ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––––– BÙI THỊ MINH NGUYỆT Tên đề tài: GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH VIRUS CÚM GIA CẦM VÀ TÁC DỤNG CỦA VẮC XIN H5N1 SAU TIÊM PHÒNG TẠI TỈNH BẮC GIANG NĂM 2009 Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60 62 50 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: GS.TS NGUYỄN QUANG TUYÊN PGS.TS TÔ LONG THÀNH THÁI NGUYÊN - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––––– BÙI THỊ MINH NGUYỆT Tên đề tài: GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH VIRUS CÚM GIA CẦM VÀ TÁC DỤNG CỦA VẮC XIN H5N1 SAU TIÊM PHÒNG TẠI TỈNH BẮC GIANG NĂM 2009 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP THÁI NGUN - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Các kết nghiên cứu luận văn đồng nghiệp phối hợp trực tiếp nghiên cứu hướng dẫn GS TS Nguyễn Quang Tuyên GS TS Tô Long Thành giúp đỡ chân tình tập thể anh chị em phịng Virus - Trung tâm Chẩn đoán thú y trung ương Chi cục Thú y tỉnh Bắc Giang Các số liệu kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực, rút từ thực tế tỉnh Bắc Giang năm vừa qua chưa sủ dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, 25 tháng năm 2010 Tác giả luận văn Bùi Thị Minh Nguyệt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập với nỗ lực thân, nhận giúp đỡ, hướng dẫn tận tình nhiều cá nhân tập thể, đến luận văn tơi hồn thành Nhân dịp này,cho phép tơi tỏ lịng biết ơn cảm ơn chân thành tới: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên - P.Viện trưởng - Viện Khoa Học Sự Sống- Đại học Thái Ngun GS TS Tơ Long Thành - Phó Giám đốc trung tâm Chẩn đoán thú y trung ương Những người thầy uyên bác, mẫu mực, tận tình chu đáo giúp đỡ, cổ vũ tinh thần, động viên, hướng dẫn, bảo cho suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, khoa sau Đại học, khoa Chăn nuôi thú y, Trung tâm Chẩn đốn Thú y trung ương, thầy giáo giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập, tiếp thu kiến thức chương trình học Các cán phịng Vi rus - Trung tâm Chẩn đốn thú y trung ương Cục thú y - Hà Nội Ban Lãnh đạo toàn thể cán Chi cục Thú y, đồng nghiệp làm việc lĩnh vực Chăn nuôi - thú y tỉnh Bắc Giang Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, anh chị đồng nghiệp quan bạn bè động viên, giúp đỡ vượt qua khó khăn suốt q trình học tập, nghiên cứu, thực đề tài Một lần nữa, xin bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành tới tập thể, cá nhân tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập./ Thái Nguyên, tháng năm 2010 Tác giả Bùi Thị Minh Nguyệt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết để tài Mục tiêu đề tài 3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài Địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan bệnh cúm gia cầm 1.1 Giới thiệu chung bệnh cúm gia cầm 1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 1.2.1 Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 giới 1.2.2 Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 Việt Nam 1.2 Căn bệnh virus cúm gia cầm 12 1.2.1 Hình thái, cấu trúc chung virus cúm typ A 13 1.2.2 Kháng nguyên virus cúm 15 1.2.3 Độc lực virus 17 1.2.4 Sức đề kháng virus 19 1.2.5 Cơ chế sinh bệnh 20 1.2.6 Khả biến chủng virus cúm 20 1.2.7 Danh pháp 24 1.2.8 Nuôi cấy lưu giữ giống virus cúm gia cầm 24 1.3 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 24 1.3.1 Động vật cảm nhiễm 24 1.3.2 Động vật mang virus 25 1.3.3 Sự truyền lây 26 1.3.4 Sức đề kháng virus cúm 27 1.3.5 Tuổi mắc bệnh 28 1.3.6 Mùa bệnh 28 1.3.7 Tỉ lệ mắc, tỷ lệ chết 28 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.4 Triệu chứng bệnh tích bệnh Cúm gia 28 1.4.1 Triệu chứng lâm sàng bệnh cúm gia cầm 28 1.4.2 Bệnh tích bệnh cúm gia cầm 30 1.5 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm gia cầm 32 1.5.1 Miễn dịch không đặc hiệu 33 1.5.