Đang tải... (xem toàn văn)
Bia là loại nước uống đặc biệt có độ cồn thấp, hương thơm, bọt mịn và được rất nhiều người ưa chuộng. Trong quá trình lên mem bia, ngoài các sản phẩm chủ yếu là cồn và CO2 còn tạo rất nhiều sản phẩm phụ khác như rượu bậc cao, este, andehit, glyxerin... trong đó có diacetyl. Diacetyl là chất độc gây kìm hãm sự trao đổi chất, có ảnh hưởng đến sự sinh sản, độ lắng, độ đục… làm cho men tạo ra mùi vị lạ, khó chịu, gây đau đầu và ảnh hưởng đến hệ thần kinh của người tiêu dùng. Phương pháp GCMS kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) và tạo dẫn xuất với 1,2diaminobenzen có giới hạn phát hiện thấp cỡ nồng độ ppb và có độ chính xác cao. Do đó, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng diacetyl trong các loại bia bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ”
1 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG DIACETYL TRONG CÁC LOẠI BIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ Chuyên ngành: HÓA HỌC PHÂN TÍCH Người hướng dẫn khoa học Học viên thực hiện TS ĐẶNG VĂN KHÁNH HỒ THANH TUẤN Niên khoá: 2010 - 2012 2 Bia là loại nước uống đặc biệt có độ cồn thấp, hương thơm, bọt mịn và được rất nhiều người ưa chuộng Trong quá trình lên mem bia, ngoài các sản phẩm chủ yếu là cồn và CO2 còn tạo rất nhiều sản phẩm phụ khác như rượu bậc cao, este, andehit, glyxerin trong đó có diacetyl Diacetyl là chất độc gây kìm hãm sự trao đổi chất, có ảnh hưởng đến sự sinh sản, độ lắng, độ đục… làm cho men tạo ra mùi vị lạ, khó chịu, gây đau đầu và ảnh hưởng đến hệ thần kinh của người tiêu dùng Phương pháp GC/MS kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) và tạo dẫn xuất với 1,2-diaminobenzen có giới hạn phát hiện thấp cỡ nồng độ ppb và có độ chính xác cao Do đó, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng diacetyl trong các loại bia bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ” 3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN LÝ THUYẾT CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4 1.1 TỔNG QUAN VỀ DIACETYL Giới thiệu tính chất hóa lý của diacetyl và độc tính của nó Sự hình thành diacetyl trong quá trình lên men bia 1.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ Trình bày nguyên lý về GC/MS, một số bộ phận quan trọng trong máy GC/MS Giới thiệu về khối phổ, cơ chế phân mảnh 1.3 KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN (SPE) Tổng quan về phương pháp chiết pha rắn SPE, cơ chế hấp phụ và kỹ thuật tiến hành 5 2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (1) Lựa chọn các điều kiện tiến hành sắc ký khối phổ: cột tách, tốc độ khí mang, nhiệt độ interface, chương trình nhiệt độ lò, kiểu bơm mẫu (2) Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích qua các đại lượng như độ lặp lại, độ đúng, độ thu hồi, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Khảo sát chất lượng qui trình phân tích bằng cách so sánh phương pháp đang nghiên cứu với phương pháp chuẩn theo TCVN 6058:1995 (3) Áp dụng thực tế : áp dụng phương pháp đã lựa chọn để định lượng các loại bia hiện đang lưu hành trên thị trường Thừa Thiên Huế 6 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu Lấy mẫu ngẫu nhiên ở quầy, nhà hàng, các đại lý… mẫu được đựng trong chai hoặc lon kín có ngày sản xuất và được bảo quản nơi thoáng mát 2.2.2 Quy trình xử lý mẫu Lấy khoảng 10-50 mL mẫu thử cho vào cốc có mỏ có dung tích 125 mL, thêm khoảng 1-5 mL dung dịch 2,3-hexandion và 1-2 mL dung dịch 1,2-diaminobenzen, đun cách thủy 300C trong khoảng 15 phút, cho qua cột SPE đã được hoạt hóa, sau đó rửa giải bằng dung môi diclometan Dung dịch sau khi qua cột, được làm làm khô bằng khí N2 tới cạn Hòa tan cắn với dung môi etylaxetat, lọc qua màng lọc 0,45 µL và tiêm vào máy GC/MS 7 2.2.3 Nghiên cứu quy trình phân tích 2.2.4 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích * Xây dựng đường chuẩn * Độ lặp lại * Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 2.2.5 Đánh giá phương pháp nghiên cứu * Dùng chuẩn F (chuẩn Fisher) để so sánh độ lặp lại của hai phương pháp: phương pháp nghiên cứu và phương pháp chuẩn theo TCVN 6058:1995, * Dùng chuẩn t (chuẩn Student) để so sánh hai giá trị trung bình của phương pháp GC/MS với phương pháp đối chiếu: phương pháp chuẩn theo TCVN 6058:1995 8 3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 3.1.1 Lựa chọn cột tách Bảng 3.2 So sánh khả năng tách của 2,3-dimetylquinoxalin và 2metyl-3-n-propylquinoxalin trên hai cột DB-5MS và InertCap 5MS/Sil STT Loại cột Thời gian lưu Thời gian lưu của pic 2-metylcủa pic 2,33-ndimetylquinoxal propylquinoxali in (phút) n (phút) Hệ số tách 1 InertCap 5 MS/Sil 7,098 8,890 1,252 2 DB-5MS 9,013 11,117 1,233 9 Hình 3.1 Sắc đồ phân tích hỗn hợp trên cột InertCap 5MS/Sil Hình 3.2 Sắc đồ phân tích hỗn hợp trên cột DB-5MS 10 3.1.2 Khảo sát tốc độ dòng khí mang Sau khi lựa chọn cột DB-5MS để tiến hành phân tích và giữ nguyên ĐKTN như hình 3.2 Chúng tôi tiến hành tiêm hỗn hợp chuẩn đã được tạo dẫn xuất 2,3-dimetylquinoxalin và 2-metyl-3-npropylquinoxalin vào máy sắc ký khí ghép khối phổ với tốc độ khí mang lần lượt là 1,2; 1,5; 1,7 mL/phút Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3 So sánh khả năng tách của 2,3-dimetylquinoxalin và 2metyl-3-n-propylquinoxalin ở ba tốc độ dòng khác nhau Tốc độ dòng STT (mL/phút) Thời gian lưu của pic 2,3dimetylquinoxalin (phút) Thời gian lưu của pic 2-metyl-3-npropylquinoxalin (phút) Hệ số tách 1 1,7 8,608 9,052 1,052 2 1,5 9,047 11,097 1,226 3 1,2 10,605 12,749 1,202 14 Hình 3.7 Phổ Scan 1,2-dimetylquinoxalin và 2-methyl3nPropylquinoxaline Hình 3.8 (a) các mảnh phổ của hợp chất 2,3-dimetylquinoxalin (b)các mảnh phổ của hợp chất 2-metyl-3-n-propylquinoxalin 3.2 KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH DIACETYL VÀ 15 TẠO DẪN XUẤT SỬ DỤNG CỘT CHIẾT PHA RẮN (SPE) 3.2.1 Quá trình tách chiết - Hoạt hóa cột chiết : Cột chiết C18 có dung tích 3 mL, chứa 200mg pha rắn C18 đựơc hoạt hóa với 3 mL metanol/nước với tỉ lệ 9/1 (V/v) tiếp sau là 3 mL nước cất - Nạp mẩu vào cột : Mẩu được nạp vào cột với tốc độ được điều chỉnh bằng áp suất của bơm hút chân không đảm bảo tốc độ dòng khoảng 1mL/phút - Rửa giải : 3.2.2 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải hàm lượng diacetyl qua cột C18 Với lượng diacetyl ban đầu là 200 µg/L, sau khi tiến hành tạo