Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ TUẤN VINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY GIẢO CỔ LAM (GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM THUNB). HỌ CUCURBITACEAE Ở BẮC KẠN LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC Thái Nguyên – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ TUẤN VINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY GIẢO CỔ LAM (GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM THUNB). HỌ CUCURBITACEAE Ở BẮC KẠN Chuyên nghành : Hoá hữu cơ Mã số : 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN QUYẾT TIẾN Thái Nguyên – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN  Các phương pháp sắc ký CC : Column Chromatography SKLM : Sắc ký lớp mỏng  Các phương pháp phổ MS : Mass Spectroscopy EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy ESI-MS : Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR : 1 H-Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR : 13 C- Nuclear Magnetic Resonance DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY : Correlated Spectroscopy HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation  Các lĩnh vực khác HIV : Human Immunodeficiency Virus đvC : Đơn vị Cacbon v/v : Thể tích/thể tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục chữ viết tắt dùng trong luận văn Mở đầu 1 Chương 1 Tổng quan 3 1.1. Cây Giảo cổ lam và sử dụng trong Y học cổ truyền 3 1.1.1. Mô tả thực vật 3 1.1.2. Một số bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường trong Y học cổ truyền. 6 1.2. Chi Gynostemma và thành phần hoá học của chúng 9 1.2.1. Giới thiệu về chi Gynostemma 9 1.2.2. Về thành phần hoá học. 11 1.2.2.1. Tecpenoit 11 1.2.2.1. Tecpenoit-glycosit 13 1.2.2.1. Flavonoit - Glycosit 26 Chương 2. Phần thực nghiệm 28 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 28 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 28 2.1.2. Phương pháp ngâm chiết 29 2.1.3. Phương pháp phân lập các hợp chất từ dịch chiết 29 2.1.4. Phương pháp nhận dạng cấu trúc hoá học các chất 29 2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 30 2.2.1. Dụng cụ, hoá chất 30 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3. THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ CÂY GIẢO CỔ LAM 31 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết 31 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 33 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol 33 2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit 33 2.3.2.3. Phát hiện các flavonoid 34 2.3.2.4. Phát hiện các cumarin 34 2.3.2.5. Định tính các glucosit tim 35 2.3.2.6. Định tính các saponin 35 2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT 37 2.4.1 Cặn dịch chiết n-hexan (GyH) 37 2.4.1.1. Stigmasterol 37 2.4.1.2. β-sitosterol . 38 2.4.2. Cặn dịch chiết etylaxetat.(GyE) 38 2.4.2.1. 3,3’ ,5-Trihydroxy-4’,7-dimetoxyflavon 39 2.4.2.2. Stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit 39 2.4.3. Cặn dịch chiết metanol.(GyM) 40 Chương 3. Thảo luận kết quả nghiên cứu 42 3.1. Nguyên tắc chung 42 3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) 42 3.2.1. Stigmasterol 43 3.2.2. β-sitosterol 44 3.2.3. 3,3’,5-Trihydroxy-4’,7-dimethoxyflavon 45 3.2.4. Stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit 53 3.2.5. 3, 5-Dihydroxy-4’,7-dimethoxyflavon-3’-O- [α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-[β-D-glycopyranosit] 53 Kết luận 64 Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận văn 65 Tài liệu tham khảo 66 Phụ lục 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 Mở đầu Nước ta có diện tích khoảng 330.000 km 2 . Đồi núi chiếm 3/4 diện tích trong đó núi cao trên 500 m chiếm 1/3 diện tích lãnh thổ. Khí hậu nhiệt đới gió mùa, có 2 mùa rõ rệt thay đổi theo địa hình. Nhiệt độ trung bình hàng năm trên 22 0 C, lượng mưa vào khoảng 1200 – 2800 mm, độ ẩm tương đối cao (trên 80%). Những đặc thù về điều kiện tự nhiên như vậy rất thuận lợi cho hệ sinh thái phát triển. Vì thế nước ta có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo số liệu thống kê mới nhất có trên 12000 loài, trong đó có trên 3200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong y học dân gian [4]. Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống của con người. Ngày nay, những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp cũng như ngành nông nghiệp, chúng được sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm… Ngày nay, ngành công nghệ tổng hợp hoá dược phát triển mạnh mẽ đã tạo ra các biệt dược khác nhau được sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh nhờ đó giảm tỉ lệ tử vong, nâng cao tuổi thọ. Tuy nhiên, vai trò của những thảo dược không vì thế mất đi chỗ đứng trong Y học. Nó vẫn tiếp tục được dùng làm nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất dẫn đường (lead-compounds) cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới đáp ứng cho việc điều trị các chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y (Ung thư, HIV, ). Trên cơ sở trên cho thấy, nguồn cây thuốc dân gian cũng như các bài thuốc của đồng bào dân tộc vẫn là kho tàng vô cùng quí giá để khám phá, tìm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 kiếm các loại thuốc mới có hiệu lực cao cho công tác phòng và chữa bệnh. Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần và cấu trúc hoá học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc. Từ đó, người ta có thể tạo ra các chất mới có hoạt tính sinh học cao hơn để làm thuốc chữa bệnh. Giảo cổ lam (tiếng Trung: 絞股藍) hay còn gọi là dây Lõa hùng, Trường sinh thảo, Thất diệp đảm (七葉膽), Ngũ diệp sâm (五葉蔘), Cổ yếm, Dần toòng, Thư tràng 5 lá, Cam trà vạn hoặc Nhân sâm phương nam với danh pháp khoa học là Gynostemma pentaphyllum thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) [2][3]. Người Trung Quốc từ lâu xem Thất diệp đảm này như thuốc trường sinh, bởi lẽ người dân ở tỉnh Quý Châu uống trà thất diệp đảm thường xuyên thì sống rất thọ. Cây này còn được gọi là nhân sâm phương Nam hay nhân sâm 5 lá, mặc dù thực tế loài này không có họ hàng gì với nhân sâm đích thực. Cây này cũng được dùng ở Nhật Bản với tên amachazuru, ở Hàn Quốc với tên gọi dungkulcha và nhiều nước khác. Ở Việt Nam, vào năm 1997 giáo sư Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện cây Thất diệp đảm trên núi Phan Xi Păng và được giáo sư Vũ Văn Chuyên xác định đúng là loại Gynostemma pentaphyllum. Thời gian gần đây, ở Việt Nam được chế biến thành trà túi lọc và dạng viên dùng điều trị tiểu đường rất tốt. Tuy nhiên, thành phần hóa học của cây này còn ít được nghiên cứu về cả trong và ngoài nước, mặc dù nó được sử dụng khá phổ biến trong Y học dân tộc. Do vậy, chúng tôi chọn cây này làm đối tượng nghiên cứu với tên đề tài: “Nghiên cứu thành phần hoá học cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyll Thunb.), họ Cucurbitaceae ở Bắc Kạn” Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chƣơng I TỔNG QUAN 1.1 Cây Giảo cổ lam và sử dụng trong Y học cổ truyền. 1.1.1 Mô tả thực vật. Giảo Cổ Lam có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum, thuộc chi Gynostemma, họ Cucurbitaceae, bộ: Cucurbitales, lớp Magloniopsida, ngành Magloniophta, giới Platae. Phân bố địa lí: Cây Giảo Cổ Lam mọc ở rải rác dọc khe suối, trên đá vôi, sa thạch, đất núi lửa, thường dưới tán rừng thưa hay trảng cây bụi. Trên độ cao từ 200 – 2.000m tại Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia, Triều Tiên, Philippin Việt Nam và một số nước châu Á khác [3]. Thuộc họ bầu bí, loại thảo dược có khả năng chống lão hóa và nhiều công dụng khác này còn được coi là "nhân sâm phương nam", vì loại thảo dược này được trồng tại miền núi vùng trung nam Trung Quốc. Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển: Cây hàng năm, thân thảo mảnh, leo nhờ tua cuốn đơn ở nách lá. Có cây đực và cây cái riêng biệt, với lá kép hình chân vịt, mép răng cưa với lông trắng. Lá có cuống chung dài 3-4 cm, phiến do 5-7 lá chét có răng, dài 3-9 cm, rộng 1,5-3 cm. Cụm hoa hình chùy mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, các cánh hoa xòe hình sao, ống bao hoa rất ngắn, cánh hoa rời nhau cao 2,5mm, nhị 5, bao phấn dính thành đĩa, bầu có 3 vòi nhụy. Quả khô hình cầu đường kính 5 – 9mm, có 2-3 hạt, khi chín có màu đen. Ra hoa tháng 7-8, quả tháng 9-10 [2],[3],[17]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Hình 2.1: Cây Giảo Cổ Lam ( Gynostemma pentaphyllum ) Một số tác dụng sinh học: [15][25]-[28] Năm 1976 cây Giảo cổ lam bắt đầu được nghiên cứu ở Nhật Bản. Việc phát hiện ra cây này là do tình cờ nghiên cứu một bộ lạc sống trên núi cao có tuổi thọ bình quân là 98 tuổi mà nguyên nhân do người dân sinh sống ở đây thường xuyên dùng cây này để uống. Các nghiên cứu về Giảo cổ lam vẫn đang được thực hiện tại nhiều nước như Trung Quốc, Hoa Kỳ, Đức, Italia Có thể liệt kê một số nghiên cứu điển hình như: - GS. Tan H., Liu Z.L.,Liu MJ. Chứng minh GCL có tác dụng kìm hãm sự tích tụ tiểu cầu, làm tan cục máu đông, chống huyết khối, tăng cường lưu thông máu lên não. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 - Lin, J.M., và cộng sự chứng minh GCL có tác dụng chống viêm gan, chứng cao huyết áp và chống ung thư. Có tác dụng chống viêm mạnh hơn Indomethacin. - Wang C. Và cộng sự chứng minh GCL kìm hãm sự phát triển của khối u mạnh. Trong một nghiên cứu mới nhất gần đây phối hợp giữa các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc, các nhà khoa học đã tách chiết được một hoạt chất mới trong cây Giảo cổ lam Việt Nam có tác dụng kháng tế bào ung thư. Thử nghiệm bước đầu trên sáu dòng tế bào ung thư cho kết quả khả quan. Nhất là ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt, phổi. Ở nước ta, nghiên cứu của GS.TS Phạm Thanh Kỳ cho thấy Giảo cổ lam chứa saponin cấu trúc triterpen kiểu khung dammaran mà trong đó có nhiều cấu trúc giống như saponin của nhân sâm và tam thất. Ngoài ra, nó còn chứa flavonoit là các chất có tác đa dụng sinh học như kháng viêm, chống ô xi hóa. Hơn nữa, nó cũng còn chứa nhiều amino axit tan trong nước, các loại vitamin và các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Se. Các thử nghiệm cho thấy Giảo cổ lam giúp hạ mỡ máu và huyết áp, hạ đường huyết, rất tốt cho tim mạch, giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, giảm béo. Giảo cổ lam giúp kìm hãm sự phát triển của khối u, điều trị chứng xơ vữa động mạch, chữa hen phế quản, viêm gan. Trong bối cảnh môi trường ô nhiễm, thực phẩm mất an toàn và công việc căng thẳng, con người có xu hướng sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên để giải độc cơ thể, nâng cao sức đề kháng, chống lại sự lão hóa, ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh. Giảo cổ lam là một lựa chọn tuyệt vời cho mục đích trên, nhất là đối với các bệnh mỡ máu, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch. Một điều đáng lưu ý là việc các nhà khoa học Việt Nam và Thụy Điển cũng tìm thấy một hoạt chất mới trong cây giảo cổ lam Việt Nam có tác dụng [...]... Tuy nhiên, thành phần hóa học của cây này còn ít được nghiên cứu về mặt hóa học cả trong và ngoài nước, mặc dù nó được sử dụng khá phổ biến trong Y học dân tộc Vì thế, Giảo cổ lam được chọn làm đối tượng nghiên cứu hoá thực vật Nhiệm vụ của luận văn là tìm hiểu một số thành phần hoá học có trong cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) được trồng tại xã Khang Ninh, huyện Ba Bể, tỉnh Bắc Kạn 2.1 ĐỐI... PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là Giảo cổ lam, cây tươi được thu hái 12/2009 tại Khang Ninh – Ba Bể - Bắc Cạn Mẫu Giảo cổ lam để nghiên cứu hoá thực vật đã được TS Đỗ Hữu Thư (Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum, thuộc chi Gynostemma, họ. .. Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 2 PHẦN THỰC NGHIỆM Cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum ) mới phát hiện tại Việt Nam nhưng đã được sử dụng khá nhiều trong các bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường Có một số công trình nghiên cứu về Giảo cổ lam nhưng những hiểu biết về thành phần hoá học và tác dụng dược lí của Giảo cổ lam vẫn còn chưa nhiều Mới đây, ở Việt Nam nó... miễn dịch, giải độc mạnh Trong cây giảo cổ lam có nhiều chất flavonoit có tác dụng chống lại sự lão hóa cơ thể, bảo vệ tế bào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 http://www.lrc-tnu.edu.vn Giảo cổ lam một dược liệu quý với rất nhiều tác dụng như: hạ mỡ máu, bảo vệ tim mạch, hạ đường huyết, hạ huyết áp [1] Saponin chiết xuất từ Giảo cổ lam ức chế sự hình thành và phát triển khối u một... 2 tháng Theo Võ Văn Chi ghi trong “Từ điển cây thuốc Việt Nam” Giảo cổ lam có vị đắng, tính hàn, có tác dụng tiêu viêm giải độc, ngừng ho và long đờm [2] Qua nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới, Giảo cổ lam có tác dụng điều chỉnh các rối loạn chuyển hóa của cơ thể như rối loạn mỡ máu, đường huyết, huyết áp, tim mạch Thành phần hoạt chất trong cây Giảo cổ lam rất đặc biệt, có nhiều saponin giống nhân... khả năng sinh dục và tăng cường sức đề kháng 1.2 Chi Gynostemma và thành phần hoá học của chúng 1.2.1 Giới thiệu về chi Gynostemma Theo Danh lục các loài thực vật Việt Nam, chi Gynostemma có 2 loài là: Gynostemma laxum (Wall) - Cổ yếm lá bóng, Gynostemma pentaphyllum (Thunb) - Cổ yếm Hiện nay, nước ta trồng Giảo cổ lam chủ yếu ở : Bắc Kạn, Lào Cai, Hà giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà Bình,...hạ đường huyết rất tốt (đặt tên là phanoside) Chất này chưa từng được công bố tìm thấy trong cây Giảo cổ lam mọc ở các nước khác, điều đó chứng tỏ chất lượng giảo cổ lam của Việt Nam có tính đặc hữu 1.1.2 Một số bài thuốc chữa bệnh đái tháo đƣờng trong Y học cổ truyền [21]-[24] Cho đến nay, Y học dân gian Việt Nam đã sử dụng khá nhiều bài thuốc, dược liệu để điều trị bệnh hiệu quả Dưới đây là... pentaphyllum, thuộc chi Gynostemma, họ Cucurbitaceae, bộ: Cucurbitales, lớp Magloniopsida, ngành Magloniophta, giới Platae 20 kg mẫu thân lá Giảo cổ lam tươi được sấy ở nhiệt độ 110 0C trong 10 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát rồi sấy ở nhiệt độ 50 0C 60 0C tới khi khối lượng không đổi (độ ẩm dưới 10%) thu được 2,0 kg mẫu khô Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 http://www.lrc-tnu.edu.vn... tìm thấy 5 loài có ở Việt Nam, hình thái của các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 http://www.lrc-tnu.edu.vn loài gần giống nhau 1.2.2 Về thành phần hoá học Từ các bộ phận các loài của chi Gynostemma, người ta đã phân lập được một số lớp chất như: tecpenoit, tecpenoit - glycosit và flavonoit 1.2.2.1 Tecpenoit [8][10][17] HO O OH HO 1 2 - -Gynogenin II - Phân lập pentaphyllum từ -... (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể Các số liệu thực nghiệm của các chất sạch được dùng xác định cấu trúc hoá học của chúng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2 DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1 Dụng cụ, hoá chất Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, . học dân tộc. Do vậy, chúng tôi chọn cây này làm đối tượng nghiên cứu với tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hoá học cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyll Thunb. ), họ Cucurbitaceae ở Bắc Kạn . ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ TUẤN VINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY GIẢO CỔ LAM (GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM THUNB) . HỌ CUCURBITACEAE Ở BẮC KẠN Chuyên. bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ TUẤN VINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY GIẢO CỔ