ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  Chủ đề: CHẨN ĐOÁN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN (JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS) BẰNG KỸ THUẬT RT-LAMP (LOOP- MEDIATED ISOLATHERMAL AMPLIFICATION) Nhóm thực hiện: Giáo viên hướng dẫn: Nhóm 3 PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải Tp. Hồ Chí Minh, tháng 10/2009 MỤC LỤC I. Đặt vấn đề II. Tổng quan tài liệu 1. Định nghĩa bệnh VNNB 2. Virus VNNB 3. Phân bố virus VNNB 4. Chu trình lây nhiễm của virus VNNB 5. Đặc điểm bệnh VNNB 6. Giới thiệu kỹ thuật LAMP a. Khái niệm kỹ thuật LAMP b. Thiết kế mồi cho LAMP c. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP d. RT-LAMP e. LAMP phát hiện SNP f. Đọc kết quả III. Vật liệu và Phương pháp 1. Định tính virus VNNB a. Vật liệu b. Phương pháp c. Đọc kết quả 2. Định lượng virus VNNB d. Vật liệu e. Phương pháp và tính toán IV. Kết luận V. Tài liệu tham khảo I. Đặt vấn đề Theo thông báo của viện vệ sinh dịch tễ trung ương, mỗi năm có khoảng 3.000 trẻ em mắc bệnh viêm não, trong đó có từ 30-40% bị viêm não Nhật Bản. Bệnh viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) do muỗi truyền và phát triển mạnh vào mùa nắng nóng, phù hợp với điều kiện hoạt động của muỗi truyền bệnh nên thường gọi là bệnh viêm não mùa hè hay viêm não B. Viêm não Nhật Bản là bệnh do muỗi truyền virut gây bệnh, giống các bệnh nhiễm virus khác do muỗi truyền như sốt xuất huyết (Dengue fever), sốt vàng (Yellow fever) Hiện nay bệnh viêm não Nhật Bản chưa có thuốc đặc trị do vậy thường có tỷ lệ tử vong cao hoặc để lại di chứng nặng nề. Trong thập kỷ 1960 có nhiều trận dịch viêm não siêu vi được gọi là hội chứng viêm não cấp tính gọi tắt là hội chứng não cấp (HCNC), xảy ra tại hầu hết các địa phương ở miền Bắc, nhất là ở miền trung du và vùng đồng bằng châu thổ sông Hồng, có nơi tỷ lệ mắc bệnh hằng năm lên tới 6 - 10/100.000 dân với tỷ lệ tử vong từ 5,7% - 28,5% và siêu vi VNNB là tác nhân gây ra 50% - 70% HCNC. Tại miền Nam viêm não siêu vi xảy ra rải rác quanh năm, số mắc cao nhất vào năm 1980 với tỷ lệ 4,95/100.000 dân và tỷ lệ tử vong 27,46%, thưòng tập trung nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long vựa lúa của miền Nam, nơi có thói quen nuôi heo gần nhà. Chưa tiến hành nghiên cứu có hệ thống tại đây, nhưng qua kết quả báo cáo sơ bộ của bệnh viện lớn tại TP. HCM, từ 64% - 69% hội chứng não cấp nhập viện có tác nhân gây bệnh là virút VNNB, với tỷ lệ tử vong vào khoảng 16% (BS. Võ Công Khanh, 2007). Vì hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị bệnh VNNB và người bị bệnh VNNB có nguy có tử vong cao, nếu có điều trị khỏi bệnh thì cũng để lại những di chứng hết sức nặng nề về thần kinh. Do đó, để hạn chế những hậu quả do bệnh VNNB đem lại cần sử dụng kỹ thuật gene để chẩn đoán phát hiện sớm virus VNNB sớm ngay khi virus mới xâm nhâp vào cơ thể hay trong thời gian ủ bệnh. II. Tổng quan tài liệu 1. Định