LỜI CẢM ƠN Trong suốt quãng đời sinh viên của chúng ta sẽ có những khoảng thời gian, những k ỷ niệm đáng nhớ. Đối với tôi những ngày thực tập và làm đề tài tốt nghiệp tại Viện sinh học Tây Nguy ên thì không bao giờ quên được. Những ngày cuối cùng của thời sinh viên, tôi phải rời xa giảng đường, thầy cô và những người bạn thân thiết ở trường Đại học, tôi nghĩ m ình buồn lắm và gặp nhiều khó khăn khi ở một thành phố xa lạ. Nhưng khi đến với Viện sinh học Tây Nguy ên tôi đã được sống trong một gia đình nhỏ có một người thầy đáng kính v à những người bạn mới. Không khí ấm áp, đầy t ình thương mến của gia đình nhỏ này đã làm dịu bớt cái lạnh của đất trời Đà Lạt và cả cái lạnh trong lòng tôi. Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Thầy, Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt, người đã quan tâm, tận tình chỉ bảo và cho em những định hướng, lòng say mê đối với lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật. Cảm ơn thầy đã dạy cho chúng em những b ài học quý báu về học vấn và kinh nghiệm cuộc sống. Những lờ i khuyên răng, dạy bảo của thầy đ ã giúp em nhận ra những khuyết điểm của mình để sửa chữa kịp thời ng ày một tốt hơn, hoàn thiện hơn. Anh Nguyễn Bá Nam, một ng ười thầy, một người anh trai đã hướng dẫn cho em những thao tác ban đầu, Đồ án tốt nghiệp 4 Nguyễn Thị Kim Loan 4 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang cho em những ý tưởng mới và tận tình giúp đỡ em vượt qua những khó khăn khi thực hiện đề t ài. Em rất trân trọng sự giúp đỡ của Ban l ãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học v à Môi trường - trường Đại học Nha trang, ban l ãnh đạo Viện sinh học Tây Nguy ên cùng cán bộ, nhân viên Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng đã tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài. Cảm ơn các anh chị: anh Tâm, anh T ùng, chị Phượng, anh Sơn, anh Tuấn, anh Công, anh Huy, chị Hằng và các bạn trường Đại học Đà Lạt, Đại học Yersin: Thùy, Chiến, Nguyễn, Thu, H ương đã giúp đỡ tôi rất nhiều về mặt kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến để đề tài của tôi được hoàn thiện. Cảm ơn tập thể lớp 47CNSH đ ã cho mình những kỷ niệm đẹp của thời sinh vi ên và luôn quan tâm, đ ộng viên mình trong lúc làm đề tài. Cảm ơn bạn Thưởng đã luôn bên mình và giúp đỡ mình vượt qua nhiều khó khăn trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, xin cảm ơn ba mẹ đã sinh ra và nuôi dạy con nên người, cảm ơn chị hai rất yêu thương em, từ bỏ cả cơ hội làm giảng viên để em được thực hiện những mơ ước của mình. Gia đình luôn là điểm tựa vững chắc để con bước đi trong cuộc đời. Xin cảm ơn tất cả, dù đi đến đâu tôi cũng sẽ luôn nhớ về mọi người và sống xứng đáng với những t ình cảm của mọi người đã dành tặng. Đà Lạt, ngày 7 tháng 6 năm 2009 Nguyễn Thị Kim Loan Đồ án tốt nghiệp 5 Nguyễn Thị Kim Loan 5 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DKT : Tối hoàn toàn DKS : Đèn neon LB : Đèn LED màu xanh LR : Đèn LED màu đỏ LR9B1 : 90% đỏ và 10% xanh LR8B2 : 80% đỏ và 20% xanh LR7B3 : 70% đỏ và 30% xanh PLB : Protocorm–like body PPFD : Cường dộ dòng photon quang hợp R:Fr : Tỉ lệ bức xạ đỏ: đỏ xa UV : Ultra violet (tia cực tím) BA : 6-Benzylaminopurine IAA : Acid indole-3-butyric Kin : Kinetin NAA : Acid -naphtaleneacetic TDZ : Thidiazuron 2i-P : Isopentenyladenines 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid MS : Murashige và Skoog, 1962 VW : Vacin – Went (1949) Đồ án tốt nghiệp 6 Nguyễn Thị Kim Loan 6 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tác động của ánh sáng lên thực vật Bảng 1.2. Tỉ lệ bức xạ R:Fr trong các loại môi tr ường khác nhau Bảng 1.3. Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng k hác nhau lên thực vật Bảng 3.1. Số liệu thu đ ược từ quá trình tái sinh chồi từ lá Torenia Bảng 3.2. Số liệu thu đ ược trong quá trình nhân chồi từ lá Dâu tây Bảng 3.3. Số liệu thu đ ược từ quá trình kéo dài chồi Dâu tây Bảng 3.4. Số liệu thu đ ược từ thí nghiệm hình thành PLB từ phôi lan Hồ điệp Bảng 3.5. Số liệu thu đ ược từ thí nghiệm tái sinh cây con của Địa lan Đồ án tốt nghiệp 7 Nguyễn Thị Kim Loan 7 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Một số hình ảnh về cây Dâu tây Hình 1.2. Sự đa dạng về màu sắc của hoa Torenia Hình 1.3. Hình thái cấu tạo hoa Địa lan Hình 1.4. Sự đa dạng về hình dạng và màu sắc của Địa lan Hình 1.5. Sự đa dạng về hình dạng và màu sắc của lan Hồ điệp Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tái sinh chồi từ lá Dâu tây in vitro ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau Hình 3.1. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác nh au lên sự tái sinh chồi Torenia Hình 3.2. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác nh au lên sự tái sinh chồi Dâu tây Hình 3.2. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác n hau lên sự kéo dài chồi Dâu tây Hình 3.4. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác nhau lên sự hình thành PLB từ phôi lan Hồ điệp Hình 3.5. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng khác nhau l ên sự tái sinh cây con từ PLB của Địa lan Đồ án tốt nghiệp 8 Nguyễn Thị Kim Loan 8 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục hình v Danh mục bảng vi LỜI MỞ ĐẦU vii 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH C Ơ QUAN, PHÁT SINH H ÌNH THÁI VÀ QUANG PHÁT SINH HÌNH THÁI Ở THỰC VẬT 1 Sự phát sinh cơ quan và các y ếu tố ảnh hưởng 1 Phát sinh hình thái 3 Quang phát sinh hình thái 5 TẦM QUAN TRỌNG CỦA ÁNH SÁNG L ÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO 9 Ánh sáng với sự sống 9 Vai trò của ánh sáng đối với thực vật 9 Những thành tựu đạt được trên thế giới khi sử dụng các nguồn sáng nhân tạo khác nhau trong nuôi cấy mô 20 MỘT SỐ NGUỒN SÁNG NHÂN TẠO Đ ƯỢC SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 23 Một số thiết bị tạo nguồn sáng nhân tạo hiện nay 24 Đồ án tốt nghiệp 9 Nguyễn Thị Kim Loan 9 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Một số nguồn sáng nhân tạo đ ược sử dụng cho nuôi cấy mô thực vật 24 SƠ LƯỢC VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28 Cây Dây tây (Fragaria vesca L.) 28 Cây Torenia (Torenia spp.) 32 Cây Địa lan (Cymbidium spp.) 35 Cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis spp.) 39 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ T ÀI 42 VẬT LIỆU 42 Hệ thống nguồn chiếu sáng 42 Đối tượng nghiên cứu 42 Nguyên liệu thí nghiệm 43 Môi trường nuôi cấy 43 Hấp khử trùng 44 Điều kiện thí nghiệm 44 Dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 45 PHƯƠNG PHÁP 45 Bố trí thí nghiệm 45 Xử lý số liệu 49 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN THÍ NGHIỆM 1: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG KHÁC NHAU LÊN S Ự TÁI SINH CHỒI TỪ LÁ TORENIA 51 Đồ án tốt nghiệp 10 Nguyễn Thị Kim Loan 10 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang THÍ NGHIỆM 2: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG KHÁC NHAU LÊN S Ự TÁI SINH CHỒI TỪ LÁ V À SỰ KÉO DÀI CHỒI DÂU TÂY 55 THÍ NGHIỆM 3: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG KHÁC NHAU LÊN S Ự HÌNH THÀNH PLB T Ừ PHÔI LAN HỒ ĐIỆP 62 THÍ NGHIỆM 4: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG KHÁC NHAU LÊN S Ự TÁI SINH CÂY CON TỪ PLB CỦA ĐỊA LAN 65 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC Đồ án tốt nghiệp 11 Nguyễn Thị Kim Loan 11 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang LỜI MỞ ĐẦU Tiến trình phát triển của công nghệ sinh học của nuôi cấy mô thực vật trong bốn thập niên qua đã đạt được nhiều thành tựu nổi bật. Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào đã phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây, rất nhiều ph òng thí nghiệm tư nhân, doanh nghi ệp nhà nước cũng như các công ty nước ngoài đã đầu tư các cơ sở nhân giống với qui mô lớn. Những loài cây có giá trị kinh tế như lan Hồ điệp, Địa lan, Dâu tây… th ường được chú trọng trong vi nhân giống. Chất lượng các cây giống này phụ thuộc rất nhiều vào quá trình nuôi cấy in vitro. Hình thái và sinh lý của thực vật được nuôi cấy in vitro được điều hòa bởi các nhân tố vi môi trường như: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng v à nguồn carbon. Ánh sáng l à một nhân tố quan trọng trong số đó, nó ảnh h ưởng đến toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật in vitro. Nhiều hệ thống đèn chiếu sáng đã được nghiên cứu sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật như: đèn huỳnh quang, đèn halogen, đèn natri, đèn nóng sáng G ần đây, đèn LED cũng đã được phát triển. Với các ưu điểm như tiêu thụ năng lượng thấp, tuổi thọ cao, có nhiều dải m àu, không phát ra tia UV, phát r ất ít tia hồng ngoại, kích thước nhỏ dễ thay đổi trong thiết kế… đ èn LED có thể thay thế dần các nguồn chiếu sáng khác trong vi nhân giống. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề t ài “Vai trò của ánh sáng trong sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái ở các cơ quan nuôi cấy của một số loài cây có giá trị kinh tế”, nhằm tìm ra điều kiện chiếu sáng thích hợp cho từng giai đoạn phát triển của từng loại cây trồng (lan Hồ điệp, Địa lan, Dâu tây, Torenia). Hy vọng nghiên cứu này sẽ làm rõ thêm tác dụng của ánh sáng trong quá tr ình tái sinh, phát sinh hình thái, sinh tr ưởng và phát triển của thực vật nuôi cấy in vitro. Đồ án tốt nghiệp 12 Nguyễn Thị Kim Loan 12 Lớp 47 Công nghệ sinh học – Đại học Nha Trang Phần 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU [...]... TRÌNH PHÁT SINH CƠ QUAN, PHÁT SINH H ÌNH THÁI VÀ QUANG PHÁT SINH HÌNH THÁI Ở THỰC VẬT 1.1.1 Sự phát sinh cơ quan và các y ếu tố ảnh hưởng 1.1.1.1 Sự phát sinh cơ quan Mặc dù sự phát sinh cơ quan đã được ghi nhận từ rất lâu, nh ưng cho đến nay, cơ chế của nó vẫn chưa được hiểu biết thấu đáo Rễ, chồi và hoa là những cơ quan có thể phát sinh từ nuôi cấy mô Phôi không đ ược xem là một cơ quan do nó không có. .. trắng sẽ tăng cường sinh trưởng cho cây (Internet 4) 1.2.2.4 Vai trò của ánh sáng lên quá trình phát sinh hình thái của thực vật Quang phát sinh hình thái là quá trình ki ểm soát sự sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái của thực vật dưới ánh sáng Quá trình này được điều khiển bởi ít nhất bốn con đường khác nhau của các quang thụ quan Trong điều kiện tối, cây phát triển theo một ch ương trình... và sự nảy mầm Quang phát sinh hình thái được định nghĩa là những thay đổi về hình dạng và chức năng của một cơ quan dưới đáp ứng những thay đổi trong môi tr ường chiếu sáng Quang phát sinh hình thái (sinh tr ưởng dưới ánh sáng) bao gồm sự phân hóa các lục lạp được phân hóa, tích tụ các chất diệp lục (chlorophyll) v à phát triển lá Phát sinh hình thái có thể được cảm ứng bởi ánh sáng đỏ, đỏ xa v à ánh. .. ánh sáng