BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** LÊ DUY CƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG Chuyên ngành : Hóa sinh Mã số : 60.72.04 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ CHI MAI HÀ NỘI - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** LÊ DUY CƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thị Chi Mai – Trưởng khoa xét nghiệm Sinh Hóa – Bệnh Viện Nhi Trung Ương, phó trưởng khoa Kỹ Thuật Y Học- Trường Đại Học Y Hà Nội, người đã cho em nền tảng kiến thức trên con đường nghiên cứu khoa học và tận tình hướng dẫn em hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị ở Bộ môn Hóa sinh Trường Đại Học Y Hà Nội đã đã dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại bộ môn. Em xin chân thành cảm ơn đến các anh chị trong khoa xét nghiệm Hóa Sinh – Bệnh Viện Nhi Trung Ương đã nhiệt tình giúp đỡ em, và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em thực hiện và hoàn thành luận văn này. Xin cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, con xin gửi lòng biết ơn biết ơn bố mẹ, anh chị, mọi người thân yêu trong gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất để con vượt qua khó khăn trong học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp bác sỹ nội trú Trường Đại học Y Hà Nội. Hà Nội, ngày 04 tháng 11 năm 2013 Bác sỹ nội trú Lê Duy Cường LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Hà Nội, ngày 04 tháng 11 năm 2013 Học viên Lê Duy Cường MỤC LỤC 1.2.5.1. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG HPLC DẪN XUẤT TIỀN CỘT BẰNG 1-FLUORO- 2,4-DINITROPHENYL-5-L-ALANINE AMIDE (MARFEY’S REAGENT) 16 1.2. .2. SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION KẾT HỢP PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BẰNG ĐO DÒNG ĐIỆN TÍCH HỢP (INTEGRATED AMPEROMETRIC DETECTION) 17 1.2. .3. SẮC KÝ KHÍ MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH PROTEIN VÀ CÁC ACID AMI 18 1.2. .4. ĐO NỒNG ĐỘ ACID AMIN HUYẾT TƯƠNG T ONG DỊCH SIÊU LỌC BẰNG HPLC VỚI DẪN XUẤT TIỀN CỘT TỰ ĐỘNG BẰNG O-PHTHALDIALDEHYD 19 1.2.5.5. ĐIỆN DI MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH 4-HYDROXYPROLINE VÀ CÁC ACID AMIN KHÁC 21 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨ 22 2.1.1.1. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31 2.1.1.1. HÓA CHẤ 31 ỨU : 33 2.1.2.1. TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊ 33 ỂU 33 2.1.2.2. TIÊU CHUẨN LOI 33 IÊN CU2.2.1 . NGUYÊN LÝ K 34 G TẠODẪNXUẤT 36 2.2.2 . T HIẾT LẬP CÁC THÔNG SỐ CHO H 36 H SINH ỌC BẰNG UPLC 40 2.2.4.1 . KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN 40 N KHI ĐT ĐƯỢ R 2 ≥ 0,99 41 2.2.4.2 . KHẢ O SÁT GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (OQ)VÀ 41 THE CÔG THỨC: 41 LOD = X + 2SD 41 2.2. 41 42 THU HỒI THEO CÔNG THỨC: 42 TIÊU CHUẨN CHẤP NHẬN: THEO AOAC, ĐỐI 42 I ỒG ĐỘ CẤT PHÂN ÍCH Ở MỨC 42 10 - 6 - 10 -4 MOL/L , ĐỘ THU HỒI C 42 MỨ 80-10%. 42 [ 42 25 42 ] 42 2. 