nghĩa bệnh VNNB Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh nhiễm trùng cấp tính gây ra bởi một loại siêu vi trùng thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào thần kinh, có tên là virút viêm não Nhật Bản. Virút lây truyền qua người nhờ trung gian của loại côn trùng tiết túc là muỗi. Bệnh có thể xảy ra rải rác hay thành dịch. Tùy theo mức độ và vị trí bị tổn thương tại hệ thần kinh trung ương (HTKTW), lâm sàng sẽ có biểu hiện triệu chứng của nơi bị xâm phạm như: viêm não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống hoặc bệnh cảnh phối hợp: viêm não màng não, viêm não màng não tủy sống (BS.Võ Công Khanh, 2007). 2. Virus VNNB Virus VNNB được xếp vào giống Flavivirus, họ Flavivudae, được tách từ họ Togavirudae. Hình cầu, nhân chứa ribonucleic acid (RNA), kích thước 45 - 50nm, bao quanh bởi cấu trúc hình khối gọi là capsid, phần vỏ giàu chất lipid (hình 1). Hình 1: virus VNNB Cấu trúc kháng nguyên của virus VNNB B có liên quan mật thiết với kháng nguyên của virus viêm não Murray Valley, virus viêm não West Nile, virus viêm não Saint Louis. Do vậy, ba virus viêm não này được xếp vào nhóm virus VNNB B (Phạm Sỹ Lăng – Nguyễn Thiện, 2004). Hình 2:các chủng virus VNNB 3. phân bố của virus VNNB Các virus trong nhóm virus VNNB phân bố và gây bệnh khắp nơi trên thế giới, riêng virus VNNB lưu hành rộng rãi ở các nước trong vùng Đông á, Nam Á, và Đông Nam Á trong đó có Việt Nam (hình 3). Hình 3: phân bố của virus VNNB và các virus trong nhóm VNNB 4. Chu trình lây nhiễm virus VNNB Virus VNNB được bảo tồn trong thiên nhiên do truyền sinh học từ động vật có xương sống này sang động vật có xương sống khác qua trung gian của côn trùng tiết túc hút máu là muỗi. Chim là vật chủ cơ bản của chu trình Chim - Muỗi trong việc duy trì virus VNNB trong tự nhiên, nhưng chưa có nghiên cứu rõ về vai trò quan trọng của chim trong việc truyền virus VNNB qua muỗi đến người. Hình 4: Đường lây truyền bệnh viêm não Nhật Bản Heo là vật chủ quan trọng nhất có khả năng làm lan rộng virus VNNB, và chu trình Heo - Muỗi tồn tại quanh năm. Người sống gần chu trình sinh thái tự nhiên này, có thể mắc bệnh khi bị muỗi đốt. Người được coi là vật chủ cuối cùng đối với virus VNNB vì virus trong máu người tồn tại trong thời gian ngắn với nồng độ thấp, nên không thể lây bệnh từ người này sang người khác qua muỗi đốt. 5. Đặc điểm của bệnh VNNB a. Phân bố theo mùa Khí hậu với những yếu tố nhiệt độ và mưa cũng có ảnh hưởng đến tình hình bệnh. Vào mùa mưa, ruộng lúa đầy nước tạo điều kiện tốt cho muỗi sinh sản và phát triển mạnh trong thiên nhiên, trùng hợp với thời điểm bệnh xảy ra nhiều. Vào mùa hè thời tiết nóng, ở nhiệt độ từ 27 0 C – 30 0 C, virus thường phát triển tốt trong cơ thể muỗi. Nếu dưới 20 0 C thì sự phát triển của virus dừng lại. Đó là lý do tại sao mô hình dịch tễ học lại khác nhau giữa hai miền Nam, Bắc Việt Nam. Tại Miền Bắc bệnh giảm nhiều vào những tháng lạnh, tăng