Đang tải... (xem toàn văn)
MỤC LỤCMỞ ĐẦU1PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU21.1. Giới thiệu chung về đối tượng thí nghiệm21.1.1. Vai trò, vị trí của tảo Spirulina trong công nghệ sinh học (CNSH)21.1.2. Phân loại học41.1.3. Đặc điểm sinh học của Spirulina51.1.3.1. Đặc điểm hình thái51.1.3.2. Đặc điểm cấu tạo51.1.3.3. Đặc điểm sinh thái71.1.4. Đặc điểm sinh sản101.1.5. Thành phần dinh dưỡng của tảo Spirulina111.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina121.2.1. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina trên thế giới121.2.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina ở Việt Nam131.3. Các vấn đề trong nuôi tảo Spirulina platensis151.4. Mật rỉ (hay rỉ đường)171.5. Giới thiệu về hệ thống ánh sáng đèn Led trong nuôi cấy tảo18PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU212.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài212.1.1. Địa điểm212.1.2. Thời gian tiến hành đề tài212.2. Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm, hóa chất212.2.1. Vật liệu nghiên cứu212.2.2. Dụng cụ và thiết bị phục vụ thí nghiệm212.2.3. Hóa chất212.2.3.1. Môi trường Zarrouk212.2.3.2. Môi trường rỉ đường222.2.3.3. Các hóa chất chuyên dùng khác..222.3. Phương pháp nghiên cứu222.3.1. Phương pháp hoạt hóa giống được bảo quản trong Glycerol và đông khô tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học222.3.2. Quan sát hình dạng giống tảo hoạt hóa và giống tảo mua ở Phòng công nghệ Tảo viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam232.3.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy232.3.4. Khảo sát các loại ánh sáng ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển của tảo232.3.5. Khảo sát các phương pháp thu hoạch tảo Spirulina platensis242.3.5.1. Thu hoạch bằng phương pháp lọc thủ công242.3.5.2. Thu hoạch bằng phương pháp lọc có bơm chân không242.3.5.2. Thu hoạch bằng chất keo tụ và tuyển nổi242.3.5.3. Thu hoạch bằng phương pháp tự kết tủa242.3.5.4. Thu hoạch bằng phương pháp siêu âm242.3.6. Phương pháp đánh giá chất lượng tảo nuôi252.3.6.1. Định lượng chlorophyll252.3.6.2. Định lượng phycocyanin262.3.6.3. Định lượng protein theo phương pháp Bradford272.3.7. Phương pháp xác định trọng lượng khô của sinh khối282.3.8. Phương pháp thuần chủng giống tảo Spirulina platensis292.3.8.1. Thuần chủng bằng chiếu tia UV292.3.8.2. Thuần chủng bằng cấy chuyền nhiều lần trên môi trường thạch vô trùng 292.3.9. Khảo sát các phương pháp bảo quản giống302.3.9.1. Bảo quản giống trong môi trường lỏng và ở điều kiện bình thường của phòng thí nghiệm302.3.9.2. Bảo quản giống trong môi trường lỏng và ở tủ lạnh 40C302.3.9.3. Bảo quản giống bằng cấy chuyền trên môi trường thạch302.3.9.4. Bảo quản giống bằng glycerol và ở điều kiện lạnh sâu302.3.9.5. Bảo quản giống bằng phương pháp sấy đông khô30PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 313.1. Phương pháp hoạt hóa giống được bảo quản trong Glycerol và ở điều kiện lạnh sâu tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học313.2. Quan sát hình dạng, kích thước tảo Spirulina platensis313.2.1. Quan sát hình dạng giống tảo mới được hoạt hóa bằng kính hiển313.2.2. Quan sát mẫu tảo mua323.