24 42 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AOAC Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa phân tích) AQC 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimyl carbamate ASTM American Society for Testing of Materials (Hiệp hội phép thử Mỹ) DAD Diod array detector (Detector mảng diod) CV coefficient of variation ( hệ số biến thiên) ECF Ethyl chloroformate FID Flame ionization detection (Phương pháp ion hóa hình ngọn lửa) FMOC-Cl 9-fluorenylmethyl-chloroformate GABA Gama amino butyric acid GC Gas chromatography (sắc ký khí) IPAD Integrated Pulsed Amperometric Detection (Phương pháp phát hiện xung dòng điện tích hợp) ISO International Standard Organization (Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) MPA 3-mercaptopropionic acid QC Quality control (Kiểm tra chất lượng) RLCHBS Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh SD standard deviation (độ lệch chuẩn) SSA 5-sulfosalicylic acid TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam UPLC Ultra high performance chromatography (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng) UV Ultraviolet (Vùng tử ngoại) Vis Visible (Vùng khả kiến) DANH MỤC VIẾT TẮT CỦA CÁC ACID AMIN 1-Methylhistidine (1MH) Cystathionine (Cyst) Norvaline (Nva) 3-Methylhistidine (3MH) Cystine (Cys) Derivation peak (Deri) Ornithine (Orn) α-Aminoadipic acid (AADA) Ethanolamine (EA) Phenylalanine (Phe) Alanine (Ala) γ-Amino-N-butyric acid (GABA) Phosphoserine (PSer) allo-Isoleucine (aIle) Glutamic acid (Glu) Phosphoethanolamine (PEA) α-Amino-N-butyric acid (AABA) Glutamine (Gln) Proline (Pro) Ammonia (NH 3 ) Glycine (Gly) Sarcosine (Sar) Anserine (Ans) Histidine (His) Serine (Ser) Arginine (Arg) Homocystine (HCys) Taurine (Tau) Asparagine (Asn) Hydroxylysine 1 (Hyl1) Threonine (Thr) Aspartic Acid (Asp) Hydroxylysine 2 (Hyl2) Tryptophan (Trp) β-Alanine (B-Ala) Hydroxyproline (HyPro) Tyrosine (Tyr) β-Aminoisobutyric acid (BAIB) Isoleucine (Ile) Urea Carnosine (Carn) Leucine (Leu) Valine (Val) Citrulline (Cit) Lysine (Lys) Creatinine Methionine (Met) DANH MỤC CÁC BẢNG 1.2.5.1. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG HPLC DẪN XUẤT TIỀN CỘT BẰNG 1-FLUORO- 2,4-DINITROPHENYL-5-L-ALANINE AMIDE (MARFEY’S REAGENT) 16 1.2.5.1. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG HPLC DẪN XUẤT TIỀN CỘT BẰNG 1-FLUORO- 2,4-DINITROPHENYL-5-L-ALANINE AMIDE (MARFEY’S REAGENT) 16 1.2. .2. SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION KẾT HỢP PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BẰNG ĐO DÒNG ĐIỆN TÍCH HỢP (INTEGRATED AMPEROMETRIC DETECTION) 17 1.2. .2. SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION KẾT HỢP PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BẰNG ĐO DÒNG ĐIỆN TÍCH HỢP (INTEGRATED AMPEROMETRIC DETECTION) 17 1.2. .3. SẮC KÝ KHÍ MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH PROTEIN VÀ CÁC ACID AMI 18 1.2. .3. SẮC KÝ KHÍ MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH PROTEIN VÀ CÁC ACID AMI 18 1.2. .4. ĐO NỒNG ĐỘ ACID AMIN HUYẾT TƯƠNG T ONG DỊCH SIÊU LỌC BẰNG HPLC VỚI DẪN XUẤT TIỀN CỘT TỰ ĐỘNG BẰNG O-PHTHALDIALDEHYD 19 1.2. .4. ĐO NỒNG ĐỘ ACID AMIN HUYẾT TƯƠNG T ONG DỊCH SIÊU LỌC BẰNG HPLC VỚI DẪN XUẤT TIỀN CỘT TỰ ĐỘNG BẰNG O-PHTHALDIALDEHYD 19 1.2.5.5. ĐIỆN DI MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH 4-HYDROXYPROLINE VÀ CÁC ACID AMIN KHÁC 21 1.2.5.5. ĐIỆN DI MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH 4-HYDROXYPROLINE VÀ CÁC ACID AMIN KHÁC 21 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨ 22 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨ 22 2.1.1.1. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31 2.1.1.1. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31 2.1.1.1. HÓA CHẤ 31 2.1.1.1. HÓA CHẤ 31 ỨU : 33 ỨU : 33 2.1.2.1. TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊ 33 2.1.2.1. TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊ 33 ỂU 33 ỂU 33 2.1.2.2. TIÊU CHUẨN LOI 33 2.1.2.2. TIÊU CHUẨN LOI 33 IÊN CU2.2.1 . NGUYÊN LÝ K 34 IÊN CU2.2.1 . NGUYÊN LÝ K 34 G TẠODẪNXUẤT 36 G TẠODẪNXUẤT 36 2.2.2 . T HIẾT LẬP CÁC THÔNG SỐ CHO H 36 2.2.2 . T HIẾT LẬP CÁC THÔNG SỐ CHO H 36 H SINH ỌC BẰNG UPLC 40 H SINH ỌC BẰNG UPLC 40 2.2.4.1 . KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN 40 2.2.4.1 . KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN 40 N KHI ĐT ĐƯỢ R 2 ≥ 0,99 41 N KHI ĐT ĐƯỢ R 2 ≥ 0,99 41 2.2.4.2 . KHẢ O SÁT GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (OQ)VÀ 41 2.2.4.2 . KHẢ O SÁT GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (OQ)VÀ 41 THE CÔG THỨC: 41 THE CÔG THỨC: 41 LOD = X + 2SD 41 LOD = X + 2SD 41 2.2. 41 2.2. 41 42 42 THU HỒI THEO CÔNG THỨC: 42 THU HỒI THEO CÔNG THỨC: 42 TIÊU CHUẨN CHẤP NHẬN: THEO AOAC, ĐỐI 42 TIÊU CHUẨN CHẤP NHẬN: THEO AOAC, ĐỐI 42 I ỒG ĐỘ CẤT PHÂN ÍCH Ở MỨC 42 I ỒG ĐỘ CẤT PHÂN ÍCH Ở MỨC 42 10 - 6 - 10 -4 MOL/L , ĐỘ THU HỒI C 42 10 - 6 - 10 -4 MOL/L , ĐỘ THU HỒI C 42 MỨ 80-10%. 42 MỨ 80-10%. 42 [ 42 [ 42 25 42 25 42 ] 42 ] 42 2. 24 42 2. 24 42 [...]... UPLC nhằm phân tích acid amin tự do trong các dịch sinh vật, phục vụ cho việc chẩn đoán, sàng lọc, theo dõi điều trị một số RLCHBS Để có thể áp dụng thiết bị UPLC vào phân tích acid amin tự do, cần phải đánh giá phương pháp trước khi đưa vào sử dụng Do đó chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu định lượng acid amin tự do trong máu và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng với hai mục tiêu:... Đánh giá quy trình định lượng acid amin tự do trong máu và nước tiểu bằng phương pháp UPLC 2 Ứng dụng kỹ thuật phân tích acid amin tự do trong máu và nước tiểu bằng UPLC ở một số bệnh nhi nghi ngờ rối loạn chuyển hóa 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Các phương pháp sắc ký 1.1.1 Lịch sử phương pháp sắc ký Cùng với quang phổ, sắc ký từ lâu đã trở thành một trong hai công cụ quan trọng và không thể thiếu... tách acid amin bằng nhựa trao đổi ion và định lượng chúng bằng cách sử dụng phương pháp dẫn xuất với ninhydrin Sau này, các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC được ứng dụng cho phân tích acid amin Một vài phương pháp sử dụng dẫn xuất hậu cột trong đó acid amin được tách bằng cột trao đổi ion, sau đó được dẫn xuất bằng ninhydrin, chất phát quang hoặc o-phthalaldehyde Một phương pháp khác được... giấy xác định lượng acid amin trong dịch chiết nào đ − Định lượng với độ chính xác cao: Thường dùng sắc ký lỏng hay sắc ký khí trên cột vì có khả năng phân tách các chất rất cao và có sự ổn định về mặt 7 kỹ thuật Trên cơ sở sắc ký đồ của mẫu thử có thể tính được một cách chính xác hàm ư ng chất