vào những tháng hè và đỉnh cao vào tháng 5 - 6 - 7. Tại miền Nam, thời tiết nóng bệnh rải rác quanh năm (BS. Võ Công Khanh, 2007). b. Phân bố theo tuổi và giới tính Tất cả mọi lứa tuổi chưa có miễn dịch đều có thể mắc bệnh. Ở những vùng có bệnh VNNB lưu hành, trẻ em sớm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh nên tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ cao thường từ 2 - 10 tuổi, phần đông ở thể không triệu chứng lâm sàng, số lượng trẻ có kháng thể đặc hiệu tăng theo tuổi nên tỷ lệ mắc bệnh giảm ở trẻ lớn và người lớn. Người nước ngoài không phân biệt tuổi tác nếu chưa có miễn dịch đặc biệu đều có thể mắc bệnh khi đến vùng có VNNB lưu hành. Bệnh không liên quan tới giới tính tuy nhiên trong thực tế số bệnh nam thường nhiều hơn nữ. Tuy chu trình sinh thái của virus VNNB trong thiên nhiên không thay đổi, nhưng tình hình dịch tễ có biến đổi trước tác động của con người, như thay đổi lề lối canh tác và chăn nuôi, đô thị hóa, điều kiện kinh tế xã hội được nâng cao, sử dụng thuốc diệt trừ côn trùng trong canh nông, và cuối cùng là thuốc chủng ngừa VNNB đã được sử dụng (BS. Võ Công Khanh). 6. Giới thiệu kỹ thuật LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) a. Khái niệm kỹ thuật LAMP LAMP là kỹ thuật nhân bản acid nucleic đơn giản, nhanh, đặc hiệu và cho hiệu quả cao. LAMP được phát triển bởi công ty hóa chất Eiken, Nhật Bản. nó sử dụng bốn đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận diện 6 vùng trình tự trên acid nucleic đích và quá trình phản ứng thực hiện ở nhiệt độ không đổi từ 60 0 C – 65 0 C (thường 63 0 C), với thời gian phản ứng từ 30-60 phút nhanh hơn rất nhiều so với phản ứng PCR. thành phần phản ứng gồm: mẫu, 4 đoạn primer, DNA polymerase, dung dịch đệm, dNTP, tất cả các thành phần phản ứng cho vào một test tube và thực hiện phản ứng trong tủ ổn nhiệt. trong kỹ thuật này cả hai quá trình nhân bản và kiểm tra kết quả phản ứng chỉ trong một bước (Eikenchemical.com). Đặc điểm của kỹ thuật LAMP (Eikenchemical.com): • Không cần bước biến tính DNA sợi đôi thành sợi đơn. • Phản ứng khuếch đại thực hiện dưới một nhiệt độ không đổi. • Hiệu quả khuếch đại cực kỳ cao. • Sử dụng bốn đoạn mồi để nhận diện sáu vùng trình tự trên trình tự đích. • Giảm giá thành do không yêu cầu hóa chất đắt tiền và thiết tinh vi. • Trong sản phẩm khuếch đại có các vòng. • Có thể khuếch đại trình tự đích là RNA giống như DNA nhờ enzyme reverse transcriptase. b. Thiết kế mồi cho LAMP sở dĩ kỹ thuật LAMP có nhiều ưu điểm so với kỹ thuật PCR là do các mồi dùng trong kỹ thuật LAMP được thiết kế đặc biệt giúp cho sự biến tính, bắt cặp và nhân đôi DNA nhanh chóng. LAMP được thực hiện với bốn đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận ra sáu vùng trình tự khác nhau trên DNA đích bao gồm: Vùng F3c, F2c, F1c ở đầu 3’ và B1, B2, B3 ở đầu 5’. Hình 5: các mồi và vị trí gắn trên DNA đích Mồi được thiết kế tốt sẽ quyết định kết quả của phản ứng khuếch đại. Mồi được sử dụng trong LAMP đều được thiết kế và kiểm tra bằng phần mềm PrimerExplore là phần mềm đặc biệt được viết dành riêng để thiết kế mồi cho LAMP (Eikenchemical.com). c. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP sau khi DNA mẫu và các chất phản ứng được cho vào trong test tube sẽ được đưa vào trong tủ ổn nhiệt và giữ nhiệt độ không đổi từ 60 0 C - 65 0 C. Quá trình phản ứng bắt đầu qua các bước sau: bước 1: DNA sợi đôi bị mất trạng thái cân bằng khi nhiệt độ đột ngột lên 65 0 C nên sẽ bị tách ra thành hai sợi đơn DNA, một mồi gắn vào trình tự bổ sung trên DNA đích bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung nhờ enzyme DNA polymerase. Đối với kỹ thuật LAMP không cần bước biến tính DNA bằng nhiệt như PCR mà dựa vào việc tạo sợi đơn dựa vào mồi (hình 6). Hình 6: Bước 1 của kỹ thuật LAMP Bước 2: DNA polymerase thực hiện phản ứng tổng hợp sợi DNA bổ sung với sợi DNA đích, bắt đầu từ đầu 3’ của vùng F2 của FIP (hình 7). Hình 7: Bước 2 của kỹ thuật LAMP Bước 3: Primer F3 gắn vào vùng F3c và tổng hợp sợi bổ sung thay thế vị trí và giải phóng sợi bổ sung chứa FIP (hình 8). Hình 8: Bước 3 của kỹ thuật LAMP Bước 4: Một sợi đôi DNA được tổng hợp từ primer F3 và sợi DNA mẫu (hình 9). Hình 9: Bước 4 của kỹ thuật LAMP Bước 5: Sợi bổ sung gắn với primer FIP được giải phóng trở thành sợi đơn nhờ phản ứng thế chỗ của primer F3 khi tổng hợp sợi bổ sung. Khi ở dạng sợi đơn thì sợi này sẽ tạo thành cấu trúc vòng ở đầu 5’ do sự bổ sung của vùng F1 và F1c (hình 10). Hình 10: Bước 5 của kỹ thuật LAMP Bước 6: DNA sợi đơn ở bước 5 sẽ là sợi khuôn để cho primer BIP tổng hợp sợi bổ sung và sau đó primer B3 sẽ tổng hợp sợi bổ sung khác thế chỗ cho sợi có chứa primer BIP. Primer BIP gắn với đầu 3’ và khi tổng hợp sẽ làm cho cấu trúc vòng chuyển thành cấu trúc thẳng. Primer B3 cũng bắt đầu từ đầu 3’ nhưng gắn ở phía ngoài của primer BIP, DNA tổng hợp từ B3 sẽ thế chỗ và giải phóng sợi đơn có chứa primer BIP (hình 11). Hình 11: Bước 6 của kỹ thuật LAMP Bước 7: DNA sợi đôi được tạo ra từ bước 6 nhờ primer B3 (hình 12). Hình 12: Bước 7 của kỹ thuật LAMP Bước 8: DNA sợi đơn ở bước 6 sẽ tạo thành cấu trúc dạng vòng ở hai đầu nhờ trình tự bổ sung của vùng F1 với F1c của primer FIP và vùng B1c với B1 của primer BIP. Đây là cấu trúc khởi đầu cho chu trình khuếch đại DNA đích của kỹ thuật LAMP (hình 13). Hình 13: Bước 8 của kỹ thuật LAMP Bước 9-11: Cấu trúc DNA ở bước 8 sẽ nhanh chóng bị thay đổi do hoạt động tổng hợp của các mồi và DNA polymerase. Primer FIP sẽ gắn vào một vòng của DNA đích và tổng hợp sợi bổ sung và tạo sợi đơn DNA có chứa một vòng do sự bổ sung của vùng B1 và B1c (bước 9). DNA sợi đơn được giải phóng nhanh chóng tạo câu trúc như bước 8, cấu trúc này tiếp tục tham gia làm khuôn để tiếp tục tổng hợp DNA (bước 11). Hình 14: bước 9-11 của kỹ thuật LAMP d. RT-LAMP (reverse transcriptase LAMP) Kỹ thuật RT-LAMP cần phải tổng hợp c.DNA từ khuôn RNA và sử dụng kỹ thuật LAMP để khuếch đại và kiểm tra kết quả. Với khuôn là RNA nên thành phần các chất phản ứng ngoài các thành phần phản ứng của kỹ thuật LAMP (primer, DNA polymerase, dNTP, dung dịch đệm) còn có thêm enzyme reverse transcriptase trong thành phần phản ứng. Sau đó thành phần phản ứng được hòa trộn và đưa vào tủ ổn nhiệt giữ ở nhiệt độ từ 60-65 0- C. Các bước của kỹ thuật RT-LAMP tương tự như kỹ thuật LAMP cho DNA, nhưng có thêm bước tạo cDNA từ RNA như hình 15. Hình 15: Tổng hợp cDNA từ RNA e. LAMP phát hiện SNP (single nucleotide polymorphis) vì kỹ thuật LAMP có độ đặc hiệu cao nên chỉ có những trình tự DNA đích có độ tương đồng ở mức từng nucleotide mới được khuếch đại khi sử dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện các dạng SNP. Hơn nưa đặc điểm của phản ứng khuếch đại của LAMP có thể sự khác nhau một nucleotide trong chu trình khuếch đại cho cả sợi sene và anti-sene, và các dạng SNP có thể được phát hiện dễ dang, nhanh chóng bằng sự khuếch đại DNA có chứa SNP chỉ trong một phản ứng duy nhất. Phản ứng cho kết quả nhanh chỉ trong khoảng 30 phút. [...]... đường chuẩn để tính lượng virus VNNB trong mẫu Hình 25: Các bước thực hiện của kỹ thuật Real Time RT- LAMP IV Kết luận Như đã trình bày ở trên, kỹ thuật RT- LAMP nói riêng và kỹ thuật LAMP nói chung là kỹ thuật hứa hẹn sẽ được phát triển rộng rãi cho việc khuếch đại acid nucleic, cũng như chẩn đoán bệnh trực tiếp chỉ trong một bước phản ứng Đây có thể chính là kỹ thuật sẽ thay thế kỹ thuật PCR do những ưu... của virus VNNB bằng mắt thường và dưới tia UV 2 Định lượng virus VNNB a Vật liệu Vật liệu cho phản ứng RT- LAMP định lượng (Real Time RT- LAMP) cho virus VNNB tương tự như RT- LAMP định tính Điểm khác biệt ở đây là cần chuẩn bị chuẩn với các nồng độ khác nhau của virus VNNB để xây dựng đường chuẩn Để định lượng virus cần sử dụng máy đo độ đục Loopamp Real Time turbidimeter (LA-200; Teramecs, Nhật Bản) ... Đọc kết quả nhờ UV (a) và bằng mắt thường (b) Hình 18: Đọc kết quả trên bảng gel điện di Hình 19: Đường chuẩn dùng định lượng III Vật liệu và phương pháp 1 Định tính virus VNNB Bởi vì virus VNNB có bộ máy di truyền là RNA nên sử dụng kỹ thuật RT- LAMP cho việc định tính virus a Vật liệu Thiết kế mồi đặc trưng cho virus VNNB: Bốn đoạn mồi cho RTLAMP được thiết kế từ gene E của virus VNNB Trình tự của gene... móc đắt tiền… RT- LAMP định tính và định lượng là kỹ thuật hiệu quả cho việc chẩn đoán virus VNNB Cần nghiên cứu sâu hơn để xây dựng một quy trình chuẩn cho việc chẩn đoán virus VNNB V Tài liệu tham khảo - M M Parida, S R Santhosh, P K Dash, N K Tripathi, P Saxena1, Ambuj, A K Sahni1, P V Lakshmana Rao and Kouichi Morita, 2006; development and evaluation of reverse transcription Loop mediated isothermal... RNA bằng bộ kit QIAamp viral RNA mini kit (QIAGEN, Đức) Sử dụng ngay hay trữ ở -700C cho đến khi sử dụng Sử dụng bộ kit Loopamp RNA amplification kit (Eiken Chemical