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy323.4. Khảo sát các loại ánh sáng ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của tảo363.5. Phương pháp xác định trọng lượng khô của sinh khối393.6. Khảo nghiệm các phương pháp thu hoạch413.6.1. Thu hoạch bằng phương pháp lọc thủ công413.6.2. Thu hoạch bằng phương pháp lọc có bơm chân không413.6.3. Thu hoạch bằng chất keo tụ và tuyển nổi423.6.4. Thu hoạch bằng phương pháp tự kết tủa433.6.5. Thu hoạch bằng phương pháp siêu âm443.7. Phương pháp đánh giá chất lượng tảo nuôi503.7.1. Định lượng chlorophyll503.7.2. Định lượng phycocyanin513.7.3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford523.8. Kết quả thuần chủng giống tảo553.8.1. Phương pháp chiếu tia UV553.8.2. Phương pháp cấy chuyền trên môi trường thạch Zarrouk vô trùng.563.9. Khảo sát các phương pháp bảo quản giống573.9.1. Bảo quản giống trong môi trường lỏng và ở điều kiện bình thường của phòng thí nghiệm572.3.9.2. Bảo quản giống trong môi trường lỏng và ở tủ lạnh 40C582.3.9.3. Bảo quản giống bằng cấy chuyền trên môi trường thạch592.3.9.4. Bảo quản giống bằng glycerol và ở điều kiện lạnh sâu592.3.9.5. Bảo quản giống bằng phương pháp sấy đông khô60KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ40TÀI LIỆU THAM KHẢO42
Đồ án tốt nghiệp 1 MỞ ĐẦU Trong những năm cuối cùng của thế kỉ 20, các nhà sinh học đã phát hiện ra các nhóm sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh. Vi tảo (Microalgae) là những sinh vật bậc thấp có trong sự chú ý đó vì chúng không chỉ có những cơ chế đặc thù mà còn sinh trưởng và phát triển cực kì nhanh. Hàng năm có 200 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo thành trên toàn thế giới, trong số đó 170- 180 tỉ tấn là do tảo tạo thành. Vi tảo chiếm 1/3 sinh khối của thực vật trên trái đất. Cho đến nay hàng loạt các công nghệ nuôi trồng, thu hoạch, chế biến sinh khối vi tảo, các loại công nghệ này đang không ngừng được hoàn thiện, hạ giá thành và nâng cao chất lượng sinh khối, mặt khác sử dụng vi tảo đang được mở rộng trong các lĩnh vực như dùng làm thức ăn bổ dưỡng cho người và thức ăn cho động vật, đặc biệt là các ngành nuôi trồng thủy sản, nguồn phân bón sinh học, năng lượng sạch, các hóa chất trong công nghiệp và dược phẩm, xử lý môi trường. Tuy ở nước ta đã có nhiều nghiên cứu về loại tảo này nhưng quy mô ứng dụng còn chưa rộng. Hiện tại ở Đà Nẵng vẫn chưa có cơ sở nào sản xuất sinh khối để phục vụ cho các ngành thực phẩm và y học, sở dĩ như thế là do thành phần môi trường nuôi cấy còn sử dụng quá nhiều hóa chất nên môi trường nuôi cấy đắt, do đó kém kinh tế dẫn đến chi phí đầu tư cao, các điều kiện để nuôi cấy cũng chưa tốt nhất và phương pháp thu nhận sinh khối tảo chưa được triệt để, hiệu quả chưa cao. Ngoài ra, cũng chưa có phương pháp bảo quản giống tốt trong một thời gian dài để chủ động được nguồn giống để giảm chi phí sản xuất cho những đợt sau. Trước những lý do như thế chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo Spirulina platensis”. Nhằm mục đích tìm ra môi trường ít thành phần hóa chất, rẻ tiền, phương pháp thu hoạch tốt và các phương pháp bảo quản giống trong một thòi gian dài để chủ động trong quá trình nuôi cấy và mang lại tính kinh tế. SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 2 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về đối tượng thí nghiệm 1.1.1. Vai trò, vị trí của tảo Spirulina trong công nghệ sinh học (CNSH) Công nghệ sinh học là một lĩnh vực công nghệ cao dựa trên nền tảng khoa học về sự sống, kết hợp với quy trình và thiết bị kỹ thuật nhằm tạo ra các công nghệ khai thác các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào thực vật và động vật để sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất lượng cao phục vụ cho lợi ích, nhu cầu của con người đồng thời phát triển kinh tế- xã hội và bảo vệ môi trường [30]. Trong tự nhiên vai trò của giới tảo (Algae) nói chung, nhất là tảo biển với vai trò quang hợp gắn giữ cacbonic đã tạo ra khoảng 500 tỷ tấn chất hữu cơ có thể sử dụng được (trong đó có nhiều hoạt chất sinh học quý) và thải ra 90% lượng oxy trong bầu khí quyển cần cho sự hô hấp của người và động vật. Chính điều này đã kích thích