LÊ THỊ NGỌC SƯƠNG N N G G H H I I Ê Ê N N C C Ứ Ứ U U T T H H U U N N H H Ậ Ậ N N V V À À T T I I N N H H S S Ạ Ạ C C H H P P H H Y Y T T A A S S E E T T Á Á I I T T Ổ Ổ H H Ợ Ợ P P T T Ừ Ừ N N Ấ Ấ M M M M E E N N P P I I C C H H I I A A P P A A S S T T O O R R I I S S G G S S 1 1 1 1 5 5 Chuyên ngành: Hóa Sinh Mã số: 60 42 031 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH Thành phố Hồ Chí Minh – 2009 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy Hoàng Quốc Khánh, trưởng Phòng Vi Sinh Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa Học LÊ THỊ NGỌC SƯƠNG N N G G H H I I Ê Ê N N C C Ứ Ứ U U T T H H U U N N H H Ậ Ậ N N V V À À T T I I N N H H S S Ạ Ạ C C H H P P H H Y Y T T A A S S E E T T Á Á I I T T Ổ Ổ H H Ợ Ợ P P T T Ừ Ừ N N Ấ Ấ M M M M E E N N P P I I C C H H I I A A P P A A S S T T O O R R I I S S G G S S 1 1 1 1 5 5 Chuyên ngành: Hóa Sinh Mã số: 60 42 031 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH Thành phố Hồ Chí Minh – 2009 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy Hoàng Quốc Khánh, trưởng Phòng Vi Sinh Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, người đã đưa ra ý tưởng về đề tài này.Thầy luôn quan tâm, hướng dẫn, động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt luận văn này. Em xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn quý thầy cô Bộ môn Sinh hóa cũng như quí thầy cô Khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự nhiên Tp.Hồ Chí Minh, đã tận tâm truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt khóa học này. Tôi xin cảm ơn anh Ngô Đức Duy, em Đào Thị Thu Hiền, cán bộ nghiên cứu Phòng Vi Sinh Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, đã quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian làm luận văn. Em xin cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến, phòng Các Chất Có Hoạt tính Sinh học, cùng quý thầy cô ở Viện Sinh học Nhiệt đới, đã tận tính hướng dẫn và giúp đỡ em trong thời gian thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô. Cảm ơn các em Trinh, Vân, Phi, Linh, Lan cũng như các bạn cùng lớp đã luôn gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ mình trong thời gian qua. Với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn, con xin chân thành cảm ơn ông bà, cha mẹ hai bên đã luôn hết lòng yêu thương, chăm sóc, động viên, giúp đở và tạo điều kiện để con có thể hoàn thành tốt luận văn cũng như khóa học này. Cuối cùng, em xin cảm ơn ông xã, dù không phải lúc nào cũng ở gần bên, nhưng anh luôn thương yêu, động viên, tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn cũng như khóa học này. Anh luôn là chỗ dựa vững chắc cho em. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2009. Xin chân thành cảm ơn Lê Thị Ngọc Sương Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình và biểu đồ MỞ ĐẦU 1 Chương 1: Tổng quan tài liệu 3 1.1 Acid phytic 4 1.1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic 4 1.1.2 Chức năng sinh lý của acid phytic 5 1.1.3 Sự tạo thành, phân bố và hàm lượng của acid phytic trong tự nhiên 6 1.1.4 Tác động kháng dưỡng của acid phytic 7 1.2 Enzym phytase và phytase của Aspergillus ficuum 7 1.2.1 Định nghĩa 7 1.2.2 Lịch sử các nghiên cứu về phytase 8 1.2.3 Phân loại 9 1.2.3.1 Phân loại dựa trên nhóm phosphate đầu tiên bị enzyme tác động 9 1.2.3.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin 9 1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme phytase 10 1.2.4.1 Phytase từ động vật 10 1.2.4.2 Phytase từ thực vật 11 1.2.4.3 Phytase có nguồn gốc từ vi sinh vật 12 1.2.5 Đặc tính sinh hóa 15 1.2.5.1 Nhiệt độ và độ pH tối ưu 15 1.2.5.2 Trọng lượng phân tử 16 1.2.5.3 Cơ chất 17 1.2.5.4 Thành phần amino acid của phyA và phyB trong A. ficuum 18 Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh 1.2.6 Đặc điểm xúc tác của enzym phytase 18 1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 20 1.2.7.1 Ion kim loại 20 1.2.7.2 Canxi và tỷ lệ Canxi/phospho 21 1.2.7.3 Nồng độ cơ chất 21 1.