Co Ltd., Tokyo, Nhật Bản) để thực hiện phản ứng khuếch đại ở 630C trong 60 phút Nâng nhiệt độ lên 800C trong 2 phút để kết thúc phản ứng Hình 20: Sơ đồ thực hiện của kỹ thuật RT- LAMP để chẩn đoán VNNB c Đọc kết quả Đọc kết quả trên bản. .. model for testing japanese encephalitis Vaccines in rhesus monkeys - Noboru Inoue, Loop -Mediated Isothermal Amplification of DNA (LAMP) General Introduction - Norihiro Tomita, Yasuyoshi Mori, Hidetoshi Kanda & Tsugunori Notomi, 2008; Loop -mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products - BS Võ Công Khanh, 2007; Bệnh viêm não Nhật Bản - Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn... phải được kiểm tra kỹ để loại bỏ sự xâm nhiễm virus VNNB hoặc các loài thân thuộc từ bên ngoài Đối chứng dương là virus được nuôi trên tế bào C6/36 (dòng tế bào của ấu trùng muỗi Aedes albopictus) Các thành phần khác cho kỹ thuật RT- LAMP: Bst DNA polymerase and AMV reverse transcriptase, dNTP, Tris-HCl (ph 8.8), KCl, MgSO 4, (NH4)2SO4, Tween 20, betaine b phương pháp Tách RNA: RNA của virus được tách... khuếch đại không xảy ra Hình 16: nguyên lý của LAMP cho SNP f Đọc kết quả Kết quả sau khi khuếch đại bằng kỹ thuật LAMP có thể dùng để định tính hoặc định lượng Nếu chỉ cần định thì kết quả có thể đọc bằng mắt thường dựa vào màu của test tube sau khuếch đại, hoặc đọc dưới tia UV để hiện màu của chất phát huỳnh quang như SYBR green, hoặc cũng có thể đọc trên bảng gel điện di với nồng độ agarose 2% - 3%... detection of products - BS Võ Công Khanh, 2007; Bệnh viêm não Nhật Bản - Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Thiện và cs, 2004; Một số bệnh mới do virus ở gia súc và gia cầm nhập nội và biện pháp phòng trị - Viện kí sinh trùng sốt rét Quy Nhơn; Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật sinh học phân tử - Wikipedia.com.vn - Eikenchemical.com ... Komiya, 2006; Rapid detetion and quantification of Japanese encephalitis virus by Real-Time reverse transcriptase loop -mediated isothermal amplification - Narong Nitatpattana, Audrey Dubot-Pérès, Meriadeg Ar Gouilh, Marc Souris, Philippe Barbazan, Sutee Yoksan, Xavier de Lamballerie, and Jean-Paul Gonzalez, 2005; Change in Japanese Encephalitis Virus Distribution, Thailand - Boonyos Raengsakulrach, Ananda . CÔNG NGHỆ SINH HỌC  Chủ đề: CHẨN ĐOÁN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN (JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS) BẰNG KỸ THUẬT RT-LAMP (LOOP- MEDIATED ISOLATHERMAL AMPLIFICATION) Nhóm thực hiện: Giáo viên. xâm phạm như: viêm não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống hoặc bệnh cảnh phối hợp: viêm não màng não, viêm não màng não tủy sống (BS.Võ Công Khanh, 2007). 2. Virus VNNB Virus VNNB được. trung ương, mỗi năm có khoảng 3.000 trẻ em mắc bệnh viêm não, trong đó có từ 30-40% bị viêm não Nhật Bản. Bệnh viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) do muỗi truyền và phát triển mạnh vào