dẫn xuất và cho qua cột C18 có thể tích là 3 mL để tiến hành khảo sát thể tích rửa giải khác nhau Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát thể tích dung môi diclometan rửa giải qua cột C18 Thể tích dung môi rửa giải (mL) 2 3 5 7 Lần 1 151,5 181.2 190.5 184.4 Lần 2 162.2 195.6 191.4 180.2 Lần 3 148,4 182.5 189.5 200.5 Trung bình 154,0 186,4 190,5 188,4 Độ thu hồi (%) 77,0 93,3 95,3 94,2 Lượng diacetyl thu hồi (µg/L )(n = 3) Hình 3.9 Hiệu suất thu hồi diacetyl ở các thể tích dung môi rửa giải khác nhau sau khi qua cột C18 16 17 3.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 3.3.1 Độ ổn định của hệ thống sắc ký Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.7 STT Nồng độ nghiên cứu Tỷ lệ diện tích pic 1 0,37 2 0,37 X (± SD) 3 4 20 µg/L 0,38 STT Nồng độ nghiên cứu Tỷ lệ diện tích pic 13 0,37 ± 0,01 RSD% = 1,71 0,69 14 X ( ± SD) 0,70 15 100 µg/L 0,69 0,37 16 5 0,36 17 0,70 6 0,37 18 0,68 7 0,53 19 1,07 8 0,54 20 1,08 9 0,53 10 50 µg/L 0,54 0,53 ± 0,01 RSD% = 0,97 21 22 200 µg/L 0,69 0,69 ± 0,01 RSD% = 1,09 1,05 1,06 11 0,53 23 1,07 12 0,53 24 1,04 1,06 ± 0,01 RSD% = 1,39 3.3.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 18 Thêm dung dịch diacetyl chuẩn 16,5 µg/L; 32,0 µg/L; 64,0 µg/L vào mẩu trắng Xử lý mẩu và tiến hành chạy sắc ký Tính trung bình của tỷ số chiều cao ứng với pic của hợp chất 2,3-dimetylquinoxalin so với chiều cao nhiễu đường nền của 3 lần làm song song tại mỗi nồng độ khảo sát Tại nồng độ có tỷ số S/N khoảng bằng 10 với RSD khoảng 20%, độ đúng nằm trong khoảng 80- 110% là LOQ của phương pháp và tỷ số S/N bằng 3 là LOD của phương pháp Tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần ở nồng độ 16,5 µg/L, từ kết quả thu được ở hình 3.10 và phụ lục 2 Chúng tôi xác định được LOD và LOQ của phương pháp là: LOQ = 16,5 µg/L và LOD = 5,0 µg/L PHỤ LỤC 2 Bảng số liệu phân tích giá trị S/N tại nồng độ 5 ppb 19 3.3.3 Khoảng nồng độ tuyến tính Kết quả được trình bày ở bảng 3.8 và hình 3.11 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của diacetyl trong bia STT Nồng độ diacetyl (µg/L) Tỷ lệ diện tích pic (2,3-dimetylquinoxalin/2-metyl-3-npropylquinoxalin) 1 20 0,37 2 50 0,53 3 100 0,69 4 200 1,07 5 500 2,25 Phương trình hồi quy y = 0,0039x +0,3073 R = 0,9995 y : tỷ lệ diên tích pic x : nồng độ diacetyl Hình 3.11 Đường biễu diễn mối tương quan giữa tỷ số diện tích 2,3-dimetylquinoxalin/2-metyl-3-npropylquinoxalin và nồng độ diacetyl trong bia 3.4 XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH 20 Từ các kết quả khảo sát đã nghiên cứu, chúng tôi xây dựng quy trình phân tích để định lượng diacetyl trong bia bằng phương pháp GC/MS như hình 3.12 20 mL mẫu bia 1 mL dung dịch 2,3-hexandion 1ppm Tạo dẫn xuất với 1,2-diaminobenzen - Cách thủy ở 300C trong 15’ SPE - Rửa giải bằng 5 mL CH2Cl2 - Thổi N2 tới cạn Cắn - Định mức 2 mL Etyl axetat 1 mL dung dịch Hình 3.12 Sơ đồ quy trình phân tích xác định diacetyl trong bia bằng phương pháp GC/MS GC/MS - Cột tách: DB-5MS - Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút - Nhiệt độ injectơ: 250oC - Nhiệt độ interface: 250oC - Điện thế detectơ: 1,2 kV - Nhiệt độ đầu 40oC (giữ đẳng