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym phytase 21 1.2.8.1 Nguồn cacbon 21 1.2.8.2 Nguồn nitơ 22 1.2.8.3 Vitamin và các nguyên tố vi lượng 22 1.2.8.4 Tỷ lệ cacbon/photpho 23 1.2.9 Ứng dụng của enzym phytase 23 1.2.9.1 Ứng dụng trong nghiệp chế biến thức ăn gia súc, gia cầm 23 1.2.9.2 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 24 1.2.9.3 Ứng dụng trong công nghệ tổng hợp myo- inositol phosphate 25 1.2.10 Các nghiên cứu về phytase ở Việt Nam 26 1.3 Nấm men Pichia pastoris 27 1.3.1 Phân loại và đặc điểm chung 27 1.3.2 Những ưu điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 28 1.3.3 Biến dưỡng methanol ở P. pastoris 30 1.3.4 Sự tiết các protein ngoại lai 31 1.3.5 Biến đổi hậu dịch mã 32 1.3.6 Các chủng biểu hiện phổ biến 33 1.3.7 Các vector biểu hiện 34 1.3.8 Pichia pastoris GS115 đã biến nạp 35 Chương 2: Vật liệu & Phương pháp 38 2.1 Vật liệu 39 2.1.1 Nguyên vật liệu 39 Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh 2.1.2 Hóa Chất và môi trường 39 2.1.2.1 Hóa chất 39 2.1.2.2 Môi trường nuôi cấy 41 2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 42 2.2 Các phương pháp sử dụng 43 2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein: 43 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính phytase 45 2.2.3 Phương pháp chạy điện di SDS-PAGE 48 2.2.4 Phương pháp sắc ký lọc gel 52 2.2.5 Phương pháp thẩm tích (Dialyse) để loại muối 54 2.2.6 Phương pháp xác định hằng số Michaelis (K m ) 55 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 58 2.3.1 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase 58 2.3.2 Khảo sát các điệu kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy, lên men thu nhận phytase tái tổ hợp 59 2.3.2.1 Tỷ lệ giống 59 2.3.2.2 Thời gian nuôi cấy 60 2.3.2.3 Môi trường nuôi cấy 60 2.3.2.4 Lượng methanol bổ sung trong quá trình nuôi cấy 61 2.3.2.5 Nồng độ K 3 PO 4 bổ sung vào môi trường nuôi cấy 61 2.3.3 Ảnh hưởng của các tác nhân tủa 62 2.3.4 Xác định hiệu quả của quá trình nuôi cấy 62 2.3.5 Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 63 2.3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 63 2.3.5.2 Ảnh hưởng của pH 63 2.3.5.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại 64 2.3.5.4 Nhiệt độ tối ưu (t opt ) của enzym phytase thu nhận được 64 Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh 2.3.6 Tinh sạch enzym phytase thu được bằng phương pháp sắc ký lọc gel 64 2.3.7 Điện di SDS-PAGE 65 2.3.8 Khảo sát các đặc tính của phytase thu được sau khi qua sắc ký lọc gel 65 2.3.8.1 Khảo sát nồng độ cơ chất theo thời gian để tìm ra giá trị K m (hằng số Michaelis) của enzym 65 2.3.8.2 Xác định K m 65 2.4 Tóm tắt qui trình thu nhận phytase tái tổ hợp 66 Chương 3: Kết quả & Biện luận 67 3.1 Kiểm tra khả năng sinh phytase của các giống 68 3.2 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy thu nhận phyase 69 3.2.1 Khảo sát tỷ lệ giống cấy 69 3.2.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy 71 3.2.3 Khảo sát môi trường nuôi cấy 73 3.2.4 Khảo sát lượng methanol bổ sung mỗi 24 giờ trong quá trình nuôi cấy 75 3.2.5 Khảo sát nồng độ K 3 PO 4 bổ sung vào môi trường nuôi cấy 77 3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các tác nhân tủa lên hoạt tính phytase 80 3.4 Xác định hiệu quả nuôi cấy thu nhận phytase tái tổ hợp 82 3.5 Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 84 3.5.1 Khảo sát sự bền nhiệt của phytase tái tổ hợp 84 3.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH 87 3.5.