ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRANG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CADMIUM LÊN KIỂU PHÂN LOẠI VÀ TẦN SỐ SAI HÌNH NHIỄM SẮC THỂ Ở TẾ BÀO LYMPHO NGƯỜI CHIẾU BỨC XẠ GAMMA CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC MÃ SỐ: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN QUẾ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010 LỜI CẢM ƠN ! Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Quếø – trưởng phòng Công Nghệ Sinh học – Viện Nghiên cứu Hạt nhân – Đà Lạt, người thầy đã hết lòng tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và quan tâm rất nhiều để tôi có thể hoàn thành được luận văn. Cảm ơn các cô, chú, anh chò phòng Công Nghệ Sinh Học – Viện Nghiên cứu hạt nhân – Đà Lạt đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi vượt qua khó khăn trong công việc. Cảm ơn các thầy cô, anh chò phòng SĐH – Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ cho tôi trong quá trình học tập. Cảm ơn cha mẹ, gia đình và các bạn bè, đồng nghiệp đã hỗ trợ tinh thần cho tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành công việc, tiếp bước và thành công trong cuộc sống, sự nghiệp . Xin chân thành cảm ơn ! Luận văn Thạc só 1 Nguyễn Thò Phương Trang MỞ ĐẦU Sự ra đời của kỹ thuật nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi người năm 1960 được đánh giá là một trong ba chìa khoá mở ra sự phát triển về di truyền học, y học, miễn dòch học của thế kỷ XX. Với đặc điểm tồn tại không phân chia, tế bào lympho có khả năng bảo toàn sai hình nhiễm sắc thể trong suốt đời sống trong cơ thể, và cũng chính đặc điểm này đảm bảo sự tương đồng giữa tác động in vivo và in vitro. Năm 1982, Cơ Quan Năng Lượng Nguyên Tử Quốc Tế (IAEA) chọn kỹ thuật phân tích sai hình nhiễm sắc thể cho việc xác đònh liều lượng phóng xạ tác động lên cơ thể. Sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho cũng được sử dụng như một biomarker làm chỉ thò và đánh giá mức độ nhiễm bẩn độc môi trường. Sai hình nhiễm sắc thể được hình thành từ tổn thương phân tử ADN, như vậy bằng kỹ thuật phân tích kiểu sai hình có thể xác đònh được nguyên nhân nhiễm bẩn môi trường. Kiểu hình của sai hình nhiễm sắc thể phụ thuộc vào 3 quá trình sinh học: tổn thương phân tử ADN, phục hồi tổn thương và chu trình phân bào. Trong thực tế phân tích đònh lượng thì “nhiễu” luôn là khó khăn cần khắc phục, sự có mặt của các yếu tố ngăn cản phục hồi tổn thương phân tử ADN trong môi trường là một trở ngại đối với công tác đònh liều sinh học cũng như đánh giá mức độ nhiễm bẩn khác. Cadmi thuộc nhóm chất độc bền có khả năng tích lũy sinh học ( PBT – persistent, Bioaccumulative and Toxic chemical), được xếp vào loại hoá chất cực độc đối với con người. Cadmi được xác đònh là một mutagen, là thành phần nhiễm bẩn môi trường quan trọng, có khả năng gây tổn thương phân tử ADN và để lại những di chứng di truyền trong các vùng nhiễm bẩn. Số liệu khảo sát các cộng đồng dân cư nhiễm bẩn cadmi cũng như arsen cho số liệu không thống nhất Luận văn Thạc só 2 Nguyễn Thò Phương Trang và không có sự liên quan chặt chẽ với mức độ nhiễm bẩn, điều này đặt ra giả thiết cadmi chỉ là yếu tố “nhiễu” làm sai lệch số liệu do yếu tố khác gây nên. Nghiên cứu tác động phối hợp cadmi với chiếu bức xạ gamma nhằm vào các mục tiêu: MỤC TIÊU ĐỀ TÀI * Xác đònh khả năng mutagen, kiểu gây tổn thương phân tử ADN của cadmi. * Xác đònh mức độ ảnh hưởng của cadmi lên kiểu phân loại và tần số sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma. * Biện pháp xử lý số liệu đònh liều sinh học khi có “nhiễu”. * Cảnh báo nguy cơ độc hại kép của cadmi đối với các công việc tiếp xúc với các yếu tố độc di truyền như hoá chất thí nghiệm, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, đặc biệt là phóng xạ. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯC * Ảnh hưởng của các nồng độ cadmi lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm tế bào lympho nuôi cấy in vitro. * Ảnh hưởng của cadmi lên kiểu phân loại và tần số sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma. ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN VĂN Kết quả nghiên cứu tác động kép của cadmi lên tế bào lympho chiếu bức xạ gamma chưa có công trình công bố trước đó, kết quả này đã được đăng trong tạp chí ( Int. J. Low Radiation, Vol. 7, No. 2, 2010). MỤC LỤC Lời cảm ơn Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục chữ viết tắt Trang MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Phân tử ADN, nhiễm sắc thể, bộ nhiễm sắc thể người 3 1.1.1. Phân tử ADN 3 1.1.2. Nhiễm sắc thể (NST) 4 1.1.3. Bộ nhiễm sắc thể người 5 1.2. Các tác nhân gây tổn thương phân tử ADN 7 1.2.1. Tổn thương phân tử ADN do tia tử ngoại (UV) 8 1.2.2. Tổn thương phân tử ADN do bức xạ ion hóa 9 1.2.3. Tổn thương phân tử ADN do các tác nhân hóa học 10 1.3. Khả năng và các cơ chế phục hồi tổn thương phân tử ADN 11 1.4. Sai hình nhiễm sắc thể và cơ sở phân loại 13 1.4.1. Sai hình nhiễm sắc thể 13 1.4.2. Cơ sở phân loại và cơ chế hình thành sai hình nhiễm sắc thể 13 1.5. Tế bào lympho máu ngoại vi người và khả năng sử dụng kỹ thuật phân tích sai hình NST trong nghiên cứu tác động của mutagen và ứng dụng 20 1.6. Cadmi 21 1.6.1. Cadmi, sự nhiễm bẩn của cadmi cũng như các hoá chất nhóm PBT trong môi trường 21 1.6.2. Khả năng mutagen của cadmi cũng như các hoá chất nhóm PBT 22 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Đối tượng nghiên cứu 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi người 26 2.2.2. Phương pháp cố đònh tế bào, làm tiêu bản hiển vi 29 2.2.3. Thiết kế thí nghiệm xử lý cadmi, gamma 30 2.3. Phương pháp phân tích sai hình nhiễm sắc thể 35 2.4. Phương pháp xử lí số liệu 38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 40 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của cadmi (Cd 2+ ) lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm và sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho người phơi nhiễm in vitro liều đơn 40 3.1.1. Chỉ số phân bào nguyên nhiễm ở tế bào lympho xử lý cadmi liều đơn40 3.1.2. Sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho xử lý cadmi liều đơn 43 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của bức xạ gamma lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm và sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho người phơi nhiễm in vitro liều đơn. 44 3.2.1. Chỉ số phân bào nguyên nhiễm ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma44 3.2.2. Sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma 46 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của cadmi (Cd 2+ ) lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm và sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho người phơi nhiễm in vitro kết hợp chiếu bức xạ gamma 50 3.3.1. Chỉ số phân bào nguyên nhiễm ở tế bào lympho xử lý cadmi phối hợp với chiếu bức xạ gamma 50 3.3.2. Sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho xử lý cadmi phối hợp với chiếu bức xạ gamma 54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thiết kế các tổ hợp thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cadmi lên tế bào lympho in vitro. Bảng 2.2: Các tổ hợp thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng phối hợp của cadmi và bức xạ gamma lên tế bào lympho người. Bảng 3.1: Số liệu khảo sát chỉ số phân bào nguyên nhiễm của tế bào lympho trên hệ thống thử nghiệm máu toàn phần xử lý liều đơn cadmi. Bảng 3.2: Sự phụ thuộc của chỉ số phân bào nguyên nhiễm vào liều bức xạ gamma. Bảng 3.3: Tần số các kiểu sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma. Bảng 3.4: Số liệu khảo sát chỉ số phân bào nguyên nhiễm ở tế bào lympho xử lý phối hợp cadmi / bức xạ gamma. Bảng 3.5: Số liệu khảo sát tần số các kiểu sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho xử lý phối hợp cadmi và bức xạ gamma. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc xoắn kép của phân tử ADN. Hình 1.2: Cầu nối hydrogen giữa các cặp A – T và G – C. Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo và các mức độ nén của NST. Hình 1.4: Bảng phân nhóm bộ NST người. Hình1.5 a: Karyotype người nữ bình thường Hình1.5 b: Karyotype người nam bình thường. Hình 1.6: Các kiểu tổn thương phân tử ADN Hình 1.7: Các kiểu sai hình do tổn thương chuỗi đôi kép trên 2 NST. Hình 1.8: Các kiểu sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 3 NST. Hình1.9a: Các kiểu sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 2 vai của 1NST. Hình 1.9b: Các kiểu sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 1 vai của 1 NST. Hình 1.10: Các kiểu sai hình radical do SSB trên 2 NST trước pha S. Hình 1.11: Các kiểu sai hình radical do 2 đứt gãy đơn kép trên 3 NST . Hình 1.12: Các sai hình do đứt gãy đơn kép trên cùng vai của 1 NST . Hình 1.13a: Các kiểu sai hình NST do đứt gãy đơn kép trên 2 sợi đơn khác vai Hình 1.13b: Các kiểu sai hình NST do đứt gãy đơn kép trên 1 sợi đơn khác vai. Hình 1.14: Cadmi dưới dạng đơn chất. Hình 3.1: Biểu đồ chỉ số phân bào nguyên nhiễm của tế bào lympho máu ngoại vi xử lý đơn cadmi. Hình 3.2: Sai hình đa tâm phát hiện ở tổ hợp 3 Hình 3.3: Sai hình minute phát hiện ở tổ hợp 3 Hình 3.4: Sai hình đa tâm phát hiện ở tổ hợp 4 Hình 3.5: Sai hình minute phát hiện ở tổ hợp 4 Hình 3.6: Sai hình đa tâm phát hiện ở tổ hợp 7 Hình 3.7: Sai hình mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 7 Hình 3.8: Sai hình đa tâm phát hiện ở tổ hợp 10 Hình 3.9: Sai hình mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 10 Hình 3.10: Biểu đồ phân bố liều-hiệu ứng sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma. Hình 3.11: Biểu đồ chỉ số phân bào nguyên nhiễm in vitro ở tế bào lympho xử lý phối hợp cadmi với bức xạ gamma. Hình 3.12: Sai hình đa tâm kèm theo mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 5 Hình 3.13: Sai hình minute phát hiện ở tổ hợp 8 Hình 3.14: Sai hình chuyển đoạn phát hiện tổ hợp 11 Hình 3.15: Sai hình minute phát hiện ở tổ hợp 12 Hình 3.16: Sai hình vòng có tâm và mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 19. Hình 3.17: Sai hình đa tâm kèm theo mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 17 Hình 3.18: Sai hình mảnh không tâm phát hiện ở tổ hợp 20 Hình 3.19: Sai hình minute phát hiện ở tổ hợp 24 Hình 3.20: Biểu đồ tần số sai hình nhiễm sắc thể kiểu đa tâm (đỏ) và mảnh không tâm (sáng) ở các tổ hợp xử lý cadmi và bức xạ gamma. Hình 3.21: Hình vẽ mô tả các kiểu tổn thương phân tử ADN dẫn đến sai hình nhiễm sắc thể. [...]... nên kiểu sai hình (c); nếu liên kết xảy ra giữa 2 mảnh cuối sẽ tạo nên kiểu sai hình (d); nếu liên kết chỉ xảy ra giữa 2 mảnh không tâm sẽ có sai hình (e) và nếu liên kết xảy ra giữa mảnh trung tâm và mảnh có tâm sẽ hình thành sai hình kiểu (f) a b c d e f Hình 1.9b: Các kiểu sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 1 vai của 1 NST  Sai hình kiểu nhiễm sắc tử Sai hình kiểu nhiễm sắc tử là các kiểu. .. dụng nguồn tế bào đồng bộ hoá này trong việc phân tích cơ chế gây tổn thương phân tử ADN và ảnh hưởng của các hoá chất ức chế phục hồi tổn thương do các mutagen gây ra Giá trò của hiệu ứng sai hình NST ở tế bào lympho phụ thuộc vào thời gian của thế hệ tế bào Sai hình NST ở lần phân chia thứ nhất có giá trò biểu hiện tác động của ngoại cảnh lên cơ thể, có tính đònh lượng, sai hình NST ở lần phân chia... đôi phân tử ADN tự nó cũng có thể tạo nên các kiểu sai hình NST mà không qua quá trình tái liên kết Ở cấp độ NST, sai hình là các mảnh không tâm Ở cấp độ nhiễm sắc tử, sai hình là các đứt gãy nhiễm sắc tử  Sai hình kiểu nhiễm sắc thể Cơ chế hình thành sai hình NST được giải thích trên cơ sở thuyết tái hợp (breakage- reunion theory) và thuyết trao đổi (exchange theory) giữa các mảnh có “đầu dính” của. .. phóng xạ trong môi trường có thể làm tăng mức độ nguy hiểm của phóng xạ ngay cả ở những giới hạn liều được coi là an toàn Với kết quả phân tích kiểu và tần số sai hình NST ở tế bào lympho người xử lí As 3 và Pb 2 trước hoặc sau chiếu xạ gamma của nhóm Trần Quế, Mitsuaki Yoshida (2006) đã chỉ ra arsenic ở liều 0,05  g/ml (chuẩn an toàn cho nước uống của Việt Nam, WHO) có ảnh hưởng mạnh mẽ đến chỉ số phân. .. S sẽ hình thành sai hình kiểu NST; sau pha S sẽ hình thành sai hình kiểu nhiễm sắc tử [37] 1.4.2 Cơ sở phân loại và cơ chế hình thành sai hình nhiễm sắc thể  Tổn thương vô sắc (Gap) Nguyễn Thò Phương Trang Luận văn thạc só 14 Gap có kiểu hình là vạch vô sắc trên 1 hoặc cả 2 nhiễm sắc tử của NST Dưới kính hiển vi điện tử, “gap” vẫn còn sợi ADN Hiện nay, “gap” được coi là lỗi về sự duỗi xoắn các phân. .. kép ADN bởi các mutagen Tính đồng bộ pha của quần thể này là một đối tượng hiếm phục vụ công tác nghiên cứu các cơ chế biến đổi di truyền học dưới ảnh hưởng của môi trường lên cơ thể Ở tế bào lympho, sai hình NST được tích luỹ trong suốt đời sống của nó Đồng thời, khả năng biểu hiện hiệu ứng sai hình NST trong tình trạng in vitro không sai khác so với in vivo do sai hình NST ở tế bào lympho là loại hiệu... có thể kèm * Đặc điểm phân loại 3 cặp nhiễm sắc thể nhóm E: Gồm các cặp NST số 16, 17 và 18 Cặp 16 có đặc điểm tâm gần giữa, cặp 17 và 18 tâm lệch hơn cặp 16 * Đặc điểm phân loại 3 cặp nhiễm sắc thể nhóm F: Gồm 2 cặp NST số 19 và 20 Chúng dễ dàng được phân biệt với các cặp NST khác bởi kích thước bé và vò trí tâm động ở giữa * Đặc điểm phân loại 3 cặp nhiễm sắc thể nhóm G: Gồm các cặp số 21, 22 và. .. di truyền và y học [5], [8] Ở người bình thường, số lượng tế bào lympho trong cơ thể lên đến 2.1012, phân bố đều theo hệ thống máu ngoại vi khắp cơ thể, có thời gian sống khoảng 3.5 – 4 năm, có khi tới 20 năm Trong cơ thể, có đến khoảng 99% tế bào lympho luôn tồn tại ở pha Go của chu trình phân bào mà ở pha này tế bào bò mất khả năng phân chia, từ đó có thể tạo điều kiện để tích lũy các sai hình NST... thương phân tử ADN phải được đặt ra 1.4 Sai hình nhiễm sắc thể và cơ sở phân loại 1.4.1 Sai hình nhiễm sắc thể Sai hình NST là những biến đổi bất thường về đặc điểm karyotype Sự hình thành sai hình NST liên quan đến các đứt gãy trực tiếp hoặc gián tiếp của chuỗi đôi ADN và sự tái liên kết giữa các đầu mút bò mất các trình tự telomere [9], [10], [11], [33], [37] Kiểu sai hình NST được quyết đònh bởi 3... có ảnh hưởng mạnh mẽ đến chỉ số phân bào của tế bào lympho người Arsen không trực tiếp gây tổn thương phân tử ADN dẫn đến sai hình NST nhưng có khả năng làm sai lệch tần số các kiểu sai hình NST sau khi chiếu bức xạ gamma Điều này có nghóa, arsen là yếu tố gây nên sự bất ổn đònh về hiệu ứng sai hình NST do bức xạ Nhiều dung môi hữu cơ gốc benzen, một số hợp chất của arsen, cadmi, muối thiếc, muối chrom, . * Ảnh hưởng của các nồng độ cadmi lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm tế bào lympho nuôi cấy in vitro. * Ảnh hưởng của cadmi lên kiểu phân loại và tần số sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho. cứu ảnh hưởng của bức xạ gamma lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm và sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho người phơi nhiễm in vitro liều đơn. 44 3.2.1. Chỉ số phân bào nguyên nhiễm ở tế bào lympho. lympho chiếu bức xạ gamma4 4 3.2.2. Sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào lympho chiếu bức xạ gamma 46 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của cadmi (Cd 2+ ) lên chỉ số phân bào nguyên nhiễm và sai hình nhiễm sắc