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu 34 1.5.2.1 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 34 1.5.2.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 35 1.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm 37 1.6.1 Chẩn đoán dựa vào dịch tễ, triệu chứng bệnh tích 37 1.6.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 37 1.7 Các biện pháp phòng bệnh 38 1.7.1 Các biện pháp phòng bệnh vệ sinh thú y tổng hợp 38 1.7.2 Sử dụng vắc xin phòng chống bệnh cúm gia cầm 39 1.7.2.1 Vắc xin cúm gia cầm sử dụng 39 1.7.2.2 Các lưu ý sử dụng vắc xin cúm 43 1.7.2.3 Vắc xin cúm sử dụng nước ta 46 1.7.2.4 Yêu cầu cần đạt vắc xin phòng bệnh cúm gia cầm 48 1.7.2.5 Tình hình sử dụng vắc xin nước ta 49 Chƣơng NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 2.1 Nội dung 49 2.1.1 Điều tra tình hình dịch cúm gia cầm tỉnh Bắc Giang qua năm 49 2.1.2 Xác định hàm lượng kháng thể kháng virút cúm subtype H5 mẫu huyết gia cầm tiêm phòng vắc xin cúm năm 2009 địa phương tỉnh Bắc Giang 49 2.1.3 Giám sát lưu hành virút cúm năm 2009 50 2.2 Nguyên liệu 50 2.3 Phương pháp nghiên cứu 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu xử lý mẫu 52 2.3.2 Thực phản ứng HI 52 2.3.3 Giám định virus phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI 54 2.3.4 Phản ứng Real time RT - PCR (Xem phụ lục) 56 2.4 Xử lý số liệu 56 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Tình hình chăn ni gia cầm sử dụng vắc xin cúm gia cầm Bắc Giang 57 3.1.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm Bắc Giang số năm gần 57 3.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm Bắc Giang 60 3.1.3 Tình hình sử dụng vắc xin 63 3.2 Đánh giá đáp ứng miễn dịch chống cúm địa bàn tỉnh Bắc Giang năm 2009 64 3.2.1 Giám sát huyết học đàn gia cầm, thủy cầm tiêm phòng địa bàn tỉnh Bắc Giang 64 3.2.2 Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) kháng virus cúm subtype H5 Gà - Vịt tiêm phòng năm 2009 66 3.2.3 So sánh đáp ứng miễn dịch hai loài Gà - Vịt năm 2009 68 3.2.4 So sánh tỷ lệ bảo hộ theo cá thể theo đàn hai loài Gà -vịt tiêm phòng năm 2009 71 3.2.5 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm H5N1 quẩn thể gà, vịt thời điểm tháng sau tiêm phòng mũi mũi thứ 73 3.2.5.1 Đáp ứng miễn dịch Gà sau tiêm phòng vắc xin cúm gia cầm H5N1 mũi thứ mũi thứ kết ghi lại bảng 4.8 4.9 73 3.2.5.2 Đáp ứng miễn dịch Vịt sau tiêm phòng vắc xin cúm gia cầm H5N1 mũi mũi tiêm thứ 75 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.5.3 Tần số phân bố hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng mũi mũi Gà 77 3.2.5.4 Tần số phân bố hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng mũi mũi Vịt 80 3.5 Khảo sát đáp ứng miễn dịch gà thời điểm 1.2.3 tháng sau tiêm phòng 82 3.6 Kết giám sát lưu hành virus cúm gia cầm địa bàn tỉnh Bắc Giang năm 2009 88 3.6.1 Giám sát huyết học đàn thủy cầm chưa tiêm phòng năm 2009 89 3.6.2 Giám sát virus học gia cầm chợ điểm giết mổ 90 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 93 Đề nghị 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH 98 PHỤ LỤC 101 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA CHO ĐỀ TÀI 101 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 người báo cáo cho WHO từ tháng 12/2004 đến 21/4/2009 Bảng 3.1 Tình hình chăn ni gia cầm Bắc Giang số năm gần 58 Bảng 3.2 Tình hình dịch cúm gia cầm tỉnh Bắc Giang năm 2007 61 Bảng 3.3 Phân bố hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 huyết gia cầm, thủy cầm tiêm phòng năm 2009 64 Bảng 3.4 Hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 gà sau tiêm phòng địa phương năm 2009 67 Bảng 3.5 Hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 Vịt sau tiêm phòng địa phương năm 2009 68 Bảng 3.6 Phân bố Hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 huyết gà - vịt tiêm phòng năm 2009 69 Bảng 3.7 Tỷ lệ bảo hộ theo cá thể theo đàn gà - vịt tiêm phòng năm 2009 71 Bảng 3.8 Tỷ lệ bảo hộ theo đàn gà sau tiêm phòng vắc xin mũi thứ 73 Bảng3.9 Tỷ lệ bảo hộ theo đàn gà sau tiêm phòng vắc xin mũi thứ hai 74 Bảng 3.10 Tỷ lệ bảo hộ theo đàn vịt sau tiêm phòng vắc xin mũi thứ 75 Bảng 3.11 Tỷ lệ bảo hộ theo đàn vịt sau tiêm phòng vắc xin mũi thứ hai 76 Bảng 3.12 Tần số phân bố hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 Gà 77 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.13 Tần số phân bố hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 vịt 80 Bảng 3.14 HGKT kháng cúm H5 thời điểm 1, 2, tháng sau tiêm phòng nhắc lại 82 Bảng 3.15 Kết giám sát huyết thủy cầm chưa tiêm phòng năm 2009 89 Bảng 3.16 Kết giám sát virus học gia cầm, thủy cầm chợ, điểm giết mổ năm 2009 92 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH 39 Alexander D.J (1993), Orthomyxovirus Infections, Viral Infections of Vertebrates, Vol III, pp.277-316 40 Alexander D.J.(1996), Highly Pathogenic Avian Influenza (fowl plague), OIE Manual of standards for diagnostic test and vaccinne List A and B diseases of mammals, birds and bees, 3rd ed pp 155 - 160 41 Beard C.W., Schnitzlein W.M & Tripathy D.N (1991), Protection of chickens against highly pathogenic avian influenza virus (H5N2) by recombinant fowlpox viruses, Avian Dis., 35, pp 356 - 359 42 Bruschke C (2007), International Standards and Guidelines on Poultry HPAI Vắc xination, AI vắc xin conference: "Vaccinne: a tool for the control of avian influenza", 20 - 22 March, Verona, Italy 43 Capua I & Cattoli G (2007), Diagnosing avian influenza infections in Vaccinned populations using "DIVA" systems, AI Vaccinne conference: "Vaccinnation: a tool for the control of avian influenza", 20 - 22 March, Verona, Italy 44 Casey Bean & Zhang Jianpin (2005), China, people Republic of Poultry and Products China's Vaccinnation: Program for Avian Influenza 2005, GIAN report, USDA Foreign Agricultural Service, US 45 Bublot M et al (2006), Development and Use of Fowlpox Vectored 46 Vaccine for Avian Influenza, Ann N.Y Acad Sci 1081 (2006) pp 193-201 47 Ito, T and Y Kawaoka (1998), Avian influenza, p 126-136 In K G Nicholson, R G Webster, and A J Hay (ed.) Textbook of influenza Blackwell Sciences Ltd, Oxford, United Kingdom 48 Karim Ben Jebara (2007), Update on highly pathogenic avian influenza (H5N1), AI Vaccine conference: "Vaccinnation: a tool for the control of avian influenza", 20 - 22 March, Verona, Italy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 100 49 Mingxiao M et al (2006), Construction and immunogenicity of recombinant fowlpox vaccine coexpressing HA of AIV H5N1 and chicken IL18, Elsevier Inc Vắc xin 24 (2006), pp 4304 - 4311 50 Muphy.B.R and R.G Webter (1996), Orthomyxoviruses, p, 1397-1445 In B.N Fields D.M Knipe, P.M Howley et al (ed) 51 Office International des Epizooties (OIE) (1992), Manual of standards for Diagnostic Tests and Vắc xins, Second