quan trọng cho các chức năng tế bào bình thường +/ Nhân tố kích thích sự biệt hóa tế bào: – Mật độ tế bào cao – Tương tác tế bào -tế bào và tương tác tế bào- chất nền – Chất cảm ứng: hydrocortisone,... năng bám dính • Chuyển nhiễm – Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA) CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.2 Các kiểu nuôi cấy tế bào • Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính: –Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào) : Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma) – Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi: tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial,... trường nuôi - Thành phần của phase khí - Nhiệt độ nuôi - Tương tác tế bào -tế bào và tế bào- chất nền CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.3 Sinh học của tế bào nuôi cấy • Các nhân tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh tế bào: +/ Kích thích sự tăng sinh – Mật độ thấp (leaves the cell with free edge) – Các tín hiệu từ môi trường: các nhân tố phát triển +/ Ức chế sự tăng sinh – Giới hạn mật độ: mật độ tế bào cao... bào biểu mô cho sự tương tác tế bào -tế bào +/ Sự phân tách bằng enzyme tiêu hủy các phân tử bám dính và chất nền ngoại bào +/ Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng monolayer +/ Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăng sinh và biệt hóa CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.3 Sinh học của tế bào nuôi cấy • Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào +/ Tế bào thích hợp +/ Điều kiện... CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.3 Sinh học của tế bào nuôi cấy • Các nhân tố ảnh hưởng đến tính bám dính +/ Sự bám dính tế bào là cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hóa (signaling through cytoskeleton) +/ Các phân tử bám dính tế bào: –Tương tác tế bào -tế bào: CAMs, cadherins –Tương tác tế bào- chất nền: integrin, transmembrame proteoglycan +/ Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex) trong tế bào. .. O2 tự do • Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài - Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận - Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body) CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.3 Sinh học của tế bào nuôi cấy • Kĩ thuật vô trùng – Vi sinh vật là vấn đề nguy hại chính trong nuôi cấy tế bào – Ngăn ngừa sự nhiễm: - Kháng sinh - Cải thiện điều kiện PTN –... – Hệ đệm: hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4 Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu: hệ thống đệm bicarbonate/CO2; hệ đệm hóa chất: HEPES – Môi trường nuôi cấy thương mại như pH indicator : vàng (acid) hay hồng (alkali) –Áp suất thẩm thấu: tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.3 Sinh học của tế bào nuôi cấy • Phase lỏng +/ Thành phần của môi trường: –... bào liên tục CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.2 Các kiểu nuôi cấy tế bào +/ Dòng tế bào • Thường có đời sống hạn định, lão hóa sau một số lần cấy chuyền nhất định (chừng 30 lần phần chia) • Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ biệt hóa • Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng Master và ngân hàng làm việc để duy trì những dòng này trong thời gian dài +/ Dòng tế bào liên tục • Có thể . trọng cho các ch c năng tế bào bình thường +/ Nhân tố k ch th ch sự biệt hóa tế bào: – Mật độ tế bào cao – Mật độ tế bào cao – Tương tác tế bào-tế bào và tương tác tế bào -ch t nền – Ch t. • Có thể tăng sinh không hạn định • Ch ng thường là những tế bào chuyển dạng: – Tế bào từ khối u. – Nhiễm với các viral oncogenes – Xử lí hóa ch t (chemical treatments). • Bất lợi của những. lại rất ít các đặc tính in vivo. CH ƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.2. Các kiểu nuôi cấy tế bào Chuyển dạng (Transformation) và Chuyển nhiễm (Transfection) • Chuyển dạng – Cảm ứng thay đổi