nghiên cứu trong mẫu thử − Xác định độ tinh khiết của sản phẩm: Thường dùng sắc ký lỏng hay sắc ký khí trên... Các phương pháp phân tích acid ami 1.2.1 Lịch sử phân tích acid amin Phân tích acid amin có vai trò quan trọng trong nghiên cứu cấu tạo của protein nhờ xác định được thành phần và trình tự acid amin, xác định giá trị 12 dinh dưỡng của thực phẩm Phân tích acid amin tự do trong dịch sinh học giúp phát hiện sự thay đổi bất thường trong các bệnh ý, đặc biệt là bệnh lý chuyển hóa Nhìn lại lịch sử nghiên cứu. .. gian phân tích dài (120 phút/mẫu , hiệu năng thấp và đòi hỏi về bảo trì phức tạp nên kỹ thuật này trở nên không phù hợp với các phòng xét nghiệm Trong những năm gần đây, một phương pháp mới đã được ứng dụng để thay thế cho phương pháp sắc ký trao đổi ion: sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) So với sắc ký trao đổi ion, phương pháp UPLC có ưu thế vượt trội ở hiệu năng và rút ngắn được thời gian phân tích... acid amin máu của bệnh nhân viêm gan chưa rõ nguyên nhân Error: Reference source not found 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Định lượng acid amin tự do trong máu và nước tiểu là một công cụ quan trọng trong chẩn đoán và theo dõi các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh (RLCHBS) Đây cũng là một công cụ quan trọng để theo dõi tình trạng dinh dưỡng ở bệnh nhân được nuôi dưỡng bằng đường tĩnh mạch Sử dụng phân tích acid amin tự do. .. RLCHBS nhưng không được chẩn đoán xác định sớm đã dẫn đến những di chứng nặng nề Trên thế giới, định lượng acid amin tự do trong máu và nước tiểu đã được tiến hành từ những năm đầu thập niên 60 của thế kỷ XX Phương pháp phổ biến nhất được sử dụng là sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất hậu cột bằng ninhydrin Đây là phương pháp có ưu điểm rẻ tiền, dễ sử dụng Tuy nhiên, sắc ký trao đổi ion có nhược điểm là thời... nước tiểu Sự giảm nhẹ của các loại acid amin chỉ có thể phát hiện được trong máu Ngược lại, sự lắng đọng của các acid amin với ngưỡng lọc rất thấp của thận cũng như các khiếm khuyết vận chuyển ở thận sẽ để lại bằng chứng trong nước tiểu Ý nghĩa trong chẩn đoán của định lượng acid amin niệu và máu khác xa nhau: Ví dụ, tăng cystein, arginine, lysine và ornithin trong nước tiểu là tiêu chuẩn chẩn đoán cho... lượng phân tử của chúng Trên cơ sở sắc ký của các chất có trọng lượng phn tử chuẩn trong ùng điều kiện sẽ tính toán được trọng lượng của chất cần xác định − Tinh chế một chất: Nhờ khả năng phân tách rất ưu việt mà sắc ký trở thành một công cụ vô cùng hữu hiệu trong quá trình tinh chế một chất từ các nguồn khác nha 1.1 Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC Thuật ngữ siêu hiệu năng được dịch từ cụm từ viết . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** LÊ DUY CƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG Chuyên ngành. 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** LÊ DUY CƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG LUẬN VĂN. UPLC vào phân tích acid amin tự do, cần phải đánh giá phương pháp trước khi đưa vào sử dụng. Do đó chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu định lượng acid amin tự do trong máu và nước tiểu bằng