i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều tập thể, cá nhân. Nên qua đây : Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha Trang, khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Bộ môn Bệnh học Thủy Sản đã quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi làm việc trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới Thầy ThS Trần Vĩ Hích đã dìu dắt tôi trên con đường nghiên cứu khoa học, trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài và viết luận văn. Xin cảm ơn Cô TS Nguyễn Thị Hà, Thầy ThS Lê Anh Tuấn đã cho tôi những lời khuyên quý báu để đề tài được hoàn thành. Xin cảm ơn Thầy ThS Lương Công Trung, ThS Bùi Thanh Tuấn đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu làm đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ về tinh thần và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành đợt thực tập tốt nghiệp này. Xin gửi lời cảm ơn, lời chúc sức khỏe và thành công chân thành nhất đến tất cả mọi người. Nha Trang, tháng 11 năm 2008 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Trang ii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục các bảng iv Danh mục các hình v Giải thích thuật ngữ và chữ viết tắt vii Phần 1: Mở đầu 1 Phần 2: Tổng quan 3 2.1 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh và gây bệnh trên cá và trứng cá nước ngọt 3 2.2 Một số đặc điểm sinh thái của cá nàng hai 7 2.3 Những bệnh nấm thường xảy ra trên trứng cá, cá nước ngọt và một số đặc điểm của nấm trên trứng và cá nước ngọt 8 2.3.1 Những bệnh do nấm thường xảy ra trên cá và trứng cá nước ngọt 8 2.3.2 Một số đặc điểm của nấm thường ký sinh và gây bệnh trên trứng cá và cá nước ngọt…… 10 2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, NaCl và một số hóa chất thường dùng trị nấm trên trứng cá và cá nước ngọt 11 2.4 Đặc điểm chung và tình hình nghiên cứu nấm Zygomycetes…… 14 2.4.1. Đặc điểm chung của nấm Zygomycetes 14 2.4.2 Tình hình nghiên cứu Zygomycetes 16 Phần 3: Phương pháp nghiên cứu 19 3.1 Thời gian, đối tượng và địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Sơ đồ khối nghiên cứu của đề tài 19 3.3 Thiết bị, hóa chất và môi trường nuôi cấy 20 3.3.1 Thiết bị 20 3.3.2 Hóa chất cần thiết 20 3.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm 20 iii 3.4 Phương pháp phân lập nấm ký sinh trên trứng cá nàng hai: 20 3.4.1 Phương pháp thu mẫu 20 3.4.2 Phương pháp phân lập nấm 21 3.4.3 Phương pháp định danh tên nấm 21 3.5 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của pH ……… 22 3.6 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn 23 3.7 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số hóa chất 23 3.8 Phương pháp xử lý số liệu 24 Phần 4: Kết quả và thảo luận 25 4.1 Kết quả phân lập nấm từ trứng cá nàng hai nhiễm nấm 25 4.2 Tác động của pH lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm 30 4.3 Tác động của nhiệt độ và NaCl lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm 31 4.3.1 Tác động của nhiệt độ 31 4.3.2 Tác động của NaCl 32 4.3.3 Tác động của nhiệt độ và độ mặn 34 4.4 Tác động của hóa chất lên sự phát triển của hệ sợi nấm 34 4.4.1 Tác động của Milian lên sự phát triển của hệ sợi nấm 34 4.4.2 Tác động của Nistatin 36 4.4.3 Tác động của Atorvastatin 37 4.4.4 Tác động của H 2 O 2 38 4.4.5Tác động của các hóa chất lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm 39 Phần 5: Kết luận và đề xuất ý kiến 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề xuất ý kiến 41 Tài liệu tham khảo 43 Phụ lục iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Khoảng nhiệt độ cho sự phát triển hệ sợi của Saprolegnia được phân lập từ cá và trứng cá 12 Bảng 2.2: Vùng pH cho sự phát triển hệ sợi của Saprolegnia được phân lập từ cá và trứng cá 13 Bảng 4.1: Đường kính khuẩn lạc nấm sau 48 h nuôi cấy ở các môi trường SDA có chỉ số pH khác nhau 30 Bảng 4.2: Đường kính khuẩn lạc của nấm nuôi cấy ở các mức nhiệt độ khác nhau sau 48 h 31 Bảng 4.3: Đường kính khuẩn lạc của nấm nuôi cấy ở các mức nồng độ NaCl khác nhau sau 48 h 33 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm sau 48h 34 v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Chu trình sống của nấm tiếp hợp Zygomycetes 16 Hình 3.1 Sơ đồ khối của đề tài 19 Hình 3.2 Mô hình phân lập và phân loại nấm từ trứng cá nhiễm nấm 22 Hình 4.1 Trứng cá nàng hai bị nhiễm nấm 25 Hình 4.2 Khuẩn lạc nấm trong môi trường SDA 27 Hình 4.3 Khuẩn ty nấm trong môi trường SDA (100X) 27 Hình 4.4 Cơ quan sinh sản hữu tính giai đoạn còn non (100X) 28 Hình 4.5 Cơ quan sinh sản hữu tính sau khi tiếp hợp (100X) 28 Hình 4.6 Cơ quan sinh sản hữu tính sau khi tiếp hợp và túi bào tử (100X) 28 Hình 4.7 Cuống túi bào tử và túi bào tử không có gai (100X) 28 Hình 4.8 Cuống túi bào tử và túi bào tử có gai (100X) 28 Hình 4.9Túi bào tử giải phóng bào tử nhỏ (100X) 29 Hình 4.10 Bào tử lớn có gai và bào tử nhỏ (100X) 29 Hình 4.11 Bào tử lớn không có gai và bào tử nhỏ (100X) 29 Hình 4.12 Bào tử mọc mầm (100X) 29 Hình 4.13 Đường kính khuẩn lạc nấm sau 48 h nuôi cấy ở các môi trường SDA có chỉ số pH khác nhau 30 Hình 4.14 Đường kính khuẩn lạc nấm nuôi cấy 48h ở các mức nhiệt độ 32 Hình 4.15 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi nuôi cấy 48h ở các nồng độ NaCl 33 Hình 4.16 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi nuôi cấy 48h ở các mức nhiệt độ và nồng độ NaCl khác nhau ………34 Hình 4.17 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ Milian và nuôi cấy sau 72 h 35 Hình 4.18 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ Milian và nuôi cấy được 72 h 35 Hình 4.19 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ Nistatin và nuôi cấy sau 72 h 36 vi Hình 4.20 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ Nistatin và nuôi cấy được 72 h 36 Hình 4.21 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ Atorvastatin và nuôi cấy sau 72 h 37 Hình 4.22 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ Atorvastatin, nuôi cấy được 72 h 37 Hình 4.23 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ H 2 O 2 và nuôi cấy sau 72 h 38 Hình 4.24 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ H 2 O 2 và nuôi cấy được 72 h 38 Hình 4.25 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các hóa chất ở các nồng độ cao nhất và nuôi cấy sau 72 h 40 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NTTS: nuôi trồng thủy sản ĐVTS: động vật thủy sản SDA: Sabouraud Dextrose Agar ppt: phần nghìn ppm: phần triệu SD: độ lệch chuẩn TB: trung bình 1 Phần 1: MỞ ĐẦU Trong thời gian qua, ngành thuỷ sản ngày càng phát triển và dần trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của nhiều quốc gia và là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng cho cộng đồng các dân cư trên toàn thế giới.Trong đó có Việt Nam-một nước có tiềm năng lớn về NTTS: bờ biển dài 3260km, diện tích mặt nước nội địa khoảng 1 triệu ha,vùng triều 0,7 ha và hệ thống đầm phá ven biển, cùng điều kiện thuận lợi của khí hậu nhiệt đới gió mùa. Tuy nhiên, ở Việt Nam, nghề NTTS chỉ mới tập trung vào một số đối tượng quen thuộc: tôm sú, cá tra, cá ba sa và các đối tượng truyền thống: cá chép, mè, trôi…dẫn đến hiệu quả kinh tế còn hạn chế, chưa khai thác hết tiềm năng hiện có. Để phát triển một cách toàn diện hơn chúng ta cần đa dạng hóa đối tượng nuôi, nâng cao hiệu quả sản xuất, đáp ứng nhu cấu thực phẩm ngày càng tăng của thị trường trong nước và xuất khẩu. Cá nàng hai (Chitala ornata Gray, 1831)-một loài thuộc họ cá thát lát (Notopteridae), là một đối tượng nuôi mới có nhiều ưu điểm hơn so với các loài cá khác trong họ cá thát lát: kích thước lớn, thịt thơm ngon, càng nuôi lâu càng có hiệu quả kinh tế, tỉ lệ thịt philê rất cao [4], [5], [6]. Từ năm 2004, phong trào nuôi cá nàng hai phát triển mạnh nhưng con giống không đáp ứng đủ nhu cầu của người nuôi. Nên việc đẩy mạnh phát triển sản xuất giống cá nàng hai là rất cần thiết. Nhưng trở ngại lớn nhất trong quá trình sản xuất các đối tượng thủy sản nói chung và sản xuất cá nàng hai nói riêng hiện nay là vấn đề dịch bệnh. Có thể nói bệnh là hiểm họa đối với nghề nuôi.Bệnh thường gặp là bệnh do vi khuẩn, nấm, virus, ký sinh trùng. Trong đó bệnh nấm được xem là một trong những bệnh nguy hiểm. Bệnh này có thể lây nhiễm rất nhanh, làm chết hàng loạt, thậm chí phải hủy bỏ toàn bộ đợt sản xuất nếu không phát hiện bệnh kịp thời. Mà bệnh này thường xảy ra ở hầu hết các trại sản xuất giống trong quá trình ấp trứng- là khâu đầu tiên, rất quan trọng trong quá trình sản xuất giống. Nên nó ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sản xuất. Do đó, việc phát hiện bệnh kịp thời, tìm ra tác nhân gây bệnh và phương 2 pháp tổng hợp để phòng bệnh là một vấn đề hết sức cần thiết nhằm góp phần ngăn ngừa những thiệt hại do dịch bệnh gây ra. Từ thực tế đó, đồng thời giúp sinh viên làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học, áp dụng lý thuyết đã học vào thực tế và hoàn thành đề tài tốt nghiệp, được sự đồng ý của Bộ môn Bệnh học Thủy sản, khoa Nuôi trồng Thủy sản, trường Đại học Nha Trang, tôi thực hiện đề tài : “Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl và một số hóa chất lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai (Chilata onata Gray, 1813) tại Ninh Phụng trong điều kiện thí nghiệm”. Với các nội dung như sau: 1. Phân lập nấm ký sinh trên trứng cá nàng hai. 2. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai. 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và NaCl lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai. 4. Ảnh hưởng của một số hóa chất lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai. Tôi hy vọng kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đóng góp thêm những nghiên cứu cơ bản về nấm ký sinh và gây bệnh trên trứng cá nước ngọt và là cơ sở khoa học cho người sản xuất đưa ra những biện pháp phòng trị bệnh nấm, góp phần nâng cao tỉ lệ trứng nở trong quá trình sản xuất giống cá nàng hai. Do còn thiếu kinh nghiệm, đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian ngắn, nên khó tránh khỏi những thiếu sót, kính mong được sự chỉ dạy, góp ý của quý thầy cô và các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 11 năm 2008 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trang 3 Phần 2: TỔNG QUAN 2.1 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh và gây bệnh trên cá và trứng cá nước ngọt Trong các tác nhân gây nhiễm bệnh cho ĐVTS thì tác nhân do nấm là rất quan trọng, có thể gây ra cũng gây ra những hậu quả nặng nề, chúng làm giảm đáng kể tỉ lệ trứng nở, cá bột và cá trưởng thành.Trong một số trường hợp sự nhiễm nấm trên trứng trong một bể ấp nếu nghiêm trọng có thể phải hủy hoàn toàn bể ấp.Trong trường hợp hình thành dịch bệnh, chúng có thể ảnh hưởng đến kinh tế của vùng [9]. Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về nấm ký sinh và gây bệnh trên trứng và cá nước ngọt. Theo Chukanhom K.& Hatai K.(2003) bệnh do nấm thường xuyên xảy ra ở giai đoạn trứng trên nhiều loài cá khác nhau. Tỉ lệ trứng hỏng trong quá trình ấp do sự nhiễm nấm đôi khi đạt đến 80%-100% tổng số trứng ấp [12], [14]. Các công trình nghiên cứu về nấm chủ yếu được thực hiện theo ba hướng chính là: xác định tác nhân gây bệnh, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái (pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl) lên sự phát triển của nấm và thử nghiệm nhằm tìm ra những hóa chất có hiệu quả phòng trị bệnh nấm trên trứng cá và cá. Có rất nhiều công trình nghiên cứu về các loài nấm gây bệnh trên nhiều loài cá khác nhau. Tuy nhiên sự hiện diện và gây bệnh của những loài nấm rất khác biệt theo từng vùng địa lý khác nhau, có những loài ký sinh hay gây bệnh trên loài cá này nhưng vô hại đối với loài cá khác [9], [14]. Nấm ký sinh trên cá xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới, tùy vào từng vị trí địa lý mà thành phần loài có sự khác nhau. Ví dụ như đối với giống Saprolegnia: ở Châu Âu đặc biệt là nước Anh, nó chiếm ưu thế trong nước ngọt nhưng ở Châu Phi thì không có sự hiện diện của loài này. Trong nghiên cứu về họ Saprolegniaceae tại những hồ và suối ở Nigeria và Alabi chỉ thấy xuất hiện Achlya, Aphanomyces, Brevilegnia, Dictyuchus, Pythiosis,Thraustotheca và Geolegnia [9]. Nhiều nghiên cứu về nấm gây bệnh trên cá cho kết quả là do các loài nấm thuộc họ Saprolegniaceae, ví dụ như kết quả phân lập được giống nấm Achlya và Saprolegnia (Scott và Narren, 1964), Achlya và Dictyuchus từ vết thương của [...]... phát tri n vi c sinh s n nhân t o cá nàng hai nhưng vi c nghiên c u còn nhi u h n ch , h u h t m i ch d ng l i ho t vi c mô t các ng sinh s n c a cá trong t nhiên hay b trí t o i u ki n cho cá Thái Lan và Vi t Nam là hai nư c i t nhiên u trong công tác nghiên c u sinh s n nhân t o cá nàng hai (Lê Quý Cư ng, 2006) [5], [6] 2.3 Nh ng b nh n m thư ng x y ra trên tr ng cá, cá nư c ng t và m t s c i m c... tính trong túi noãn, s lư ng hùng khí, cách th c ti p h p mà phân lo i ra loài trong cùng m t gi ng [9], [18] 2.3.3 nh hư ng c a nhi t m ts , pH, NaCl lên s phát tri n c a h s i n m và hóa ch t thư ng dùng tr n m trên tr ng cá và cá nư c ng t Gi ng như nh ng vi sinh v t khác trong h sinh thái, n m cũng ch u nh hư ng r t l n b i y u t nhi t tri n Ngoài ra, nh ng , pH, n ng NaCl trong quá trình sinh. .. • N ng NaCl: N ng Duff, 1929 NaCl nh hư ng r t l n phát tri n c a n m D a trên n ng n s s ng, sinh trư ng NaCl trong môi trư ng s ng c a n m mà phân thành 3 nhóm: n m s ng trong nư c m n, trong nư c ng t và trong nư c l v i t ng gi ng loài n m thì ngư ng n ng ngư ng n ng NaCl thích h p khác nhau D a trên NaCl ó c a t ng loài n m ( c bi t i v i n m ký sinh và gây b nh trên cá và tr ng cá) mà NaCl ư... kh o sát vòng i c a Achlya sp nhi m trên tr ng cá tra và cá ba sa; trong h i th o Qu c t Công ngh sinh h c Nông nghi p, ã báo cáo k t qu th nghi m sàng l c m t s lo i hóa dư c có kh năng c ch Achlya sp nhi m trên tr ng cá tra, ba sa [9] 2.2 M t s Mai c i m sinh thái c a cá nàng hai ình Yên & ctv (1979) ã phân lo i cá nàng hai Chitala ornata (Gray, 1831) và mô t Ngành: c i m như sau: Vertebrata L p:... c ph bi n trong môi trư ng nư c c d ng ký sinh và ho i sinh trên cá, và gây b nh n m th y my trên tr ng cá c bi t là các gi ng Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces, Leptolegnia thư ng xuyên g p trên tr ng và cá nư c ng t [13] Các gi ng này ư c phân lo i d a theo hình thái: có th d a vào hình th c sinh s n vô tính sinh s n h u tính − phân lo i phân bi t n gi ng và d a trên hình th c n loài [9], [18] i v... [6] 8 Qua nghiên c u c a Nguy n Chung (2006), ây là loài cá d và môi trư ng thích h p cho cá nàng hai sinh trư ng và phát tri n là: 8,5, nhi t m n dư i 6 ‰, pH 5,5 ÷ nư c 20 ÷ 30oC, Oxy t 3 ÷ 8 mg/L Môi trư ng thích h p cho cá nàng hai sinh trư ng và phát d c là: nhi t Cá có t p tính làm t 20 ÷ 30oC, pH 5,5 ÷ 7,5, Oxy ≥ 3 mg/L… tr ng dính Tr ng cá có kích thư c khá l n, ư ng kính tr ng giai o n IV có... m trên tr ng và cá nư c ng t 2.3.1 Nh ng b nh do n m x y ra trên cá và tr ng cá nư c ng t Trên cá và tr ng cá nư c ng t, thư ng x y ra các b nh: b nh n m h t Dermocystidiosis, B nh n m mang Branchiomycosis, h i ch ng l loét (EUS) và n m th y mi [2], [32], [33] • B nh n m h t Dermocystidiosis: do Dermocystidium spp, thư ng ký sinh trên vây, dư i da và mang cá chép, cá tr m, cá lóc [2], và tìm th y nh... Branchiomyces, trong ó ch y u là do hai loài B sanguinis và B demigrans Các bào t n m bám vào mang phát tri n thành các s i n m, sau ó s i n m xuyên sâu vào các t ch c c a mang và phân nhánh lu n vào các mao huy t qu n, làm m t tác d ng hô h p c a mang 9 Khi cá b nh n ng, các khu n ti và bào t n m theo m ch máu di chuy n m t s b ph n khác [2], [32], [34] Tuy v y, b nh ch bi t phát tri n trong mang [32]... m cao: cá lóc, cá trôi, cá trê, cá • B nh n m th y my: i, cá di c…[2], [3] ây là b nh gây nhi u thi t h i nghiêm tr ng trên nhi u loài cá nư c ng t, nh t là giai o n p tr ng [10] Gây b nh là m t s loài thu c các gi ng: Saprolegnia, Leptolegnia và Achlya; h Saprolegniaceae; b Saprolegniales ó là h ph bi n trong môi trư ng nư c c d ng ký sinh và ho i sinh trên cá và ng v t giáp xác [10], [13] .Cá b b... chúng ư c em i thí nghi m [9] Thí nghi m c m nhi m n m Achlya và Saprolegnia trên cá Lebistes reticlatus và Xiphophorus helleri b r ch v t thương trư c c a Norland và Tintigner (1973) cho 75% cá b nhi m n m trong lô cá thí nghi m Thí nghi m c a Nish (1976, 1997) c m nhi m n m Saprolegniaceae lên cá h i và kh ng nh v t thương không ph i là i u ki n ch y u cho s lây nhi m n m mà do m t vài nhân t khác . Phân lập nấm ký sinh trên trứng cá nàng hai. 2. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai. 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và NaCl lên sự sinh trưởng của hệ. của pH, nhiệt độ, NaCl và một số hóa chất lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai (Chilata onata Gray, 1813) tại Ninh Phụng trong điều kiện thí nghiệm . Với các nội dung. trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai. 4. Ảnh hưởng của một số hóa chất lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai. Tôi hy vọng kết quả nghiên cứu của đề tài