Edition, Paris, France 52 OIE, Council of European Communitis (1992) Council Directive 92/40/EEC of 19th may 1992 introducing Community measures for the control of avian influeza, Official Journal of Eropean Communities L176, 1-15 53 Seo S and R G Webter (2001), Cross-reactive cell-mediated immunity and protection of chickens from lethal H5N1 influenza virus infection in the HongKong poultry markets, J Virology, 75: 2516-2525 54 Swayne E (2003),Vaccine for list A poultry diseases; emphasison avian influenza, Dev Boil., 114, pp 201 - 212e 55 Comparisons of highly virulent H5N1 influenza A viruses isolated from humans and chickens from Hong Kong, J Virol 72, pp 6678 - 6688 56 Swayne D.E., Suarez D.L (2007), Current development in AI vaccine including food safety aspects in vắc xinated birds, AI vaccine conference: "Vaccinnation: a tool for the control of avian influenza", 20 - 22, March, Verona, Italy 57 T.L To, Q.A Bui, N.H Dau, V.N Hoang, D.K Van, N Taylor & H.D Do (2007), Mass Vaccinnation in controling H5N1-HPAI in Vietnam, AI vắc xin conference: "Vaccinnation: a tool for the control of avian influenza", 20 - 22 March, Verona, Italy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 101 58 Robert G Webster et al (2006), The immunogenicity and efficacy against H5N1 challenge of reverse genetics-derived H5N3 influenza vaccine in ducks and chickens, Elsevier Inc Virology 351 (2006), pp 303-311 59 Veits J et al (2008), Protective efficacy of several vaccine against highly pathogenic H5N1 avian influenza virus under experimental conditions, Elsevier Inc Vắc xin 26 (2008), pp.1688-1696 60 Luong G and palese.P Genetiic analysis of influenza A virus, Curr opinion Gen Develop 2; 77-81 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 102 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA CHO ĐỀ TÀI Cơng tác khử trùng tiêu độc Tiêm phòng vacxin Thực phản ứng HI Dàn máy chạy PCR Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 103 + RBC Suspension HA Virus Settling Pattern Kết phản ứng HI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 104 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 105 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 106 Kết chạy PCR mẫu bệnh phẩm nghi Cúm gia cầm ( Tháng 6/2009 Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ƣơng) PHỤ LỤC * Phản ứng Real time RT - PCR: Nguyên liệu: - Nước cất vô trùng (Rnase - free) - ARN đối chứng dương tính M, H5 H7 - Cồn tuyệt đối - Isopropanol 99% tinh khiết - Chloroform 99% tinh khiết - Trizol LS reagent (Invitrogen, cat #10296 - 010 10296 - 027) - Kit chiết tách Qiagen Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep #74106 250 prep) - Kit RT - PCR bước Qiagen (cat # 210210 210212) Superscript RT - PCR One - Step RT - PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat 10927 - 034 10927 - 042, Invitrogen) - Mẫu dị primer Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 107 Bảng Trình tự chuỗi mẫu giò Primer cho RTRT - PCR phát cúm gia cầm Đặc hiệu cúm A) 5’- AgA TgA gTC TTC TAA CCg Agg 5’ Primer (cho Trình tự chuỗi M + 25* M Ký hiệu TCg - 3’ M + 64* 5’- FAM - TCA ggC CCC CTC AAA Mẫu dò gCC gA - TAMRA - 3’ M - 124* 5’- TgC AAA AAC ATC TTC Aag 3’Primer TCT CTg - 3’ H7+ 1244* 5’ Primer H7 (BắcMỹ) H7 + 1271* Mẫu dò H7 - 1342* 3’Primer H5 + 1456* 5’ Primer H5 H5 + 1637* Mẫu dò H5 - 1685* 3’Primer 5’- ATT ggA CAC gAg ACg CAA Tg - 3’ 5’- FAM - TAA TgC TgA gCT gTT ggT ggC - TAMRA - 3’ 5’- TTC TgA gTC CgC AAg ATC TAT Tg - 3’ 5’- ACg TAT gAC TAT CCA CAA TAC TCA - 3’ 5’- FAM - TCA ACA gTg gCg AgT TCC CTA gCA -TAMRA - 3’ 5’- AgA CCA gCT ACC ATg ATT gC - 3’ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 108 - Rnase Inhibitor, 40 unit/µl (Promega, cat # N2511 N2515) - MgCl2, 25µM (Promega, cat # A3511 A3513) - Đệm TE pH 8.0, 1X, (Promega # V6231 V6232) - 14.3 M *β - mercaptoethanol (β - ME) (Sigma M6250) - Hoạt chất phản ứng M H5 cho AIV RRT - PCR chuẩn bị Cepheid để sử dụng cho xét nghiệm M H5 Mỗi hoạt chất phản ứng đủ cho phản ứng loại 25µl Mỗi giọt chứa primer mẫu dò đặc hiệu, KCl, MgCl2, đệm HEPES Thêm vào giọt M gồm chất điều khiển (IC) Mục đích IC phát âm tính giả tạo từ chất ức chế khơng đặc hiệu q trình phân gen - Chất điều khiển M ARN chuỗi đơn phiên mã dài 227 base Nó chứa chuỗi bổ sung với primer tiến đầu 5’ primer lùi đầu 3’ chuỗi bên (internal) để gắn với mẫu dị IC Hạt M gồm có mẫu dị đánh dấu F để phát gen M, mẫu dò đánh dấu Cal - Flour Red 610 cho IC - Hạt chất phản ứng H5 gồm có primer tiến, để phát AIV H5 dòng Bắc Mỹ để phát AIV H5 dòng Âu - Á chất phản ứng H5, mẫu dò H5 đánh dấu FAM phát dòng Chất phản ứng chia vào ống 0,5µl sử dụng để hoàn nguyên Chất phản ứng sử dụng với dNTP enzyme kit Qiagen RT - PCR onestep Chất phản ứng bảo quản túi thiếc 40C tháng không cởi bỏ túi chưa sử dụng * Các bƣớc tiến hành: Trước làm RTRT-PCR, đặt pipet, khay, đầu pipet, vào buồng vô trùng Tương tự, đặt dụng cụ làm mẫu vào buồng vô trùng khác Bật đèn tử ngoại nhiều qua đêm để giảm tạp nhiễm ARN từ pipet dụng cụ khác Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 109 - Chiết tách ARN từ mẫu dịch ngoáy (phương pháp Qiagen RNeasy): + Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy chuyển lượng 500 µl sang ống ly tâm nhỏ ghi ký hiệu mẫu + Cho 500 µl Qiagenđ buffer RLT có β - ME vào ống ly tâm Lắc máy Votex + Ly tâm (bằng máy Spindown) để dịch bệnh phẩm đọng nắp trôi xuống đáy ống Cho 500 µl cồn ethanol 70%, lắc mạnh Votex Ly tâm lấy mẫu bị dung dải vòng phút với tốc độ 5000 vòng nhiệt độ phòng + Chuyển tất dịch chứa mẫu bị dung dải sang cột RNeasy Qiagen ghi sẵn kí hiệu mẫu Ly tâm vòng 15 giây tốc độ ≥ 8000 vòng nhiệt độ phòng Kiểm tra dịch mẫu thấm qua cột lọc chưa, lặp lại bước toàn mẫu qua cột lọc + Bổ sung 700 µl dung dịch rửa (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm 15 giây tốc độ ≥ 8000 vòng, thay ống thu mẫu (collection tube) vào cột lọc + Cho 500 µl RPE buffer vào cột RNeasy ly tâm 15 giây tốc độ ≥ 8000 vòng, thay ống thu mẫu vào cột lọc + Lặp lại bước lần với dung dịch rửa RPE buffer Sau lần rửa cuối thay ống thu mẫu loại 2µl vào cột lọc + Ly tâm cột lọc trống không phút tốc độ tối đa (khoảng 12.000 vòng /phút), bỏ ống thu mẫu + Đặt cột lọc vào ống thu hoạch ghi sẵn ký hiệu mẫu Cho 50µl RNase free H2O vào cột lọc Chú ý không chạm đầu pipet vào mặt thạch Silica cột lọc, ủ nhiệt độ phịng phút Tách RNA cách ly tâm cột phút 10.000 vòng /phút Bỏ cột lọc RNeasy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 110 + Bảo quản mẫu ARN thu 40C thời gian ngắn trước làm RTRT - PCR, sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản - 200C nhiệt độ thấp - Chiết tách mẫu tổ chức Trizol LS: + Cho 0,75 ml Trizol LS reagent (hoặc 1ml Trizol reagent) 0,25 ml dịch bệnh phẩm (0,1 ml dịch bệnh phẩm dùng Trizol reagent) vào ống 1,5 ml lắc để nhiệt độ phòng phút + Thêm 0,2 ml chloroform vào ống Lắc mạnh 15 giây để nhiệt độ phòng phút + Ly tâm ống nhiệt độ 12.000g 15 phút 40C + Chuyển phần nước (khoảng 500 µl) sang ống microtube +Thêm 0,5 ml Isopropanol lắc Để - 10 phút nhiệt độ phòng + Ly tâm ống tốc độ 10.000 vòng