LỜI CẢM ƠN Trong thời gian vừa qua, em đ ã nhận được nhiều sự giúp đỡ tận t ình từ quý thầy cô, gia đình và bạn bè cả về vật chất và tinh thần, đã tạo điều kiện cho em ho àn thành đợt thực tập tốt nghiệp. Em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đặng Thúy B ình, thầy Phan Văn Út đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo trong qua tr ình thực hiện đề tài này. Xin được cảm ơn các quý thầy cô trong Khoa Nuôi trồng, đặc biệt l à bộ môn Bệnh học thủy sản, tr ường Đại học Nha Trang đ ã truyền đạt cho em những kiến thức trong suốt những năm học vừa qua. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, anh chị Viện Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang, tạo điều kiện cho em thực tập tại đây. Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đ ình, bạn bè, tập thể lớp 46BH đ ã luôn động viên giúp đỡ trong suốt quá tr ình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành c ảm ơn! Sinh viên thực hiện MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Giải thích thuật ngữ, chữ viết tắt v à ký hiệu Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU 1 Phần 1. TỔNG QUAN 2 1. VÀI NÉT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2 1.1. Họ cá mú (Seranidae) 2 1.1.1. Vị trí phân loại 2 1.1.2. Đặc điểm hình thái 2 1.1.3. Đặc điểm sinh học và phân bố 2 1.2. Đặc điểm chung về sán lá đ ơn chủ (Monogenea) 3 2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C ỨU BỆNH SÁN LÁ Đ ƠN CHỦ KÝ SINH TRÊN CÁ MÚ (EPINEPHELUS SPP.) 5 2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh sán lá đơn chủ ký sinh trên cá mú nói chung 5 2.1.1. Tình hình nghiên c ứu trên thế giới 5 2.1.2. Tình hình nghiên c ứu tại Việt Nam 7 2.2. Tình hình nghiên c ứu họ Diplectanidae (Monogenea, Monopiscotylidae) ký sinh trên cá mú ( Epinephelus spp.) 9 2.2.1. Trên thế giới 9 2.2.2. Việt Nam 11 2.3. Tình hình nghiên c ứu đặc điểm di truyền các lo ài sán lá đơn chủ 11 Phần 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 13 1. Thời gian, địa điểm, đối t ượng nghiên cứu 13 2. Phương pháp nghiên c ứu 14 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghi ên cứu 14 2.2. Phương pháp nghiên c ứu hình thái sán lá đơn chủ ký sinh trên cá 14 2.3. Phương pháp nghiên c ứu di truyền sán lá đ ơn chủ 17 Phần 3. KẾT QUẢ NGHI ÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 1. Đặc điểm hình thái các loài Monogenea thu ộc họ Diplectanidae Bychowsky, 1957 ký sinh trên mang cá mú ( Epinephelus spp.) 22 1.1. Mô tả đặc điểm hình thái 22 1.1.1.Giống Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958 23 1.1.2. Giống Diplectanum Diesing, 1858 33 1.2. Mức độ cảm nhiễm 37 2. Đặc điểm di truyền các lo ài Monogenea thu ộc họ Diplectanidae Bychowsky, 1957 ký sinh trên mang cá mú ( Epinephelus spp.) 40 Phần 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 46 1. Kết luận 46 1.1. Đặc điểm hình thái và mức độ cảm nhiễm của cá c loài sán lá đơn ch ủ thuộc họ Diplectanidae (Monticelli, 1903) Bychowsky, 1957 ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa 46 1.2. Đặc điểm di truyền của các lo ài sán lá đơn ch ủ thuộc họ Diplectanidae ký sinh trên cá mú ( Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa 46 2. Đề xuất ý kiến 47 2.1. Về nghiên cứu bệnh sán lá đ ơn chủ ký sinh trên cá mú 47 2.2. Về nghiên cứu di truyền 47 Tài liệu tham khảo 48 Phụ lục GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU CĐCN : cường độ cảm nhiễm TLCN : tỷ lệ cảm nhiễm DNA : deoxyribonucleic acid Bp : base pair - cặp bazơ cs : cộng sự ctv : cộng tác viên dd : dung dịch gel : thạch ITS1 : đoạn chèn giữa gen 18S và 5,8S KHV : kính hiển vi KST : ký sinh trùng MCO : male copulatory organ – cơ quan giao c ấu đực n. subfam : new subfamily – họ phụ mới V : thể tích V dd : thể tích dung dịch Vagina : cơ quan giao cấu cái lsr : large subunit ribosomal – ribosome tiểu phần lớn ssr : small subunit ribosomal – ribosome tiểu phần nhỏ Mồi : là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn v à DNA polymerase s ẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới [2]. DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Số lượng và kích cỡ các mẫu cá mú 13 Bảng 2.2. Thành phần và thể tích dd ly trích 18 Bảng 2.3. Thành phần và thể tích dd dùng cho phản ứng PCR 19 Bảng 3.1. Thành phần loài Monogenea thu ộc họ Diplectanidae Bychowsky, 1957 ký sinh trên mang cá mú ( Epinephelus spp.) 22 Bảng 3.2. Kích thước các loài ký sinh trùng thu ộc họ Diplectanidae ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp.) 35 Bảng 3.3. Tên tác giả, năm công bố và số serries trình tự gen của các loài sán lá đơn chủ tại ngân hàng gen. 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Vòng đời của sán lá đơn chủ 4 Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghi ên cứu 14 Hình 2.2. Mô tả cách đo Monogenea (theo Justin, 2007) 16 Hình 3.1. Loài P. coioidesis Bu, Leong, Wong, Woo & Foo, 1999. A – toàn bộ cơ thể; B – cơ quan giao cấu đực; C – cơ quan giao cấu cái; D – hình chụp cơ quan giao cấu 24 Hình 3.2. Cơ quan giao c ấu đực và cái của loài P. cupatus 24 Hình 3.3. Loài P. cupatus. A – giác bám và đĩa bám; B – cơ thể; C – giác bám; D – cơ quan giao cấu đực; E – thanh nối bụng; F – thanh nối lưng; G – móc bám bụng; H – móc bám lưng 25 Hình 3.4. Loài P. mellanesinensis . A – giác bám và đĩa bám; B – giác bám; C – thanh nối bụng; D – thanh nối lưng; E – móc bám bụng; F – móc bám lưng 26 Hình 3.5. Loài P. mellanesinensis . A – cơ quan giao cấu đực và cái; B – cơ quan giao cấu cái; C – trứng; D – dạng ấu trùng; E – cơ thể 26 Hình 3.6. Loài P. summanoides, A – Cơ quan giao c ấu đực và cái; B – Toàn bộ cơ thể; C – Đĩa bám 27 Hình 3.7. Loài P. summanae Young, 1969 28 Hình 3.8. Loài P. epinepheli Yamaguti,1938. A, B – cơ thể; C – dạng ấu trùng 29 Hình 3.9. Loài P. epinepheli Yamaguti,1938. A – giác bám và đĩa bám; B – trứng; C – cơ quan giao cấu cái 29 Hình 3.10. Loài P. lantauensis Beverley – Burton & Suriano, 1981. A – cơ quan giao cấu đực và cái; B - Các biến dị của cơ quan giao cấu cái 30 Hình 3.11. Loài P. lantauensis Beverley – Burton & Suriano, 1981 31 Hình 3.12. Loài P. sp 1 31 Hình 3.13. Loài P. sp 1. Giác bám và đ ĩa bám 32 Hình 3.14. Loài P. sp 2. A,C – cơ thể. B – giác bám và đĩa bám, D – cơ quan giao cấu cái 33 Hình 3.15. Loài Diplectanum grouperi . A, C – toàn bộ cơ thể; B – Cơ quan giao c ấu đực 34 Hình 3.16. Loài Diplectanum grouperi . A – đẻ trứng; B – cơ quan giao cấu đực và trứng 34 Hình 3.17. Biểu đồ cường độ cảm nhiễm các lo ài Monogenea trên cá Mú Đen ( E. coioides) nuôi và tự nhiên 37 Hình 3.18. Biểu đồ tỷ lệ cảm nhiễm các lo ài Monogenea trên cá Mú Đen ( E. coioides) nuôi và tự nhiên 38 Hình 3.19. Biểu đồ mức độ cảm nhiễm của một số lo ài Monogenea trên các loài ký ch ủ đặc hữu 39 Hình 3.20. Cây phát sinh loài 43 Hình 3.21. Cơ quan giao cấu đực của một số lo ài thuộc giống Pseudorhabdosynochus và Diplectanum. 44 1 MỞ ĐẦU Hiện nay, ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang dần chuyển đổi cơ cấu sang một số đối tượng khác có tiềm năng v à giá trị kinh tế cao hơn. Sau thời kỳ hoàng kim của con tôm sú là sự lên ngôi của cá biển, trong đó đáng quan tâm là cá mú (Epinephelus spp.), cá Chẽm (Lates calcarifer), cá Giò (Rachycentron canadum ) và cá hồng (Lutjanus spp.). Những loài cá này là thức ăn rất quan trọng và bổ dưỡng cho con người và được nuôi chủ yếu trong lồng nổi ở nhiều nước. Nghề nuôi cá biển tại Đông Nam Á bắt đầu từ những năm 1970 và phát triển nhanh chóng trong suốt thập ni ên 80 với những trại sản xuất giống cá chẽm và một số đối tượng quan trọng khác như cá Mú Đen (Epinephelus coioides), cá Mú Mè (E. malabaricus), cá Hồng Vân Bạc (Lutjanus arhentinaculatus),…[36]. Hiện nay, phong trào nuôi cá biển phát triển rộng khắp tr ên thế giới với sản lượng hàng năm tăng nhanh. Theo d ự báo đã được công bố, nghề nuôi cá biển sẽ phát triển nhanh và đạt tới sản lượng từ 3,5 – 4 triệu tấn năm 2010 [52]. Nước ta đã và đang mở rộng diện tích nuôi cũng nh ư các đối tượng nuôi cá biển tuy nhiên vẫn chỉ tập trung ở một số tỉnh có lợi thế về biển nh ư Quảng Ninh, Hải Phòng, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận [3]. Trong đó, Khánh Hòa là địa phương nuôi cá biển phát triển mạnh trong cả nước, cá được nuôi tập trung ở huyện Cam Ranh, huyện Vạn Ninh và Vũng Ngán [16]. Cùng với sự phát triển nhanh chóng đó th ì dịch bệnh bùng phát đã làm tổn thất kinh tế ở nhiều nước trong khu vực và trên thế giới. Bệnh KST là một trong những nguy ên nhân quan trọng gây ra nhiều lo ngại cho nghề nuôi cá biển nói chung v à nghề nuôi cá mú nói riêng. Với điều kiện như hiện nay, phòng chống dịch bệnh đang trở th ành nhu cầu bức bách. Muốn ph òng trị bệnh có hiệu quả tốt thì cần phải hiểu biết r õ về đối tượng gây hại. Chính v ì thế, em đã thực hiện đề tài: “Dựa vào đặc điểm hình thái và di truy ền để phân loại một số loài sán lá đơn ch ủ (Monogenea) thuộc họ Diplectanidae ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa” với các nội dung nh ư sau: - Mô tả đặc điểm hình thái các loài sán lá đơn chủ thuộc họ Diplectanidae ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa. - Lập cây phát sinh lo ài, so sánh đặc điểm di truyền của các lo ài sán lá đơn chủ thuộc cây phát sinh loài. 2 Phần 1 TỔNG QUAN 1. VÀI NÉT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.1. Họ cá mú (Seranidae) Cá mú là một trong những lo ài cá biển có giá trị kinh tế cao, sống ở v ùng biển nhiệt đới và cận nhiêt đới. Hiện nay có nhiều loài đang trở thành những đối tượng nuôi quan trọng nh ư cá Mú Mè (Epinephelus bleekeri), cá Mú Cọp (E. fuscoguttatus), cá Mú Chấm Đỏ (E. akaara), cá Mú Chuột (Cromileptes altivelis )… 1.1.1. Vị trí phân loại Theo Fao, 2003 nh ững loài cá mú trong nghiên c ứu có vị trí phân loại nh ư sau: Ngành Vertebrata Lớp Osteichthys Bộ Perciformes Họ Serranidae Giống Epinephelus Loài Epinephelus spp. 1.1.2. Đặc điểm hình thái Cá mú rất đa dạng về màu sắc, vân chấm, kích thước và hình dạng thân. Chúng có thể thay đổi các đặc điểm này theo từng giai đoạn, trạng thái sinh lý hay môi tr ường. Tuy nhiên, cá mú có những điểm chung như: thân hình thoi cân đối, miệng rộng, hàm dưới nhô ra hướng lên trên, có nhiều răng nhỏ, sắc nhọn. Cá mú thường chỉ có một vây lưng với từ 7-11 tia vây cứng và 10-21 tia vây mềm. Vây hậu môn có 3 gai cứng, con đực hơi dài hơn so với con cái. Nắp mang có 3 gai cứng [10][14][30]. 1.1.3. Đặc điểm sinh học và phân bố Họ cá mú (Serranidae ) có 75 giống và trên 400 loài sống chủ yếu ở vùng biển cận nhiệt đới, nhiệt đới Thái B ình Dương, Đại Tây Dương và Ấn Độ Dương. Tại Việt Nam tìm thấy 48 loài thuộc 11 giống, trong đó có kho ảng 14 loài thuộc 3 giống Epinephelus với nhiều loài đang là đối tượng nuôi phổ biến . Điều này cho thấy thành phần giống loài cá mú tại Việt Nam khá phong phú [10]. Cá mú là loài thích s ống đáy, nơi có rạn san hô và đá ngầm. Đa số các loài phân bố ở độ sâu nhỏ hơn 100m. Chúng là loài rộng muối, có thể sống đ ược ở độ mặn từ 15- 45‰, tốt nhất ở 20-30‰, sinh sản và phát triển ở 15-35 o C, thích hợp nhất là 24-30 o C. Cá mú là cá dữ, trong tự nhiên thức ăn chủ yếu của chúng l à các loài giáp xác, cá, và động vật không xương sống, tập tính bắt mồi đặc tr ưng là rình ở các khe đá, bụi rong và bụi san hô. Cá mú có tốc độ sinh tr ưởng khá nhanh, cá giống 30 -50 g nuôi sau 6-8 tháng đạt 500 g - 1 kg. Nhưng tốc độ này lại khác nhau giữa các lo ài: ví dụ cá Mú Nghệ (Epinephelus laceolatus ) đạt 3-4 kg/năm, trong khi đó cá Mú Son ( Cephalopholis miniata) chỉ 0,3-0,4 kg/năm. Cá mú còn có đặc điểm chuyển đổi giới tính, lúc nhỏ l à con cái, sau một thời gian chuyển thành con đực. Thời điểm và kích thước chuyển đổi không giống nhau giữa các loài khác nhau [1][15][31]. 1.2. Đặc điểm chung về sán lá đ ơn chủ (Monogenea) Trên thế giới, có khoảng 1500 loài sán lá đơn chủ khác nhau [34], chúng là ký sinh trùng ngo ại ký sinh được tìm thấy trên bề mặt cơ thể (như: mang, da, vây, niêm mạc miệng, mũi và mắt cá). Sán lá đơn chủ có chu kỳ phát triển trực tiếp, không qua giai đoạn ký chủ trung gian, không xen kẽ thế hệ v à cũng không thay đổi ký chủ. Sán lá đơn chủ hút chất nhầy, biểu mô hoặc máu của ký chủ [ 7][8]. Nhìn chung, cơ thể sán lá đơn chủ có kích thước nhỏ, kích thước chiều dài khoảng 0.5- vài mm. Chẳng hạn như sán lá ký sinh ở mang (Pseudorhabdosynochus spp., Diplectanum spp.,…) kích thước nhỏ hơn 1mm; một số giống loài sán lá ký sinh ở da (như Benedenia spp., Neobenedenia spp.…) kích thước từ 2-6mm có thể nhìn thấy bằng mắt th ường. Tuy nhiên, có những loài kích thước rất lớn thuộc họ Capsalidae (Capsala martinieri 27 × 23 mm, Yamaguti 1963, p. 116; E. hippoglossi 24 × 11 mm, Yamaguti 1963, p. 126; N. sturionis 13–14 × 5–6 mm, Yamaguti 1963, p. 133) [45][34]. Các giống loài sán lá đơn chủ ký sinh trên cá nước ngọt hình dạng ít thay đổi, thường là hình phiến lá, hình sợi mảnh hay bầu dục [1]. Cơ thể sán lá đơn chủ . đề tài: Dựa vào đặc điểm hình thái và di truy ền để phân loại một số loài sán lá đơn ch ủ (Monogenea) thuộc họ Diplectanidae ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp. ) tại Khánh Hòa với các nội dung. tả đặc điểm hình thái các loài sán lá đơn chủ thuộc họ Diplectanidae ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp. ) tại Khánh Hòa. - Lập cây phát sinh lo ài, so sánh đặc điểm di truyền của các lo ài sán. hình thái và mức độ cảm nhiễm của cá c loài sán lá đơn ch ủ thuộc họ Diplectanidae (Monticelli, 190 3) Bychowsky, 1957 ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp. ) tại Khánh Hòa 46 1.2. Đặc điểm di truyền