đỏ giúp tăng sự phát t riển, phát sinh hình thái và biệt hóa các cây Điều khiển sự phát triển, phát sinh h ình thái bằng cách thay đổi chất lượng ánh sáng là một kỹ thuật quan trọng trong vi nhân giống (Kozai và cộng sự, 1992) Seabrook (1987) tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn sáng khác nhau trên đối tượng cây Khoai Tây và thấy rằng chúng có tác động l ên sự phát triển và phát sinh. .. hưởng đến sự tăng trưởng chồi và phát sinh hình thái bên cạnh vai trò của nó trong quang hợp (Hughes, 1981) Debergh và cộng sự (1992) và Ziv (1991) đã chứng minh rằng cường độ chiếu sáng có tác dụng điều hòa kích thước lá và thân cũng như con đường phát sinh hình thái đồng thời ảnh hưởng đến sự hình thành sắc tố và thủy tinh thể của cây con Chất l ượng ánh sáng có ảnh hưởng quan trọng trên một số. .. từ phôi, cây con và các phần của cây con mà không xảy ra ở các mẫu cấy thu đ ược từ cây trưởng thành Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi và rễ) Sự hình thành chồi và rễ đều bị ức chế bởi GA 3 và ABA Trong nhiều trường hợp, ánh sáng kích thích sự tạo chồi Cũng có tr ường hợp ngoại lệ là có một số cây trồng lại có thể tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối: Chồi hoa của Freesia... sáng đỏ có ảnh hưởng lên sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của cây Khoai tây và đề nghị sử dụng thử nghiệm LED nh ư một nguồn sáng cho nuôi cấy mô Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng đáng kể lên sự phát triên và phát sinh hình thái ở cây in vitro và ex vitro (Warrington và Michell, 1976; Morga n và Smith, 1981; Smith, 1982; Tibbitts và cộng sự, 1983; Mortensen và Stromme, 1987; Economou và Read, 1987;... TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC VẬT NUÔI CẤY 1.2.1 Ánh sáng với sự sống Từ xa xưa, ánh sáng đã có vai trò trung tâm trong nh ững vấn đề về vật chất và tinh thần của con người Ánh sáng tương tác với những quá trình sinh học qua nhiều hình thức khác nhau, có thể chia th ành 3 phạm trù chính: Thứ nhất, nó có thể gây hoại tử tế b ào hay cơ quan Thứ hai, ánh sáng là môi trường mà cơ quan sinh vật có thể nhận... đỏ xa v à ánh sáng xanh Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn lên sự quang phát sinh hình thái ở thực vật thông qua các quang thụ quan của cây (Kendrick v à Kronenberg, 1994) Thực vật bậc cao có ít nhất ba loại quang thụ thể (photore ceptor) có độ hấp thu chọn lọc với các ánh sáng quang phổ khác nhau, điều hòa sự phát sinh hình thái, đó là: Phytochrome (520 nm; đỏ/đỏ xa) Các thụ quan nhận ánh sáng xanh gồm... nghiên cứu trên cây hoàn chỉnh, tác giả cho rằng quá tr ình tái sinh mang tính chất di truyền và con người có thể vận dụng những tính chất tự nhiên này 1.1.3 Quang phát sinh hình thái Thực vật có thể bị tác động bởi ánh sáng trực tiếp, chất l ượng ánh sáng, cường độ ánh sáng và quang kỳ Ánh sáng gây ra tính h ướng ánh sáng, quang phát sinh hình thái, sự phân hóa lục lạp và các phản ứng khác của thực vật . hưởng 1 Phát sinh hình thái 3 Quang phát sinh hình thái 5 TẦM QUAN TRỌNG CỦA ÁNH SÁNG L ÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO 9 Ánh sáng với sự sống 9 Vai trò của ánh. triển và phát sinh hình thái ở các cơ quan nuôi cấy của một số loài cây có giá trị kinh tế , nhằm tìm ra điều kiện chiếu sáng thích hợp cho từng giai đoạn phát triển của từng loại cây trồng (lan. iv Danh mục hình v Danh mục bảng vi LỜI MỞ ĐẦU vii 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH C Ơ QUAN, PHÁT SINH H ÌNH THÁI VÀ QUANG PHÁT SINH HÌNH THÁI Ở THỰC VẬT 1 Sự phát sinh cơ quan và các y