nhiệt trong 1 phút); tăng 10oC/phút đến 200oC; tăng 20oC/phút đến 250oC (giữ đẳng nhiệt trong 5 phút) - Dải quét: 50÷500 amu 21 3.5 ÁP DỤNG THỰC TẾ 3.5.1 Kiểm soát chất lượng qui trình 3.5.1.1 Độ lặp lại và độ thu hồi Chuẩn bị các dung dịch chuẩn diacetyl cho vào mẩu trắng với 3 nồng độ 380 µg/L; 470 µg/L; 550 µg/L và dung dịch nội chuẩn 2,3-hexandion nồng độ 1000 µg/L Mỗi nồng độ làm song song 3 mẩu Tiến hành phân tích theo qui trình đã xây dựng Kết quả đuợc trình bày ở bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình phân tích Lượng thêm vào (µg/L) Lượng tìm thấy (µg/L)/Rev% RSD% (n = 3) Rev% 380,0 325,2 / 85,58 321,5 / 84,61 327,6 / 86,21 0,95 85,47 470,0 431,2 / 91,74 421,5 / 89,68 439,2 / 93,45 2,06 91,62 550,0 528,2 / 96,04 521,2 / 94,76 524,5 / 95,36 0,67 95,39 3.5.1.2 So sánh phương pháp nghiên cứu với phương pháp hiện hành theo 22 TCVN 6058-1995 (UV-Vis) Tiến hành phân tích hàm lượng diacetyl trong mẩu bia Hue beer Export (chi tiết về mẩu nêu ở bảng 3.11) bằng hai phương pháp: phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử X UV-Vis Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.10 1 2 Bảng 3.10 Kết quả phân tích diacetyl trong bia bằng phương pháp GC/MS và UV-Vis trong mẩu bia B30 GC/MS Mẩu Hàm lượng diacetyl (ppb) 1 48,5 2 48,2 3 48,7 4 48,3 5 49,0 Số liệu thống kê UV-Vis Hàm lượng diacetyl (ppb) Số liệu thống kê 47,7 X 1 = 48,5 S1 = 0,32 (n = 5) 49,9 50,2 48,6 48,5 X 2 = 49,0 S2 = 1,04 (n = 5) 23 * Nhận xét: 2 S 2 1, 042 - Ta có Ftính = 2 = = 10,56 > F (p = 0,05; f1= f2=4)= 6,39 S 0,322 1 Nên Hai phương pháp có độ lặp lại khác nhau với p < 0,05 Hay nói cách khác, phương pháp GC/MS có độ lặp lại tốt hơn phương pháp UV-Vis với p < 0,05 - Xét ttính = X1 − X 2 2 S12 S2 + n1 n2 = 1,03 và khi đó bậc tự do f được tính lại 2 2 S12 S 2 + n1 n2 ÷ −2 =5 f = 2 2 2 S12 S 2 ÷ ÷ n1 + n2 n1 + 1 n2 + 1 Do ttính = 1,03 < t (p = 0,05; f= 5) = 2,57 Nên kết quả trung bình của hai phương pháp tương đương nhau (p < 0,05) 3.5.2 Áp dụng thực tế 24 Áp dụng qui trình đã được xây dựng và thẩm định được để tiến hành định lượng một số mẩu bia đang lưu hành trên thị trường thành phố Huế (Chi tiết về mẩu nêu ở bảng 3.11) thu được kết quả ở bảng 3.12 Bảng 3.11 Thông tin chi tiết về các mẩu bia ST T Ký hiệu mẩu Tên mẩu 1 B25 Tiger beer 2 B26 3 Nồng độ cồn Ngày sản xuất 5% 01/08/2012 Huda beer extra 4,9% 06/02/2012 B27 Biere Larue export 4,5% 01/08/2012/SV 4 B28 Festival beer 4,5% 07/03/2012 5 B29 Corona extra (Mexico) 4,6% 05/03/2012 6 B30 Hue beer export 5% 10/12/2012 7 B31 Tiger crystal 4,6% 26/07/2012/AE 8 B32 Huda Beer 4,7% 19/02/2012 9 B33 Heineken 5% 04/08/2012/HE Bảng 3.12 Kết quả phân tích một số mẩu bia thực tế bằng GC/MS STT Ký hiệu mẩu Hàm lượng diacetyl (ppb) So sánh với mức qui định theo QCVN 6-3: 2010/BYT 1 B25 47,8 Đạt 2 B26 47,2 Đạt 3 B27 58,0 Đạt 4 B28 78,5 Đạt 5 B29 46,2 Đạt 6 B30 48,5 Đạt 7 B31 39,1 Đạt 8 B32 68,5 Đạt 9 B33 49,0 Đạt Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy: đã phát hiện được diacetyl trong các loại bia đang lưu hành trên thị trường Thừa Thiên Huế Song hàm lượng của chúng đều đạt yêu cầu so với quy định hiện hành của Bộ Y Tế (