phút 40C, bỏ dung dịch ống + Rửa ARN đọng đáy ống cồn 80%, lắc mạnh ly tâm với tốc độ 10.000 vòng phút 40C + Bỏ dung dịch ống làm khô ARN 10 phút nhiệt độ phịng hồ tan lại với 30 µl nước cất khơng có RNase nước cất xử lý DEPC - Sao mã ngược PCR: + Trong buồng vô trùng sạch, chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix) với thành phần sau đủ dùng cho số lượng mẫu cần xét nghiệm + Quy trình áp dụng cho máy nhân gen Cepheid Smart Cycler (Cephied, Sunnyvale, CA) + Thông tin khởi động cài đặt chương trình cho máy Smart Cycler có hướng dẫn hãng Chế độ chạy RT - PCR cho máy Smart Cycler hướng dẫn bảng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 111 Bảng Chu kỳ nhiệt bƣớc phiên mã ngƣợc (RT) dùng cho Quiagen one step RT - PCR kit Nhiệt độ (phút) (0C) 50 15 Một chu kỳ Thời gian 30 Bƣớc phiên mã ngƣợc 95 Bảng Chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen cặp mồi (giây) (0C) Biến tính 94 20 60 Biến tính 94 Bám cặp mồi 20 58 Biến tính 94 Bám cặp mồi 20 57 Kéo dài chuỗi tổng hợp 45 Nhiệt độ 72 Chu kỳ AIV matrix Thời gian Bám cặp mồi Cặp mồi H7 H5 40 40 Bƣớc (Chú ý: Màu huỳnh quang xác định bước bám gắn cặp mồi) Phản ứng RTRT - PCR tiến hành với thành phần sau với cặp mồi chu kỳ thích hợp Khởi động phản ứng với ống phản ứng đặt giá đựng ống lạnh dùng đầu pipet có lọc - Các bước tiến hành phản ứng PCR: Bước 1: Trộn dung dịch Master mix (MM) tùy theo lượng mẫu thí nghiệm Số lượng thành phần dung dịch MM mẫu bệnh phẩm là: Rw (nước tinh khiết): 5,5 µl 2X (nguyên liệu): 12,5 µl PPP (probe, primer xuôi ngược): 1,5 µl Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 112 E (enzyme): 0,5 µl Bước 2: - Trộn 20 µl hỗn hợp MM với µl mẫu thí nghiệm, lắc máy rung Votex - Cho 25 µl mẫu đối chứng vào ống đối chứng dương Cho 25 µl nước cất vào ống đối chứng âm Bước 3: Đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt chọn chương trình chạy PCR, bắt đầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra với mẫu đối chứng dương tính, âm tính vào phần cuối ký hiệu mẫu bảng kết Lưu chương trình chạy máy Sau tiếng 30 phút đọc kết - Phân tích kết xét nghiệm: + Giá trị Ct đối chứng dương tính ARN mã: Đối chứng dương tính ARN mã pha loãng hàm lượng sử dụng cho giá trị Ct khoảng 25 Khi đối chứng dương có Ct cao 29 phải làm lại để xét nghiệm đảm bảo Nếu Ct đối chứng dương tính thấp 20, nên pha chuẩn độ lại độ pha loãng đối chứng Bất kỳ thời điểm Ct đối chứng dương tính đường cong tăng trưởng khác thấp 14, giá trị trừ bị sai lệch + Giám định mẫu dương tính yếu: Loại bỏ tất phản ứng lớn 100 đơn vị tăng huỳnh quang từ đồ thị (điều làm thay đổi thước đo để dễ xác định trường hợp dương tính yếu Quan sát riêng mẫu giúp cho phát phản ứng dương tính yếu + Những mẫu có Ct 35 lớn xem dương tính nghi ngờ xét nghiệm lại Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 113 Kết đọc máy Biorad Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... nghiên cứu đề tài: ? ?Giám sát lưu hành virus cúm gia cầm tác dụng vắc xin H5N1 gia cầm sau tiêm phòng tỉnh Bắc Giang năm 2009? ?? Từ kết nghiên cứu giúp sở chăn nuôi gia cầm tỉnh Bắc Giang chủ động xây... Kết giám sát lưu hành virus cúm gia cầm địa bàn tỉnh Bắc Giang năm 2009 88 3.6.1 Giám sát huyết học đàn thủy cầm chưa tiêm phòng năm 2009 89 3.6.2 Giám sát virus học gia cầm. .. –––––––––––––––––– BÙI THỊ MINH NGUYỆT Tên đề tài: GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH VIRUS CÚM GIA CẦM VÀ TÁC DỤNG CỦA VẮC XIN H5N1 SAU TIÊM PHÒNG TẠI TỈNH BẮC GIANG NĂM 2009 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP