1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG =====***===== ĐẶNG TRUNG THÀNH NGHIÊN CỨU CHIẾT RÚT CHITINASE TỪ LÁ KHOAI LANG VÀ BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT OLYGO-CHITIN LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ Sau thu hoạch Mã số: 60.54.10 Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Trần Thị Luyến Nha Trang, tháng 06/2008 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là thực hiện đề tài nghiêm túc, trung thực. Các số liệu thu được trong đề tài là kết quả nghiên cứu của bản thân, không sao chép số liệu của các tác giả khác. Người cam đoan 3 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được đề tài thạc sỹ, cũng như bản thân trưởng thành như ngày hôm nay, cho tôi xin được gửi lời cảm ơn tới bố mẹ tôi đã sinh thành và dưỡng dục, động viên giúp đỡ tôi những lúc khó khăn, chia sẻ niềm vui nỗi buồn trong suốt cuộc đời. Cho tôi được cảm ơn tới các thầy cô giáo đã dạy dỗ tận tình, trang bị những kiến thức cần thiết để tôi trưởng thành như ngày hôm nay. Tôi xin cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm khoa Chế biến, các thành viên trong bộ môn Công nghệ Chế biến, các thành viên trong khoa Chế biến đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong công việc, giúp tôi hoàn thành đề tài cũng như động viên tinh thần những lúc khó khăn. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn tới GS.TS. Trần Thị Luyến. Cô không chỉ là người hướng dẫn thực hiện đề tài cho tôi mà còn hướng cho tôi đi theo con đường nghiên cứu khoa học tuy gian khổ nhưng cũng có nhiều vinh quang. Tôi cũng xin cảm ơn tới các bạn cùng học lớp cao học 2004 và bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. 4 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CPE: Chế phẩm enzyme chitinase DC: Dịch chiết COS: chitoolygosaccharide DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Một số thành phần trong lá khoai lang trong 100 g lá 19 Bảng 2: Nồng độ glucosamine chuẩn trong dung dịch. (phụ lục 2) Bảng 3: Mối tương quan giữa hàm lượng glucosamine và độ hấp phụ: (phụ lục 2) 5 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 Chương 1 : TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 10 1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 10 1.1.1.Giới thiệu chung về enzyme 10 1.1.2.Giới thiệu enzyme chitinase 17 1.1.3. Giới thiệu về cây khoai lang 19 1.1.4.Giới thiệu về chitin và một số dẫn xuất của chitin 21 1.2.CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE 25 1.2.1. Các công trình nghiên cứu ngoài nước. 25 1.2.2. Các công trình nghiên cứu trong nước. 29 Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31 2.1.1.Nguồn thu nhận enzyme chitinase 31 2.1.2. Vật liệu sử dụng để sản xuất olygo-chitin 31 2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1.Phương pháp thu nhận và bảo quản nguyên liệu thu chitinase: 33 2.2.2. Bố trí thí nghiệm lựa chọn giống khoai lang thích hợp 33 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tình trạng sâu bệnh của cây, vị trí chiết rút đến hoạt độ chitinase. 34 2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định phương pháp tách chiết enzyme chitinase 35 2.2.5. Bố trí thí nghiệm thu nhận chế phẩm enzyme (CPE) 36 2.2.6. Xác định hoạt độ của enzyme chitinase theo phương pháp NELSON 38 2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ chitinase DC và CPE. 38 2.2.8. Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của chitinase DC và CPE. 39 2.2.9.Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitin bằng chế phẩm chitinase (CPE). 39 6 2.2.10. Các phương pháp phân tích. 41 2.2.11. Các thiết bị thí nghiệm đã sử dụng. 42 2.2.12. Phương pháp xử lý số liệu 42 Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43 3.1.XÁC ĐỊNH LOẠI KHOAI LANG SỬ DỤNG CHIẾT CHITINASE. 43 3.1.1. Kết quả chọn giống khoai lang sử dụng chiết rút chitinase. 43 3.1.2. Kết quả nghiên cứu hoạt độ chitinase từ các phần khác nhau của cây khoai lang. 44 3.1.3. Kết quả nghiên cứu tình trạng sâu bệnh của cây ảnh hưởng đến hoạt độ chitinase 45 3.2. XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE DC, CPE 3.2.1.Kết quả nghiên cứu tách chiết chitinase DC 47 3.2.2. Kết quả nghiên cứu thu nhận CPE 50 3.3. NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘ CHITINASE DC VÀ CPE. 55 3.3.1. Kết quả xác định nhiệt độ thích hợp đối với hoạt độ chitinase. 55 3.3.2. Kết quả xác định độ bền nhiệt của chitinase. 57 3.3.3. Kết quả xác định pH thích hợp đối với hoạt độ chitinase 58 3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG ENZYME CHITINASE. 59 3.4.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân chitin bằng chitinase. 59 3.4.2. Hiệu suất thủy phân chitin của chitinase 67 Kết luận và đề xuất ý kiến 73 1.Kết luận: 73 2.Đề xuất ý kiến 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC Hình 3.1. Ảnh hưởng của giống khoai lang khác nhau đến hoạt độ chitinase. 43 Hình 3.2. Ảnh hưởng từng phần khác nhau của cây đến hoạt độ chitinase. 44 Hình 3.3. Ảnh hưởng tình trạng bệnh đến hoạt độ enzyme thu được. 46 7 Hình 3.4.Ảnh hưởng của dung môi chiết rút đến hoạt độ của chitinase. 47 Hình 3.5. Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hoạt độ chitinase. 48 Hình 3.6. Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt độ chitinase. 49 Hình 3.7.Ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa đến hoạt độ của chitinase. 50 Hình 3.8.Ảnh hưởng nồng độ ethanol (%) đến hoạt độ chitinase 52 Hình 3.9. Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hoạt độ CPE. 54 Hình 3.10.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chitinase DC và CPE. 55 Hình 3.11.Độ bền nhiệt của chitinase trong DC và CPE. 57 Hình 3.12.Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của chitinase trong DC và CPE. 58 Hình 3.13.Ảnh hưởng của nồng độ CPE và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. . 60 Hình 3.14.Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. 62 Hình 3.15.Ảnh hưởng của pH và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. 64 Hình 3.16.Ảnh hưởng của nồng độ huyền phù chitin và thời gian đến lượng olygo- chitin thu được. 65 Hình 3.17.Ảnh hưởng của nồng độ ethanol và thời gian đến lượng olygo-chitin thu được. 67 Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hiệu suất thủy phân chitin. 68 Hình 3.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân chitin 69 Hình 3. 20: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thủy phân. 70 Hình 3. 21: Ảnh hưởng của nồng độ chitin đến hiệu suất thủy phân 70 Hình 3.22: Đường chuẩn glucosamine (Phụ lục 2) 8 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, ngành công nghệ sinh học đang có bước phát triển mạnh mẽ. Nhiều ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất và đời sống ngày càng được chú trọng. Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học là một xu thế tất yếu trong điều kiện các ngành sản xuất truyền thống đang gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Các chế phẩm sản xuất bằng con đường sinh học không chỉ thân thiện với môi trường sống, mang lại giá trị kinh tế cao mà còn ứng dụng rất hiệu quả trong nhiều lĩnh vực đời sống. Enzyme là một phần không thể thiếu được của công nghệ sinh học. Hiện nay, có rất nhiều loại enzyme được nghiên cứu và ứng dụng của chúng ngày càng được mở rộng. Trước đây các nghiên cứu tập trung nhiều vào enzyme protease thì ngày nay nhiều loại enzyme khác như cellulase, lipase, chitinase, deacetylase, collagenase, pectinase cũng đã được nghiên cứu và phát triển rộng rãi. Việt Nam có nguồn lợi thủy sản rất dồi dào, ngành công nghệ chế biến phát triển mạnh vì vậy các phế liệu từ chế biến thủy sản rất lớn. Một trong các dạng phế liệu là nguồn chitin từ vỏ loài giáp xác như tôm, cua. Tận dụng nguồn phế liệu này không những giải quyết triệt để vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra các chế phẩm mới có giá trị, làm tăng giá trị kinh tế cho ngành thủy sản. Chitin đã được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm và công nghiệp. Chitin và dẫn xuất chitosan là hai chất được ứng dụng nhiều nhất. Nhưng do chúng có đặc điểm không hòa tan trong nước nên ứng dụng vẫn có những hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu các chế phẩm từ chitin như olygo-chitin, olygo-chitosan, glucosamine, N-acetyl-β-D-glucosamine để khắc phục nhược điểm trên, khám phá thêm nhiều đặc tính mới cũng như mở rộng ứng dụng của polymer này là xu hướng nghiên cứu trong thời gian tới. Để tạo ra các chế phẩm có khả năng hòa tan trong nước từ chitin, chitosan có thể dùng phương pháp hóa học, dùng các tia mang năng lượng cao và một số phương pháp khác để cắt đứt mạch polymer của chúng. Các phương pháp trên thu được sản phẩm với hiệu suất cao nhưng có nhược điểm lớn là hoạt tính các chế phẩm thấp, nhiều tạp chất, gây ô nhiễm môi trường và gây độc cho người trực tiếp sản xuất. 9 Sử dụng các enzyme chitinase, chitosanase thủy phân chitin, chitosan tạo ra các chế phẩm olygo-chitin, olygo-glucosamine có hoạt tính sinh học cao, điều kiện sản xuất nhẹ nhàng, không gây ô nhiễm môi trường và ít ảnh hưởng đến sức khỏe người lao động là hướng đi tốt. Có thể sử dụng nguồn enzyme chitinase, chitosanase từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Từ yêu cầu cấp thiết của thực tế trên, tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu chiết rút chitinase từ lá khoai lang và bước đầu thử nghiệm thủy phân chitin để sản xuất olygo-chitin. Mục đích của luận văn: Bước đầu nghiên cứu về tính chất của enzyme chitinase từ thực vật (lá khoai lang), tìm các điều kiện thích hợp để thu nhận enzyme chitinase và sử dụng enzyme để thủy phân chitin tạo olygo-chitin qua đó mở rộng ứng dụng của chitin và thay thế phương pháp hóa học sản xuất olygo-chitin gây ô nhiễm môi trường và chất lượng sản phẩm thấp. Nội dung nghiên cứu của luận văn: - Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ lá khoai lang và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này. - Bước đầu nghiên cứu sử dụng chitinase thủy phân chitin thu olygo-chitin. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận văn: Kết quả nghiên cứu của luận văn góp phần hiểu biết thêm về enzyme chitinase từ lá khoai lang nói riêng và chitinase từ thực vật nói chung. Nghiên cứu đưa ra được các điều kiện thích hợp cho quá trình chiết rút enzyme chitinase từ lá khoai lang, các yếu tố ảnh hưởng chitinase và bước đầu nghiên cứu sử dụng chitinase chiết rút được vào quá trình thủy phân chitin thu chế phẩm olygo-chitin. Kết quả thu được là cơ sở để đánh giá hiệu quả và khả năng ứng dụng của chitinase thực vật vào sản xuất olygo-chitin, từ đó cải thiện được chất lượng và hiệu quả sản phẩm so với phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm. 10 Chương 1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 1.1.1.Giới thiệu chung về enzyme Enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn (đa số các enzyme có phân tử lượng từ 6.000 đến 1.000.000 dalton). Qua quá trình nghiên cứu cấu trúc, tính chất đã khẳng định bản chất của enzyme là protein. Các kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme được cấu tạo từ các L-α-acid amin kết hợp với nhau bằng liên kết peptit [6]. Người ta đã phát hiện ra rằng, các enzyme đã xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra bên trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống được thực hiện một cách nhịp nhàng, cân đối và theo những chiều hướng xác định. Chúng không chỉ có khả năng xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong tế bào sống mà sau khi được tách ra khỏi tế bào sống chúng vẫn có khả năng xúc tác cho các phản ứng xảy ra. Sự khác biệt giữa xúc tác bằng enzyme so với các chất xúc tác vô cơ, hữu cơ là ở chỗ xúc tác bằng enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn. Nó có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn, hàng triệu lần so với xúc tác bằng các chất vô hoặc hữu cơ. Ví dụ: trong phản ứng thủy phân sacaroza, nếu dùng chất xúc tác là sacaraza thì tốc độ của phản ứng tăng nhanh gấp 2.10 2 lần so với dùng acid làm chất xúc tác [6]. Đặc điểm ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác là khi sử dụng enzyme làm chất xúc tác có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng như ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể hay ở môi trường bên ngoài, pH thích hợp của enzyme gần pH sinh lý. Ngoài ra enzyme còn có khả năng lựa chọn cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng. Đó là tính đặc hiệu của enzyme [6], [8]. Ví dụ: Chất xúc tác là acid không có tính đặc hiệu. Nó có thể xúc tác thủy phân cắt đứt liên kết peptid của protein, liên kết glucosid của tinh bột, của agar, [...]... 2.1.1.Nguồn thu nhận enzyme chitinase Qua các tài liệu đã nghiên cứu về enzyme từ nguồn thực vật cho thấy:Có nhiều thực vật có thể sử dụng làm nguồn để chiết rút chitinase như sau: Chiết rút chitinase từ lá cây đậu, lá cây đỗ tương, lá khoai lang, khoai tây, khoai mỡ lúa mỳ, lúa mạch, lá cây thuốc lá vv Khoai lang là đối tượng được lựa chọn để nghiên cứu chiết rút enzyme chitinase vì khoai lang được trồng rất... tài nghiên cứu về chitinase từ thực vật là hướng đi mới Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đưa ra được giống khoai thích hợp cho chiết 30 rút enzyme, đã nghiên cứu xác định điều kiện chiết enzyme thích hợp, các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme và bước đầu nghiên cứu sử dụng chitinase để thuỷ phân chitin trong sản xuất olygo -chitin 31 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1.Nguồn... glycol chitin Theo nghiên cứu thì hoạt độ chitinase chiết được từ các phần khác nhau của cây khoai lang là khác nhau Hoạt độ của chitinase giảm dần khi chiết từ các bộ phận từ cây theo thứ tự lá, chồi (búp), cuống lá, củ Trong cùng điều kiện thí nghiệm, hoạt độ chitinase từ lá cao hơn dây khoai Hoạt độ chitinase từ các lá khoai bị côn trùng cắn sẽ có hoạt độ cao hơn so với các lá còn nguyên vẹn Hoạt độ chitinase. .. lá khoai chưa được tận dụng triệt để, gây lãng phí Theo một số tài liệu nghiên cứu cho thấy trong khoai lang có tồn tại enzyme chitinase, tùy theo từng bộ phận của cây sử dụng để chiết sẽ thu được hoạt độ của enzyme khác nhau Có thể thu enzyme chitinase từ lá khoai, cuống lá, mầm chồi vv… [40], [44], [79] 2.1.2 Vật liệu sử dụng để sản xuất olygo -chitin Vật liệu sử dụng để sản xuất olygo -chitin là chitin. .. 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE 1.2.1 Các công trình nghiên cứu ngoài nước Theo nghiên cứu của Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying-Chou Chen (1998) từ Viện Công nghệ Sinh học Đài Loan Các tác giả đã nghiên cứu về hoạt độ của enzyme chitinase từ cây khoai lang Kết quả nghiên cứu cho thấy: Hoạt độ của chitinase được tìm thấy trong dịch chiết từ các phần khác nhau của cây khoai lang Cơ chất sử dụng để xác... thí nghiệm, rửa sạch tạp chất và tiến hành chiết rút ngay enzyme Trong thời gian chuẩn bị thí nghiệm có thể bảo quản lá khoai lang trong ngăn lạnh của tủ lạnh trước khi tiến hành chiết rút enzyme 2.2.2 Bố trí thí nghiệm lựa chọn giống khoai lang thích hợp Nghiên cứu ảnh hưởng của giống khoai đến hoạt độ enzyme chitinase thu được Chọn lá khoai lang từ ba giống khoai lang bao gồm: giống VX-37, giống khoai. .. thương của cây như từ lá, cuống của lá bị tổn thương và lá, cuống của lá không bị tổn thương đến hoạt độ chitinase thu được trên giống khoai lang đã được chọn Xác định hoạt độ của chitinase thu được So sánh, phân tích và đánh giá kết quả thu được Tiến hành nghiên cứu xác định ảnh hưởng các phần (các bộ phận khác nhau) của cây khoai lang bao gồm lá, cuống lá và dây khoai lang đến hoạt độ chitinase thu được... cải bắp, khoai lang, khoai tây, khoai mỡ, trong cây lúa, cây thuốc lá, cây lúa mỳ, lúa mạch vv… [36], [37], [44], [70], [74]… Chitinase thu từ động vật: Chitinase có tồn tại trong cơ thể một số động vật Các nhà khoa học đã nghiên cứu tách chiết và làm sạch chitinase thu được từ gan mực ống Nhật Bản (squid Todarodes pacificus) Chitinase còn thu được từ huyết thanh của bò Chitinase thu được từ động vật... N-acetylglucosaminidic của chitin Chitinase thu được từ dịch chiết được tinh sạch bằng sắc ký cho 2 enzyme chitinase C-1 và C-2 có khối lượng phân tử đều bằng 27 kDa, có điểm đẳng điện lần lượt 7.7 và 7.3 Chitinase C-1, C-2 có khoảng pH thích hợp 4.5 đến 6 và bền trong khoảng pH rất rộng từ 6.5 đến 10 chitinase thu được có khả năng thủy phân chitin, colloidal chitin, glycol chitin, cacboxymethyl chitin, 53% deacetylated... điện, khối lượng phân tử khác nhau Đối với các loài thực vật có chứa enzyme chitinase, chúng thường tồn tại ở các vị trí khác nhau của cây như lá, cuống lá, dây, mầm chồi vv… Chitinase được phân thành hai loại là endochitinase và exochitinase Endochitinase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt ngẫu nhiên các liên kết glucosid trong mạch polymer của chitin Exochitinase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt liên . tài: Nghiên cứu chiết rút chitinase từ lá khoai lang và bước đầu thử nghiệm thủy phân chitin để sản xuất olygo -chitin. Mục đích của luận văn: Bước đầu nghiên cứu về tính chất của enzyme chitinase. enzyme chitinase từ lá khoai lang nói riêng và chitinase từ thực vật nói chung. Nghiên cứu đưa ra được các điều kiện thích hợp cho quá trình chiết rút enzyme chitinase từ lá khoai lang, các. ảnh hưởng chitinase và bước đầu nghiên cứu sử dụng chitinase chiết rút được vào quá trình thủy phân chitin thu chế phẩm olygo -chitin. Kết quả thu được là cơ sở để đánh giá hiệu quả và khả năng