nghề nuôi tảo biển ra đời và đặc biệt xuất hiện Công nghệ sinh học vi tảo với bộ 3 nổi tiếng là Chlorella, Scenedesmus và Spirulina, chúng có nhiều giá trị trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm Trong 3 nhóm tảo trên thì Spirulina hiện được chọn để phát triển sản xuất hơn 2 loại kia do 5 ưu thế sau: - Hiệu quả kinh tế cao và góp phần bảo vệ, cải thiện môi trường: Spirulina không những đơn giản trong nhu cầu dưỡng chất mà còn rất hiệu quả trong sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời, nước (có thể dùng nước biển, nước lợ, nước mặn, )…, tạo ra 16,8 tấn oxy/năm Điều này giúp bảo vệ môi trường khí quyển, giảm hiệu ứng nhà kính (green house). - Giá trị sử dụng đã vượt ra khỏi ranh giới truyền thống là dùng làm thực phẩm. Theo Thạc sĩ- Dược sĩ Lê Văn Lăng, giảng viên Trường Đại học Y Dược TpHCM, Spirulina là nguồn dinh dưỡng quý của tự nhiên. Nó có đủ các thành phần thiết yếu: protein- lipid- glucid cùng khoảng 30 vi lượng và hầu hết các vitamin cần thiết cho cơ thể, đáp ứng hoàn hảo công thức chuẩn về chế phẩm SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 3 dinh dưỡng- vi lượng khoáng- vitamin do FAO/WHO công bố và là sản phẩm cải thiện suy dinh dưỡng rất tốt cho trẻ em, người già, người bệnh sau phẫu thuật Mặt khác, với các hoạt chất: Phycocyanin, Sulfolipid, Spirulan, Betacaroten, các khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt…) và các vitamin cần thiết, tảo Spirulina còn có giá trị dược liệu, giúp cơ thể tăng cường miễn dịch, chống lại bệnh tật. Có thể dùng tảo Spirulina hỗ trợ trong điều trị các bệnh: viêm gan, suy gan, đục thủy tinh thể, suy giảm thị lực, rụng tóc… Song song đó, tảo Spirulina cũng có tác dụng trong phòng chống một số bệnh ung thư do các hoạt chất tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào, chống đột biến gen. Năm 1996- 1997, một nhóm nhà khoa học người Nhật đã phân lập và xác định cấu trúc một hoạt chất mới trong Spirulina và đặt tên là Spirulan (Ca-Sp). Các thử nghiệm đã chứng tỏ Ca- Sp có tác dụng kháng virus HIV type 1 và virus Herpes simplex type 1 [31]. - Tham gia vào việc xử lý môi trường: ngoài việc cung cấp dưỡng khí oxy, Spirulina còn có khả năng gắn giữ mạnh các cation độc như chì, thuỷ ngân, cadimi, nên chúng có thể dùng để xử lý chất thải lỏng, xử lý nước thải [29]. - Spirulina có thể là đối tượng chuyển tải các tiến bộ khoa học kỹ thuật rất hiện đại trong công nghệ sinh học: + Nuôi định hướng thu các chất có lợi cho dinh dưỡng và trị bệnh cho người và động vật. Đã có các tiến bộ về nuôi cấy Spirulina gắn Iod (phòng trị bệnh thiếu vi chất iod), gắn Selen, gắn Germani (chất chống oxy hoá, chống lão hoá, phòng chống ung thư )v.v Hoặc nuôi với những tiền chất định hướng cho sinh khối Spirulina giàu acid béo cần thiết, giàu beta-caroten. Sự thành công trong tương lai phụ thuộc vào việc chọn giống Spirulina và tìm tòi công nghệ phù hợp, sẽ cho những lô/mẻ sinh khối Spirulina rất có giá trị trong y dược. + Spirulina với công nghệ chuyển nạp gen: Chuyển nạp gen là kỹ thuật phân lập gen từ cơ thể cho (donor) cấy ghép vào bộ máy di truyền của cơ thể nhận (receiver) nhằm tạo ra tính trạng mới cần thiết từ cơ thể đó. Kỹ thuật tân tiến này đang được nghiên cứu với Spirulina ở 2 hướng sau: • Chuyển gen chịu trách nhiệm di truyền tạo phao khí của Spirulina giúp vi sinh vật nổi trên mặt nước dễ dàng. Ta biết muốn phòng trừ bệnh sốt rét phải diệt SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 4 muỗi Anopheles stopenis, bệnh sốt xuất huyết phải diệt muỗi Aedes aegypti, bệnh giun chỉ phải diệt muỗi Culex quinquefasciatus. Một cách hiệu quả cắt đứt vector truyền bệnh này là diệt ấu trùng (bọ gậy, lăng quăng ) của chúng. Hiện một số nghiên cứu cho thấy có những vi sinh vật, hoặc vi nấm có thể thực hiện được điều này. Tuy vậy, việc phải sống trôi nổi trên mặt nước (môi trường ấu trùng các loại muỗi gây bệnh sinh sống) để diệt ấu trùng muỗi lại là điểm không có hoặc yếu kém của các vi sinh vật này. Do vậy có thể tách gen di truyền tạo phao khí nổi trên mặt nước của Spirulina ghép vào vi sinh vật có ích trên, tạo ra những đặc điểm mong muốn diệt ấu trùng muỗi gây bệnh [1]. • Chuyển nạp gen tạo chất dẻo sinh học cho Spirulina: có thể ghép vào Spirulina gen tạo chất polyhydroxyl butylat (P.H.B), gen này có ở vi khuẩn Aleutroplus, để tạo ra giống Spirulina mới có đặc tính phát triển sinh khối nhanh, đồng thời chứa P.H.B với hàm lượng thích hợp. Trích ly chất P.H.B để sản xuất nhựa thay thế nhựa dẻo (như polystyrene) và chất dẻo mới này dễ bị phân huỷ không làm ô nhiễm môi trường v.v [22]. - Spirulina tương đối thích nghi với mọi quy mô sản xuất: có thể thu hoạch từ tự nhiên hoặc nuôi ở quy mô nhỏ (hộ gia đình, làng xã), trong điều kiện bán tự nhiên với kỹ thuật đơn giản như nuôi trồng thuỷ sản, và nuôi ở quy mô công nghiệp [11]. 1.1.2. Phân loại học Mang nhiều tên gọi khác nhau như Spirulina, Arthrospira và là một chủ đề được thảo luận nhiều từ trước đến nay, nhất là khi cái tên “tảo” được nhắc đến lần đầu tiên. Năm 1852, việc phân loại học đầu tiên được viết bởi Stizenberger. Ông đưa ra tên loài mới là Arthrospira dựa vào cấu trúc chứa vách ngăn, đa bào, dạng xoắn. Gomont đã khẳng định những nghiên cứu của Stizenberger vào năm 1892, đồng thời Gomont bổ sung thêm loài không có vách ngăn là Spirulina và loài có vách ngăn là Arthrospira. Như vậy, tên được công nhận là Arthrospira, nhưng trong những hoạt động khảo sát và nghiên cứu Arthrospira được gọi là Spirulina, do đó tên Spirulina được sử dụng phổ biến cho đến nay thay cho tên Arthrospira. SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 5 1.1.3. Đặc điểm sinh học của Spirulina Loài Spirulina (Arthrospira) platensis thuộc[2]: Chi : Spirulina (Arthrospira) Họ : Oscillatoriceae Bộ : Oscillatoriales Lớp : Cyanophyceae Ngành : Cyanophyta 1.1.3.1. Đặc điểm hình thái Tên “Spirulina” xuất phát từ tiếng Latinh “helix” hoặc “spiral” biểu hiện hình dạng xoắn của nó. Spirulina là tảo đa bào, dạng sợi, sống cộng sinh, các tế bào được phân biệt bởi vách ngăn, dạng sợi xoắn hình lò xo không phân nhánh, số vòng xoắn lớn nhất là 6- 8 vòng đều nhau. Đường kính xoắn khoảng 35- 50µm, bước xoắn là 60µm, chiều dài sợi tảo có thể đạt 250µm. Nhiều trường hợp Spirulina có kích thước lớn hơn. Các vách ngang chia sợi Spirulina thành nhiều tế bào riêng rẽ liên kết với nhau bằng cầu liên bào. Sợi tảo Spirulina có khả năng chuyển động và tự vận động theo kiểu trượt quanh trục của sợi [13]. 1.1.3.2. Đặc điểm cấu tạo Tế bào Spirulina có cấu trúc giống với sinh vật Prokaryote thiếu các hạt liên kết với màng. Thuộc gram âm, thành tế bào nhiều lớp và được bao bọc bởi màng polysaccharide nhầy. Thành tế bào Spirulina không chứa celulose mà hệ tiêu hóa con người không phân cắt được. Spirulina có tỷ lệ chuyển hóa quang hợp khoảng 10% so với chỉ 3% của các thực vật sống trên cạn như đậu nành. Tế bào tảo Spirulina chưa có nhân điển hình, vùng nhân chỉ là vùng giàu axit nucleic chưa có màng nhân bao bọc, phân bố trong nguyên sinh chất. Thành tế bào Spirulina có cấu trúc nhiều lớp, không chứa celulose mà chứa mucopolyme, pectin và các loại polysacharid khác. Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế bào và nối với màng quang hợp thylakoid tại một vài điểm. Spirulina không có lục lạp mà chỉ chứa thylakoid quang hợp nằm rải rác trong nguyên sinh chất. Màng thylakoid bao quanh các hạt polyphosphat có đường kính 0,5- 1μ thường nằm ở trung tâm tế bào. Sắc tố quang hợp chính là phycocyanin, bên cạnh đó còn SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long Hình 1.1: Tảo Spirullina platensis Đồ án tốt nghiệp 6 có chlorophyll a. Ngoài ra, tế bào Spirulina không có không bào thực, chỉ có không bào chứa khí làm chức năng điều chỉnh tỉ trọng tế bào. Không bào khí có vai trò rất quan trọng trong việc làm cho Spirulina nổi lên mặt nước [10]. Spirullina là một chi tảo thuộc ngành tảo lam, tế bào Spirulina không có ty thể và mạng lưới nội chất, tuy nhiên tế bào vẫn có ribosome với hệ số lắng 70S và một số thể vùi như hạt polyphotphat, glycogen, phycocyanin, cacboxysome và hạt mesosome [10]. Thành tế bào dưới kính hiển vi điện tử hiện lên gồm 4 lớp: từ lớp L 1 đến lớp L 4 (L 1 , L 2 , L 3 , L 4 ). L 1 và L 3 chứa vật liệu dạng sợi. L 2 là một peptidoglycan giống như ở tế bào vi khuẩn. L 4 được sắp xếp chạy theo chiều dọc của trục sợi Spirulina [4]. Hình 1.2. cũng cho thấy một vách ngăn đang hình thành, vách ngăn này gồm ba lớp: L2 kẹp giữa hai L1, có thể hình dung như hình 1.3. SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long L 1 L 4 L 3 L 2 Hình 1.2. Lát cắt tế bào Spirulina platensis L 1 L 2 L 1 L 4 L 3 L 2 L 1 Màng sinh chất Hình 1.3. Mô hình sắp xếp vách tế bào Spirulina platensis Đồ án tốt nghiệp 7 Lớp L 1 và L 3 có chức năng vận chuyển điện tử, do đó hai lớp L 2 và L 4 tập trung các điện tử đó. Độ dày của mỗi lớp từ 10-15nm, nên độ dày của toàn bộ thành tế bào là khoảng 40- 60nm. Các lớp L 1 , L 3 , L 4 có độ dày bằng nhau, lớp L 1 lớn hơn [2]. 1.1.3.3. Đặc điểm sinh thái Spirulina là chi tảo lam phân bố rộng trong đất, nước ngọt, nước lợ, nước mặn và suối nước nóng. Đây là một trong khoảng 2500 loài cyanophyta cổ nhất, tự dưỡng đơn giản, có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể, kể cả các đại phân tử phức tạp để xây dựng tế bào và có khả năng cố định đạm rất cao, chúng không thể sống hoàn toàn trong tối… Trong quá trình sinh trưởng và phát triển tảo Spirulina chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường. Những yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, pH và thành phần dinh dưỡng không chỉ ảnh hưởng đến quang hợp và sản xuất sinh khối tế bào mà còn ảnh hưởng tới các hoạt động chuyển hóa của tế bào. a) Ảnh hưởng của ánh sáng Ánh sáng là nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến quang hợp của các sinh vật. Do bản chất tiền nhân của Spirulina nên ánh sáng không ảnh hưởng nhiều tới quá trình phát triển. Tuy nhiên, Spirulina cũng giống như nhiều loài tảo khác có khả năng quang tự dưỡng và phụ thuộc vào ánh sáng vì đây là nguồn năng lượng chính [28]. Hầu hết, các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về đáp ứng của Spirulina đối với ánh sáng là được thực hiện dưới điều kiện phát triển quang tự dưỡng bằng việc sử dụng môi trường khoáng và bicarbonate như một nguồn carbon. Từ các nghiên cứu đó cho thấy sự phát triển của Spirulina trở nên bão hòa ở cường độ ánh sáng 1µmol m -2 s -1 khoảng bằng 10- 15% lượng ánh sáng mặt trời ở bước sóng 400- 700nm, giá trị này tùy thuộc vào điều kiện phát triển và mối tương quang giữa chlorophyll và sinh khối [28]. Ngoài ra, cường độ chiếu sáng còn ảnh hưởng đến các hàm lượng các chất bên trong tế bào tảo. Một số nghiên cứu đã nhận định rằng khi cường độ chiếu sáng tăng thì hàm lượng của acid béo (PUFA) giảm [26]. SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 8 Theo Seshadri & Thomas (1979), sự tác động của ánh sáng tới Spirulina là bởi hai yếu tố chính đó là thời gian và cường độ chiếu sáng. Quá trình nuôi cấy ngoài trời thì cường độ ánh sáng tối hảo cho Spirulina trong khoảng 20- 30klux. Về thực hành nuôi cấy Spirulina thì cường độ ánh sáng tối ưu là 25- 30klux, ở khoảng này hoạt tính quang hợp cao nhất, cần điều chỉnh đạt được khoảng cường độ chiếu sáng này trong nuôi cấy [11]. Ngoài ra, cường độ ánh sáng còn phụ thuộc vào mật độ nuôi cấy của tảo, vì khi cường độ ánh sáng cao mà mật độ tảo lớn thì mỗi sợi tảo vẫn nhận được cường độ ánh sáng nhỏ. Nhiều loại vi tảo có cường độ quang hợp bão hoà ở khoảng 33% tổng lượng cường độ ánh sáng. Vì vậy trong điều kiện ánh sáng có cường độ cao và thời gian chiếu sáng dài, người ta thấy xuất hiện hiện tượng quang ức chế có thể làm tảo chết hoặc làm giảm đáng kể năng suất nuôi trồng [1]. Theo Charenkova C.A (1977) thì thời gian chiếu sáng càng dài thì năng suất tảo Spirulina càng cao. Năng suất tảo đạt cao nhất khi chiếu sáng liên tục. Như vậy tảo Spirulina không có chu kỳ quang [1]. b) Ảnh hưởng của nhiệt độ Trong khi ánh sáng được xem là nhân tố môi trường quan trọng nhất cho quang hợp của vi sinh vật thì nhiệt độ là nhân tố cơ bản nhất cho sự sống của sinh vật. Nhiệt độ ảnh hưởng đến tất cả hoạt động sống của vi sinh vật như quá trình trao đổi chất, thành phần dinh dưỡng cũng như các đặc tính sinh lý khác. Nhiệt độ môi trường luôn là một trong những yếu tố nhạy cảm ảnh hưởng đến bất kỳ sinh vật nào. Nhiệt độ môi trường nuôi là yếu tố cần đáp ứng liên tục, vì rất dễ bị chi phối và tác động bởi điều kiện xung quanh, mức độ và thời gian chiếu sáng. Do vậy nhiệt độ là một trong những yếu tố thường xuyên được theo dõi trong công nghệ nuôi trồng vi tảo [28]. Spirulina phát triển ở nhiệt độ khá cao, chúng có khả năng phát triển mạnh ở khoảng nhiệt độ 32- 40 0 C. Nhiệt độ cực thuận cho nuôi cấy Spirulina là 35- 38 0 C. Ở nhiệt độ dưới 25 0 C Spirulina phát triển rất chậm, ở nhiệt độ trên 38 0 C tảo này sẽ chết rất nhanh [21]. Tuy vậy, trong tự nhiên người ta phát hiện Spirulina ở những suối nước nóng đến 69 0 C. SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 9 Ngoài ra, nhiệt độ còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa của tảo. Theo một nghiên cứu đã cho thấy rằng: ở nhiệt độ 35 0 C không ảnh hưởng xấu lên sản xuất sinh khối nhưng lại ảnh hưởng tích cực lên sản xuất protein, lipid và phenolic. Nhiều chủng khác nhau sẽ phát triển ở các khoảng nhiệt độ khác nhau [28]. Có một mối liên hệ giữa nhiệt độ và ánh sáng trong quá trình nuôi cấy tảo. Giống như hai mặt đối lập của một quá trình thống nhất, chúng đều đóng vai trò quan trọng quyết định đến năng suất và sinh khối của Spirulina. Sinh trưởng của tảo đạt cao nhất với một cường độ và thời gian chiếu sáng thích hợp, kèm theo nó là một chế độ nhiệt tương đối ổn định. c) Ảnh hưởng của pH pH môi trường là một trong các nhân tố quan trọng trong nuôi cấy Spirulina. pH tối ưu cho sự phát triển của chi này là kiềm và kiềm cao. Đây là ưu thế lớn giúp Spirulina ít bị lây nhiễm bởi các tảo khác [14]. Tuy nhiên, pH là yếu tố nội tại luôn luôn thay đổi, không những do chế độ chiếu sáng, nhiệt độ hàm lượng các chất dinh dưỡng tạo nên mà còn do tác động ngược lại của chính trạng thái sinh trưởng của quần thể tảo. Khi tảo phát triển càng mạnh, pH môi trường bị thay đổi và trở thành yếu tố kìm hãm cho sự sinh trưởng và phát triển. Do đó, pH môi trường quá cao hay quá thấp đều làm chậm quá trình sinh trưởng của tảo [20]. Theo Trần Văn Tựa và Nguyễn Hữu Thước (1993) thì pH môi trường từ 8,5- 9 là pH tối ưu cho tảo Spirulina sinh trưởng và phát triển. Ở pH này, nguồn cacbon vô cơ được tảo đồng hóa nhiều nhất. Tuy nhiên ở pH= 10- 11 Spirulina vẫn có khả năng phát triển nhưng rất chậm. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng mặc dù Spirulina là loài tảo sống trong môi trường kiềm nhưng giá trị pH > 10,3 là có hại cho môi trường nuôi cấy [6]. Vì vậy pH được coi là yếu tố chỉ thị, phản ánh các thành phần nuôi dưỡng cung cấp cho môi trường nuôi dưỡng tảo, chủ yếu là nguồn bicarbonat và khí CO 2 hoà tan [11]. d) Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long Đồ án tốt nghiệp 10 Spirulina có thể sống trong môi trường tự nhiên đến các môi trường nhân tạo hoặc nửa nhân tạo bằng bổ sung các chất khoáng cần thiết vào nguồn nước tự nhiên: nước biển, nước suối khoáng, nước khoáng ngầm, giếng khoan Thành phần dinh dưỡng bao gồm cả nguyên tố đa lượng (C, N, P, K, S, Mg, Na, Cl, Ca và Fe) và nguyên tố vi lượng (Zn, Cu, Ni, Co,W). Tất cả điều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tảo. Trong đó, các nguyên tố vi lượng là thành phần bắt buộc hay tác nhân kích thích hoạt động của nhiều hệ enzyme, có tác dụng thúc đẩy sinh tổng hợp chlorophyll và làm giảm sự phân hủy chlorophyll nhờ làm tăng độ bền vững của phức hệ liên kết giữa chlorophyll và protein. Ngoài ra, nhiều nguyên tố vi lượng còn làm tăng khả năng tổng hợp carotenoid [14]. Các nguyên tố vi lượng thật sự cần thiết cho quá trình sinh trưởng của tảo, tuy nhiên hàm lượng của chúng trong nước tự nhiên là rất thấp, có thể không cung cấp đủ cho nhu cầu sinh trưởng của tảo do đó việc bổ sung vi lượng vào môi trường nuôi cấy là hết sức cần thiết. Trong nuôi cấy tảo, vi lượng thường được bổ sung với một lượng rất nhỏ vì khi hàm lượng vượt quá ngưỡng chịu đựng của vi tảo, chúng có khả năng gây độc cho tế bào [20]. 1.1.4. Đặc điểm sinh sản Spirulina có hai hình thức sinh sản đó là sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô tính. Hình thức sinh sản sinh dưỡng được thực hiện bằng cách gãy từng khúc của sợi tảo, khúc gãy gọi là khúc tản. Từ một sợi tảo mẹ, hình thành nên những đoạn Necridia (gồm các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản). Trong các Necridia hình thành các đĩa lõm ở hai mặt và sự tách rời tạo các hormogonia bởi sự chia cắt tại vị trí các đĩa này. Trong sự phát triển, dần dần phần đầu gắn tiêu giảm, 2 đầu hormogonia trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi. Các hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản được lập đi lập lại một cách ngẫu nhiên, tạo nên vòng đời của tảo. Kiểu sinh sản này thường gặp ở các sợi tảo có dạng chuỗi tế bào xếp nối nhau. Trong thời kì sinh sản tảo Spirulina nhạt màu ít sắc tố xanh hơn bình thường [5, 13]. SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long [...]... Ultrospec 2000 để xác định tốc độ sinh trưởng của tảo trong các môi trường và trong điều kiện ánh sáng khác nhau 2.3.5 Khảo sát các phương pháp thu hoạch tảo Spirulina platensis 2.3.5.1 Thu hoạch bằng phương pháp lọc thủ công Dựa vào lực hút của trọng lực ta tiến hành thu hoạch tảo bằng cách lọc thủ công Cách tiến hành: Lấy dịch chứa sinh khối cho chảy qua lưới lọc, thu phần sinh khối trên lưới lọc Dịch sau... bảo quản tiến hành hoạt hóa để theo dõi khả năng sống sót của tảo sau bảo quản 2.3.9.3 Bảo quản giống bằng cấy chuyền trên môi trường thạch Chuẩn bị môi trường thạch Zarrouk đổ đĩa petri Mẫu tảo sau thời gian nuôi cấy thu sinh khối ở pha log bằng ly tâm hoặc lọc thu sinh khối Cấy sinh khối tảo vào đĩa petri (cấy trải) Các thao tác đều được tiến hành trong tủ cấy vô trùng Sau khi cấy xong đem đi nuôi. .. nay Spirulina còn được nghiên cứu invitro, để ngăn chặn sự tấn công của virus HIV Ngoài ra, tảo Spirulina có những tác dụng đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu [32, 33, 34] 1.2 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina 1.2.1 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina trên thế giới Người ta bắt đầu biết đến tảo Spirulina qua loại thức ăn Tecuitlatl của người dân Aztec (Mêhicô) và. .. cấy xong đem đi nuôi ở điều kiện bình thường 2.3.9.4 Bảo quản giống bằng glycerol và ở điều kiện lạnh sâu Giống tảo Spirulina platensis sau khi được thu hoạch, tiến hành phân bố vào các ống eppendoff đã vô trùng Tiến hành bổ sung Glycerol đã được vô trùng vào ở nồng độ 10%, 20%, 30% vào các ống eppendof ở trên Đem bảo quản ở nhiệt độ -210C trong tủ lạnh sâu Sau một thời gian bảo quản tiến hành hoạt hóa... 2.3.9.1 Bảo quản giống trong môi trường lỏng và ở điều kiện bình thường của phòng thí nghiệm Giống được phân bố trong các chai nhựa và giữ ở điều kiện phòng thí nghiệm Sau một thời gian bảo quản tiến hành hoạt hóa để theo dõi khả năng sống sót của tảo sau bảo quản 2.3.9.2 Bảo quản giống trong môi trường lỏng và ở tủ lạnh 40C Giống được phân bố trong các chai nhựa và giữ ở tủ lạnh 4 0C Sau một thời gian bảo. .. cho các chuyến du hành vũ trụ sử dụng tảo Spirulina platensis để chuyển nước thải, CO 2, phân, nước tiểu thành sinh khối tảo dinh dưỡng, H2O sạch và O2 cung cấp lại cho người đang được NASA (Cơ quan hàng không và vũ trụ Hoa Kỳ) thử nghiệm ở dạng pilot [24] 1.2.2 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina ở Việt Nam Ở Việt Nam, tảo Spirulina được nhập nội từ Pháp năm 1972 và trở thành đối tượng nghiên. .. sau đó cho sục khí vào để tảo nổi lên thành cụm và vớt ra ngoài 2.3.5.3 Thu hoạch bằng phương pháp tự kết tủa Vì tảo tiêu thụ CO2 nên độ pH tăng lên dần dẫn tới việc kết tủa của hydroxyt magie (Mg(OH)2) và carbonatcanxi (CaCO3) sẽ kéo theo tảo lắng xuống Dựa trên cơ sở này ta tiến hành thu hoạch tảo bằng phương pháp tự kết tủa 2.3.5.4 Thu hoạch bằng phương pháp siêu âm Nguyên tắc: Dựa vào tác động cộng... Hình thái tảo Spirulina platensis dưới KHV A Vật kính 10X B Vật kính 40X C Vật kính 100X D Tảo Spirulina platensis đang phân cắt (100X) Do mẫu tảo bảo quản ở phòng thí nghiệm sau khi hoạt hóa và quan sát dưới kính hiển vi nhưng không thấy sự hiện diện của tảo Spirulina platensis nên tất cả các nghiên cứu sau chúng tôi dùng mẫu tảo mua để tiến hành thí nghiệm 3.3 Khảo sát môi trường nuôi cấy Để khảo... từ những sinh vật loại này bị diệt trừ gần như tuyệt đối [12] - Tảo Môi trường nuôi cấy còn bị nhiễm các loại tảo khác Nhưng do nồng độ muối, pH cao của môi trường, do đó thường trở nên không thu n lợi với đa số các loài tảo Ở nồng độ muối đạt 20 g/l hầu như các loài tảo bị tiêu diệt Tuy nhiên, loài tảo silic Navicula, tảo xanh lục, và tảo lục Chlorella vẫn sống sót được trong các bể nuôi Spirulina. .. 11/03/2012- 01/06/2012 2.2 Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm, hóa chất 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu - Giống tảo Spirulina platensis được bảo quản tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học- khoa Hóa- trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng ngày 21/05/2011 - Giống tảo Spirulina platensis được mua tảo mua ở Phòng công nghệ Tảo viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào 15/03/2012 Giống ở dạng dung dịch . Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo Spirulina platensis”. Nhằm mục đích tìm ra môi trường ít thành phần hóa chất, rẻ tiền, phương pháp thu. môi trường nuôi cấy còn sử dụng quá nhiều hóa chất nên môi trường nuôi cấy đắt, do đó kém kinh tế dẫn đến chi phí đầu tư cao, các điều kiện để nuôi cấy cũng chưa tốt nhất và phương pháp thu nhận sinh khối. sẫm. Màu này khó bị phá huỷ trong quá trình nuôi cấy. Sau nuôi cấy chúng sẽ bám vào sinh khối sinh vật và bám vào sản phẩm. Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thường rất tốn kém và rất