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các ion kim loại 90 3.5.4 Xác định nhiệt độ tối ưu 92 3.6 Tinh sạch enzyme phytase thu nhận được 94 Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh 3.6.1 Chạy sắc ký với enzyme phytase tái tổ hợp thu nhận được, chưa qua loại muối 94 3.6.2 Chạy sắc ký với enzyme phytase tái tổ hợp đã qua loại muối 96 3.6.3 Xác định hiệu suất của quá trình sắc ký lọc gel 98 3.7 Điện di SDS-PAGE 100 3.8 Hằng số Michaelis (K m ) 103 Chương 4: Kết luận & Đề nghị 107 4.1 Kết luận 108 4.1.1 Các điều kiện liên quan đến quá trình nuôi cấy 108 4.1.2 Tác nhân tủa 108 4.1.3 Hiệu quả thu nhận phytase tái tổ hợp 108 4.1.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 109 4.2 Đề nghị 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 Chương 5: Phụ lục Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BMGY : Bufferred Glycerol-comlex Medium BMMY : Bufferred Methanol-comlex Medium CPE : Chế phẩm phytase tái tổ hợp thu nhận được ĐC : Mẫu đối chứng EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic acid HđC : Hoạt độ chung của phytase HđR : Hoạt độ riêng của phytase Hđmax : Hoạt độ tối đa M : Trọng lượng phân tử Phytase-PAI : Phytase thu nhận từ giống Pichia pastoris GS115 có mang gen phyAI Phytase-PB : Phytase thu nhận từ giống Pichia pastoris GS115 có mang gen phyB SDS : Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide gel electrophoresis TCA : Tricloroacetic acid TEMED : N,N,N ’ ,N ’ -tetramethylene ethylene diamine TK : Thử không TT : Thử thật YPD : Yeast extract Pepton Destrose YNB : Yeast Nitrogene Base DANH MỤC CÁC BẢNG Luận Văn Thạc Sĩ Mục Lục HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh Trang Bảng 1.1: Các loại thức ăn có hoạt tính phytase trên 100 đơn vị /kg 11 Bảng 1.2: Đặc tính phytase được thu nhận từ các nguồn khác nhau 14 Bảng 1.3: Kích thước phân tử của phytase từ các nguồn khác nhau 17 Bảng 2.1: Cách pha các dung dịch Albumin chuẩn để dựng đường chuẩn Albumin 44 Bảng 2.2: Nồng độ của các dung dịch photphate chuẩn 46 Bảng 2.3: Các bước thực hiện phản ứng enzyme 47 Bảng 3.1: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của phytase-PAI và phytase-PB theo tỷ lệ giống 69 Bảng 3.2: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của phytase-PAI và phytase-PB theo thời gian nuôi cấy 71 Bảng 3.3: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của phytase-PAI và phytase-PB theo môi trường nuôi cấy 73 Bảng 3.4: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của phytase-PAI và phytase-PB theo lượng methanol bổ sung mỗi 24 giờ 76 Bảng 3.5: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của phytase-PAI và phytase-PB theo nồng độ K 3 PO 4 bổ sung vào môi trường nuôi cấy 78 Bảng 3.6: Sự biến đổi hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ riêng của phytase-PAI và phytase-PB theo các tác nhân tủa 81 Bảng 3.7: Kết quả hiệu suất nuôi cấy của phytase-PAI và phytase-PB 84 Bảng 3.8: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PAI 85 Bảng 3.9: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PB 86 Bảng 3.10: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđmax của phytase-PAI và phytase-PB theo sự đổi pH 88 Bảng 3.11: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđ đối chứng của phytase-PAI tương ứng với các ion kim loại khác nhau 90 [...]... quan tài liệu đầu nghiên cứu để có thể thu nhận được nguồn phytase có hoạt độ cao hơn, có khả năng chịu nhiệt, pH, và các đặc tính khác, đó là nguồn phytase tái tổ hợp Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thu nhận và tinh sạch phytase tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris GS115 và xác định các đặc tính của enzyme này HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS Hoàng Quốc Khánh Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu... truyền 1971 – Nelson và cộng sự: cho ăn bổ sung trực tiếp phytase từ A niger NRRL3135 đối với gà trong các bữa ăn thử nghiệm và có hàm lượng nhất định 1984 – Dịch vụ nghiên cứu nông nghiệp của Trung tâm nghiên cứu phía nam, bộ phận nông nghiệp Hoa Kỳ, bắt đầu nghiên cứu cơ bản về phytase 1988 – Ullah: tinh sạch, mô tả và xác định thành phần, trình tự amino acid của gen phy A thu nhận từ A niger NRRL 