Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN QUANG MINH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ CHUA DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN QUANG MINH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ CHUA DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin cảm ơn phòng Đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam luôn quan tâm, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc tới TS. Lê Như Kiểu – Trưởng bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông hóa đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cô chú và các anh chị trong bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông hóa đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, góp ý và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian thực tập. Hà Nội, ngày 28 tháng 12 năm 2010 Học viên Trần Quang Minh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT ADN Axít deoxyribonucleic AO Acridine da cam ARN Axít ribonucleic Bp Base pair (cặp bazơ) rARN ARN riboxom C hc Các bon hữu cơ CFU Colony forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CT Công thức cs Cộng sự ĐC Đối chứng N ts Nitơ tổng số PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) P ts Phốt pho tổng số VSV Vi sinh vật VSVĐK Vi sinh vật đối kháng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1. Đặc tính sinh lý sinh hoá chính của vi khuẩn R.solanacearum 8 Bảng 2. Đánh giá độc tính vi khuẩn Ralstonia solanacearum 26 Bảng 3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn phân lập từ đất bệnh và cây bệnh 34 Bảng 4. Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được 44 Bảng 5. Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng R. solanacearum 45 Bảng 6. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng 47 Bảng 7. Kết quả định danh các chủng vi khuẩn đối kháng bằng chương trình NCBI BLAST 49 Bảng 8. Kích thước vòng đối kháng của các thể đột biến của chủng DM ở nồng độ xử lý AO 24 µl/ml 50 Bảng 9. Kích thước vòng đối kháng của các thể đột biến của chủng DM ở nồng độ xử lý AO 30 µl/ml 51 Bảng 10. Kích thước vòng đối kháng của các thể đột biến chủng BK ở nồng độ xử lý AO 24µl/ml 53 Bảng 11. Kích thước vòng đối kháng của các thể đột biến chủng BK 1 ở nồng độ xử lý AO 30 µl/ml 54 Bảng 12. Tác động của một số thể đột biến lên bệnh héo xanh cà chua trong điều kiện nhà kính 57 Bảng 13. Ảnh hưởng của một số thể đột biến đến khả năng sinh 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn trưởng và phát triển của cây cà chua giống HT7 khi 2 tuần tuổi Bảng 14. Kết quả thử độc tính của chế phẩm đối kháng trên chuột 59 Bảng 15. Kết quả xử lý thống kê trọng lượng chuột thí nghiệm 60 Bảng 16. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến mật độ và hoạt tính sinh học của hai thể đột biến 63 Bảng 17. Ảnh hưởng nhệt độ môi trường lên men đến mật độ và hoạt tính sinh học của hai thể đột biến 67 Bảng 18: Ảnh hưởng độ pH môi trường lên men đến mật độ và hoạt tính sinh học của hai thể đột biến 67 Bảng 19. Mật độ vi khuẩn đột biến trên nền chất mang khác nhau sau 6 tháng lưu giữ bảo quản 67 Bảng 20. Thành phần lý hóa của than bùn 69 Bảng 21. Thành phần lý hóa của bột bã mía 69 Bảng 22. Kích thước vòng đối kháng của các thể đột biến trong chế phẩm 71 Bảng 23. Một số tính chất hóa học và sinh học đất thí nghiệm (Mê Linh- Hà Nội) 73 Bảng 24. Khả năng phòng chống bệnh héo xanh cà chua của thể đột biến trên ruộng trồng tại xã Tiền Phong- Mê Linh- Hà Nội 74 Bảng 25. Ảnh hưởng của chế phẩm vi khuẩn đột biến đến năng suất cà chua tại xã Tiền Phong- Mê Linh- Hà Nội 76 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 1. Cây cà chua bị bệnh héo xanh do R. Solanacearum 39 Hình 2. Biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn ở lát cắt dọc đoạn thân cây cà chua 40 Hình 3. Một số hình thái khuẩn lạc đại diện cho vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua 41 Hình 4. Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn gây bệnh trên cà chua 43 Hình 5. Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn 46 Hình 6. Hoạt tính đối kháng của một số thể đột biến 52 Hình 7. Khả năng phòng trừ bệnh héo xanh của một số thể đột biến trong điều kiện nhà lưới 56 Hình 8. Hình ảnh chuột sau 4 tuần thí nghiệm 60 Hình 9. Hoạt tính đối kháng của các thể đột biến trong chế phẩm sau 6 tháng 72 Hình 10 Các giai đoạn bón chế phẩm vi sinh vật đột biến 74 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Cơ sở khoa học của đề tài 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 4. Mục tiêu của đề tài 3 5. Nội dung nghiên cứu 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tình hình gieo trồng cà chua ở Việt Nam và trên thế giới 4 1.2. Bệnh héo xanh cà chua 4 1.3. Mức độ phổ biến và gây hại của R. solanacearum 5 1.4. Vi khuẩn Ralstonia solanacearum 6 1.4.1. Hình thái và phân loại 6 1.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn R. solanacearum 8 1.4.3. Tính độc của Ralstonia solanacearum 9 1.5. Các con đường xâm nhiễm của vi khuẩn R. solanacearum 11 1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn R.solanacearum 11 1.6.1. Nhiệt độ không khí 11 1.6.2. Nhiệt độ đất 12 1.6.3. Cường độ chiếu sáng 12 1.6.4. Độ ẩm của đất 12 1.6.5. Ảnh hưởng của các loại đất 12 1.7. Biện pháp phòng trừ 13 1.7.1. Biện pháp hóa học 13 1.7.2. Biện pháp sinh học 13 1.8. Phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng phương pháp sinh học 14 1.8.1. Khái niệm 14 1.8.2. Lựa chọn tác nhân phòng trừ sinh học 15 1.8.3. Sử dụng tác nhân vi sinh vật trong phòng bệnh hại thực vật 15 1.9. Nghiên cứu đột biến 16 1.9.1. Khái niệm đột biến 16 1.9.2. Gây đột biến nhân tạo bằng tác nhân vật lý 17 1.9.3. Gây đột biến nhân tạo bằng tác nhân hoá học 17 1.10. Phương pháp phát hiện đột biến 19 1.10.1. Phương pháp đề kháng 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii 1.10.2. Phương pháp làm giàu chậm 19 1.10.3. Phương pháp làm giàu hạn chế 20 1.10.4. Phương pháp làm giàu nhờ penicilline 20 1.10.5. Phương pháp lọc 20 1.10.6. Trong phương pháp in 20 1.11. Mục đích tạo ra các thể đột biến 21 1.12. Ảnh hưởng của liều lượng và cường độ các chất gây đột biến 21 1.13. Thành tựu chọn tạo giống vi sinh vật bằng phương pháp đột biến 22 1.13.1. Một số thành tựu chọn tạo giống vi sinh vật bằng phương pháp đột biến trên thế giới và ở Việt Nam 22 II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Vật liệu 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua 25 2.2.1.1. Thu mẫu và phân lập vi khuẩn gây bệnh 25 2.2.1.2. Đánh giá tính độc của R. solanacearum 26 2.2.1.3. Nhận dạng vi khuẩn R. solanacearum bằng kỹ thuật PCR 27 2.2.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng 29 2.2.3. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn đối kháng 32 2.2.3.1. Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa 32 2.2.3.2. Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp tự gen phần tử 16S rARN 34 2.2.4. Phương pháp xử lý đột biến 35 2.2.5. Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh héo xanh cà chua của chế phẩm vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới quy mô nhỏ 36 2.2.6. Đánh giá tính an toàn của các chủng vi sinh vật đối kháng 37 2.2.7. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát bệnh héo xanh cà chua của chế phẩm vi sinh đối kháng ngoài đồng ruộng 37 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu 38 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn R.solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua 39 3.1.1. Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn gây bệnh 39 3.1.2. Thử nghiệm tính độc của các chủng R. solanacearum 42 3.1.3. Nhận dạng vi khuẩn R. solanacearum bằng kỹ thuật PCR 42 3.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với R. solanacearum từ mẫu cây và đất trồng cà chua 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii 3.2.1. Thu mẫu, phân lập vi khuẩn đối kháng 43 3.2.2. Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn 45 3.3. Nghiên cứu các hoạt tính sinh học và phân loại các chủng vi sinh vật đối kháng 47 3.3.1. Nghiên cứu các hoạt tính sinh học 47 3.3.2. Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp giải trình tự gen phần tử 16S rARN 48 3.4. Xử lý đột biến và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng cao nhất với vi khuẩn R. Solanacearum gây bệnh héo xanh bằng phương pháp đột biến 50 3.4.1. Xử lý đột biến và tuyển chọn các thể đột biến 50 3.5. Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh héo xanh cà chua của một số thể đột biến trong nhà lưới 55 3.6. Đánh giá tính an toàn của các chủng vi sinh vật đối kháng 58 3.7. Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh vật đột biến phòng trừ bệnh héo xanh cà chua 61 3.7.1. Giống vi sinh vật 61 3.7.2. Môi trường nhân giống 61 3.7.3. Nghiên cứu lựa chọn môi trường sản xuất 62 3.7.4. Một số yếu tố chính ảnh hưởng quá trình lên men thu sinh khối 64 3.7.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men vi khuẩn đột biến 64 3.7.4.2. Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men vi khuẩn đột biến 65 3.7.4.3. Nghiên cứu lựa chọn chất mang 69 3.7.4.4. Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn đột biến 70 3.7.4.5. Đánh giá hoạt tính đối kháng của các chế phẩm đột biến trong thời gian bảo quản 71 3.8. Đánh giá hoạt tính đối kháng của chế phẩm trong điều kiện ngoài đồng ruộng 72 IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 1. KẾT LUẬN 77 2. KIẾN NGHỊ 78 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 A. Phần tiếng Việt 79 B. Phần tiếng Anh 82 [...]... các chủng vi khuẩn đối kháng có hoạt tính sinh học cao, ổn định trong thời gian dài bằng phương pháp đột biến phục vụ sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng; 4 Mục tiêu của đề tài - Phân lập, tuyển chọn, lưu giữ và ứng dụng các chủng vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh héo xanh cà chua; - Sử dụng phương pháp đột biến nhằm tăng cường khả năng đối kháng bệnh héo xanh cây trồng của một số chủng vi. .. hiện đề tài: Ứng dụng phƣơng pháp đột biến nhằm tăng cƣờng khả năng đối kháng bệnh héo xanh cà chua do vi khuẩn Ralstonia solanacearum của một số chủng vi sinh vật đối kháng 2 Cơ sở khoa học của đề tài - Trước tình hình thực tế bệnh héo xanh một số cây trồng ở Vi t Nam và trên thế giới, cần phải có nghiên cứu cơ bản và hiệu quả để có những kết quả chính xác và khoa học về loài vi khuẩn R .solanacearum; ... vi sinh vật đối kháng; - Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh héo xanh của chế phẩm vi sinh đối kháng đột biến phòng chống bệnh héo xanh cà chua ở phạm vi phòng thí nghiệm, nhà lưới và đồng ruộng quy mô nhỏ; 5 Nội dung nghiên cứu 1 Phân lập và tuyển chọn một bộ sưu tập đa dạng các chủng vi khuẩn R .solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua; 2 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn đối kháng (VKĐK) với R .solanacearum. .. cứu khả năng sử dụng các vi sinh vật (VSV) trong phòng trừ bệnh héo xanh một số cây trồng; - Dựa vào khả sinh kháng sinh, một số chất hữu cơ hoặc khả năng cạnh tranh các vi chất trong môi trường của một số loài vi khuẩn, dẫn đến chúng có khả năng kìm hãm sinh trưởng và phát triển những loài vi khuẩn khác 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài -Cung cấp thêm số liệu, thông tin về bệnh héo xanh vi khuẩn. .. đất và mẫu cây cà chua; 3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng VKĐK; 4 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng cao nhất với vi khuẩn R .solanacearum gây bệnh héo xanh bằng phương pháp đột biến; 5.Đánh giá khả năng phòng chống bệnh héo xanh cà chua của chế phẩm vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới quy mô nhỏ 6 Đánh giá tính an toàn của các chủng vi sinh vật đối kháng; 7 Nghiên... của enzim thủy phân của vi sinh sinh vật đối kháng, tương tác giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật đối kháng, phương pháp có liên quan đến cây ký chủ 1.8.3 Sử dụng tác nhân vi sinh vật trong phòng bệnh hại thực vật Nhiều công trình nghiên cứu về tác nhân phòng trừ sinh học công bố từ đầu thế kỷ 20 trong đó có vi khuẩn đang là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ biến nhất là Pseudomonas spp, kế đến là... tác động lên nhiễm sắc thể gây nên các đột biến về số lượng, cấu trúc nhiễm sắc thể và các đột biến gen Các hóa chất gây đột biến có đặc điểm là có thể chỉ gây hiệu quả đột biến đối với một số lượng ít đối tượng Ví dụ kháng sinh Streptomycine chỉ gây đột biến ở tảo đơn bào và một số vi sinh vật, không gây đột biến trên nhiều đối tượng khác Các tác nhân gây đột biến hóa học có thể chia thành các nhóm... phương pháp gây đột biến nhân tạo đó tạo được hàng loạt chủng vi sinh vật có giá trị kinh tế cao - Chọn các thể đột biến tạo ra chất có hoạt tính cao VD: chiếu tia phóng xạ rồi chọn lọc đó tạo được các chủng nấm penicilin có hoạt tính tăng gấp 200 lần - Chọn các thể đột biến sinh trưởng mạnh để tăng sinh khối ở nấm men và vi khuẩn - Chọn những chủng vi sinh vật có đột biến giảm sức sống, không có khả. .. dần + Chọn các thể đột biến sinh trưởng mạnh để tăng sinh khối ở nấm men và vi khuẩn làm thức ăn chăn nuôi Chọn tạo các chủng vi sinh vật phân giải xenluloza, photpho khó tan, kali… cố định nitơ có hoạt lực cao ổn định làm phân bón, tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn bằng phương pháp đột biến cho hoạt lực đối kháng cao và ổn định để sử dụng trong Bảo vệ Thực vật Số hóa bởi Trung tâm... Ngoài các phương pháp nêu trên còn có các phương pháp chuyên biệt để phát hiện nhiều loài đột biến khác.Nhiều phương pháp chọn lọc đột biến được sử dụng cho vi c chọn lọc đột biến ở các tế bào nuôi cấy mô của sinh vật bậc cao 1.11 Mục đích tạo ra các thể đột biến + Chống chịu với các điều kiện bất lợi của tự nhiên như: nóng, lạnh, phèn, úng, hạn… + Kháng các độc tố của nấm, vi khuẩn + Có khả năng tổng . ứng dụng các chủng vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh héo xanh cà chua; - Sử dụng phương pháp đột biến nhằm tăng cường khả năng đối kháng bệnh héo xanh cây trồng của một số chủng vi. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ CHUA DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG . tài: Ứng dụng phƣơng pháp đột biến nhằm tăng cƣờng khả năng đối kháng bệnh héo xanh cà chua do vi khuẩn Ralstonia solanacearum của một số chủng vi sinh vật đối kháng . 2. Cơ sở khoa học của