3135... dòng phytase từ những nấm chịu nhiệt như M thermophila 1.2.5.2 Trọng lượng phân tử Hầu hết các phytase được biết cho tới nay đều ở dạng đơn phân bao gồm phytase nấm mốc (Wyss và cộng sự, 1999a, Ullah và Gibson, 1987, Dvorakova và cộng sự, 1997), phytase E coli và K terrigena phytases (Greiner và cộng sự, 1993; Greiner và cộng sự, 1997), và phytase của B subtilis (Shimizu, 1992) Tuy nhiên, một số phytase. .. nitơ khi lên men phytase từ Aerobacter aerogenes (Greaves và cộng sự, 1967), và K oxytoca dùng dịch chiết nấm men (1%) (Jareonkitmongkol và cộng sự, 1997) Nguồn nitơ vô cơ như amonium sulphate (0.1%) dùng sản xuất phytase từ Pseudomonas sp (Irving và Cosgrove, 1971), Enterobacter sp 4 (Yoon và cộng sự, 1996), và S castellii (Lambrechts và cộng sự, 1992) Sản xuất phytase từ B subtilis, Powar và Jagannathan... nguồn nitơ là dịch chiết nấm men (1%) và peptone (1%) (Sano và cộng sự, 1999) 1.2.8.3 Vitamin và các nguyên tố vi lượng : Bên cạnh nguồn cacbon và nitơ, một vài vi sinh vật cần bổ sung thêm các nguyên tố vi lượng và vitamin cho sự tăng trưởng và sản xuất phytase Sản xuất phytase từ nấm men, môi trường sàng lọc gồm có vitamin và các nguyên tố vi lượng (Galzy, 1964; Segueilha và cộng sự, 1992) Đối với... 1959 – Casida: tìm ra được 20 chủng nấm mốc từ đất có hoạt tính phytase 1962-1971: Tổ chức Khoáng sản và hóa học quốc tế, bước đầu thử nghiệm thương mại hóa phytase 1967 – Ware và Shieh: nhận bằng phát minh về acid phytic 1968 – Ware và Shieh: phân lập được hơn 2000 chủng có hoạt tính phytase Phân lập Aspergilluc niger NRRL 3135 và A ficuum và đã thu nhận gen phyA và phyB có hiệu suất cao nhất so với... nhau (alkaline phosphatase và phytase) Enzyme inositol hexakisphosphate dephosphorylase từ Paramecium có cấu trúc gồm sáu đơn phân (Freund và cộng sự, 1992) PhyA là đơn phân, PhyB là tứ phân Cả hai loại này thường được tách chiết thu nhận từ nấm sợi (Aspergillus niger) hay nấm men (Saccharomyces cerevisia, S pombe), trọng lượng phân tử từ 62 – 128 kDa PhyC thường được thu nhận từ E.coli Trọng lượng phân... enzyme giống phytase có nguồn gốc từ Paramecium (Freund và cộng sự, 1992) Phytase từ Kleibsiella sp và Rhizopus oligosus bị ức chế khi nồng độ cơ chất cao (Shaa và Parekh, 1990; Sutardi và Buckle, 1998) Phytase nấm mốc bị ức chế khi nồng độ cơ chất vượt quá 1mM (Ullah, 1998).[43],[44] 1.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase: 1.2.8.1 Nguồn cacbon: Nguồn cacbon và nồng độ... (Kim và cộng sự, 1998) Shieh và Ware, (1968), đã phân lập hơn 2000 vi sinh vật từ đất có khả năng sinh phytase Hầu hết các vi sinh vật chỉ sản xuất phytase nội bào, chỉ có 30 vi sinh vật sinh phytase ngoại bào, tất cả đều là nấm sợi: 28 loài thu c Aspergillus, 2 loài thu c Penicillium và 1 loài thu c Mucor Trong 28 loài thu c giống Aspergllus, có tới 21 chủng là A niger Trong khảo sát của Howson và Davis... glucose-6-phosphate, α và β-glycerolphosphate, 3-phosphoglycerate Chỉ một vài phytase có tính đặc hiệu cao đối với acid phytic như phytase Bacillus (Powar và Jagannathan, 1982, Shimizu, 1992) và alkaline phytase từ phấn hoa lily (Barrientos và cộng sự, 1994) Dựa trên cơ chất đặc trưng, phytase phân thành hai lớp, phytase với dãy cơ chất đặc trưng rộng (ví dụ như A fumigatus, M thermophila, E nidulans) và phytase . đa M : Trọng lượng phân tử Phytase- PAI : Phytase thu nhận từ giống Pichia pastoris GS115 có mang gen phyAI Phytase- PB : Phytase thu nhận từ giống Pichia pastoris GS115 có mang gen phyB SDS. phytase tái tổ hợp. Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thu nhận và tinh sạch phytase tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris GS115 và xác định các đặc tính của enzyme này. . nghiên cứu để có thể thu nhận được nguồn phytase có hoạt độ cao hơn, có khả năng chịu nhiệt, pH, và các đặc tính khác, đó là nguồn phytase tái tổ hợp. Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu