1 LỜI CẢM ƠN Bản khoá luận này được thực hiện tại phòng thí nghiệm các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hoá Hữu Cơ, khoa Hoá, trường ĐHQGHN. Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Đậu đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Hoá học, các thầy các cô trong bộ môn Hoá hữu cơ, khoa Hoá trường ĐHKHTN-ĐHQGHN, các thầy các cô trong bộ môn Hoá sinh thực nghiệm Viện KHTN và CNQG, và các phòng máy khối phổ, phòng cộng hưởng từ hạt nhân, phòng phổ hấp thụ nguyên tử thuộc Viện hoá học-Trung tâm khoa hoá tự nhiên và công nghệ Quốc gia, cùng toàn thể anh chị nghiên cứu sinh, học viên cao học trong phòng hợp chất thiên nhiên và các bạn cùng khoá đã giúp đỡ em trong quá trình làm việc tại khoa. Hà Nội, tháng 12 năm 2006 Đỗ Thị Thanh 2 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 PHẦN I. TỔNG QUAN 2 1.1 Khái quát về họ Sim Myrtaceae 2 1.2 Tổng quan về chi Cleistocalyx 2 1.2.1 Cleistocalyx circumcissa 3 1.2.2 Cleistocalyx nigrans 3 1.2.3 Cleistocalyx nervosum 3 1.2.4 Cleistocalyx rehnervinus 4 1.2.5 Cleistocalyx consperipuactatus 4 1.3 Tổng quan về cây vối (Cleistocalyx operculatus Roxb) 5 1.3.1 Đặc điểm thực vật 5 1.3.2 Phân bố 5 1.3.3 Ứng dụng của cây vối 5 1.3.4 Thành phần hoá học 7 1.3.4.1 Thành phần hoá học của tinh dầu nụ hoa vối 7 1.3.4.2 Thành phần hoá học của nụ hoa vối 10 1.4 Một số tritecpen có hoạt tính sinh học liên quan đến đối tượng nghiên cứu 12 1.4.1 Các tritecpen khung oleanan 12 1.4.2 Các hợp chất khác 15 1.5 Một số tính chất flavonoid liên quan đến đối tượng nghiên cứu của đề tài 16 1.5.1 Sự phân bố flavonoid trong thực vật 16 1.5.2 Tính chất định tính của flavonoid 17 1.5.3 Tác dụng sinh học của flavonoid 20 3 PHN II. MC TIấU V PHNG PHP NGHIấN CU 25 2.1 Mc tiờu 25 2.2 Phng phỏp nghiờn cu 25 PHN III. CC KT QU V THO LUN 26 3.1 Nguyờn liu thc vt 26 3.2 Chit cỏc hot cht sinh hc trong l vi 27 3.3 Th nh tớnh cỏc flavonoit trong cỏc cn 28 3.4 Phõn lp cỏc cht trong cn C 28 3.4.1 Sc ký lp mng kho sỏt cn C 28 3.4.2 Phõn lp cỏc cht tinh khit trong cn C 29 3.5 Phân tích thành phần của cặn chiết etylaxetat (cặn E) 31 3.6 Khảo sát cấu trúc của các chất phân lập 31 3.6.1 Cấu trúc chất C 5 . 31 3.6.2 Cấu trúc chất C 6 . 33 3.6.3 Cấu trúc chất C 7 . 35 PHN IV. THC NGHIM 37 4.1 Mu nguyờn liu 37 4.2 Dng c v hoỏ cht 37 4.3 Thit b nghiờn cu 38 4.4 Nghiờn cu cỏc cht trong lỏ vi 38 4.4.1 Chit phõn lp cỏc cht trong lỏ vi 38 4.4.2 Phn ng nh tớnh flavonoit 39 4.4.3 Sc ký lp mng kho sỏt cn cloroform 40 4.4.3.1 Phng phỏp sc ký lp mng (SKLM) 40 4.4.3.2 Kt qu kho sỏt SKLM cn C 41 4.4.4 Phõn lp cỏc cht trong cn C bng sc ký lng trung ỏp 41 4 4.4.5 Phân lập các chất từ nhóm C 5 bằng sắc ký cột nhanh 43 4.4.6 Phân lập các chất từ nhóm C 6 bằng sắc ký cột nhanh 44 4.4.7 Phân lập các chất từ nhóm C 7 bằng sắc ký cột nhanh 46 PHẦN V. KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Việt Nam có khí hậu nhiệt đới ẩm nên hệ thực vật rất phong phú với hơn 12000 loài cây chia làm 2500 chi và 300 họ. Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá, cung cấp nguồn nguyên liệu cho ngành hương liệu, mỹ phẩm và hoá dược. Các nhà nghiên cứu đã tổng hợp được rất nhiều hợp chất có tác dụng chữa bệnh, song các hợp chất này có một số hạn chế nhất định, như là gây những phản ứng phụ không mong muốn. Mặt khác, Việt Nam là nước đang phát triển, thu nhập bình quân đầu người thấp, các loại thuốc chữa bệnh hầu hết nhập từ nước ngoài và có giá thành cao, gây nên khó khăn cho người sử dụng. Do đó, nhà nước đã có chủ trương tăng cường sản xuất thuốc trong nước, hạn chế nhập khẩu, hạ giá thành sản phẩm. Một trong các nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc được lấy ra từ thiên nhiên. Vì vậy vấn đề đang được đặc biệt quan tâm là nghiên cứu các hợp chất được tách ra từ sản phẩm thiên nhiên. Trong số các loài cây cần quan tâm nghiên cứu có cây vối (Cleistocslyx Operculatus Roxb). Ở nước ta cây vối mọc nhiều nơi, tập trung nhiều ở miền Trung , được nhân dân dùng nấu nước uống, kích thích tiêu hoá. Lá vối và nụ vối làm thuốc chữa mụn nhọn, lở loét, ghẻ. Mới đây viện Đông y cũng thử áp 5 dụng vối làm thuốc chữa các bệnh đường ruột, viêm họng, bệnh ngoài da. Từ năm 1991 trở lại đây, một số công trình trong nước và trên thế giới nghiên cứu cây vối cho thấy hàm lượng flavonoit chứa trong cây cao và một số chất có hoạt tính kháng HIV. Đặc biệt một nghiên cứu gần đây nhất cho thấy nước chiết của nụ Vối là thành phần của thuốc trợ tim. Như vậy, cùng với sự thuận lợi về nguyên liệu thì đây là những lý do khích lệ chúng tôi nghiên cứu cây vối Việt Nam. 6 PHẦN I. TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về họ Sim Myrtaceae Cây vối có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus Roxb, thuộc chi Cleistocalyx, họ Sim Mytaceae. Các cây thuộc họ Sim thường mọc xen lẫn với các cây gỗ khác thành đai rừng nhiệt đới, ít khi mọc thuần loại. Họ Sim phân bố ở các vùng rừng nhiệt đới và Á nhiệt đới, chủ yếu ở châu Mỹ và châu Úc. Họ Sim là một họ lớn gồm 90 chi và 3000 loài, cây thuộc họ Sim có đặc điểm thực vật như sau : Cây gỗ lớn, cây nhỡ hoặc cây bụi. Lá đơn, hoặc mép có khía răng, lá thường mọc đối nhau và có tuyến mỡ. Hoa mọc thành cụm ở nách hay ở đầu cành, có hình xim hoặc hình chùm. Hoa đều lưỡng tính. Đài hình ống dính hoàn toàn vào bầu hay chỉ dính một ít. Lá đài gồm 4-5 cánh xếp lợp vào nhau, ít có ống dài nguyên. Nhị xếp thành một hay nhiều dãy rời nhau hoàn toàn hoặc dính ở gốc thành ống ngăn : bao phấn đính ở lưng hay gốc. Đĩa mật không có hay nếu có thì hình vành khăn, che kín ở phía gốc vòi. Bầu hoàn toàn hạ hay hạ một phần, có 4-5 ô hay nhiều hơn; vòi đơn kéo dài, đầu tròn, rất ít khi chia 3-4 thuỳ; trong bầu thì noãn xếp thành hai hay nhiều dãy. Quả nang hoặc thịt, có sợi và thường được bọc kín bởi ống đài. Trong quả thường có 1 hạt, hạt có nội nhũ, phôi thẳng hay cong, đôi khi nạc với hai lá mầm không xa nhau. 1.2 Tổng quan về chi Cleistocalyx [6,9] Chi Cleistocalyx là một chi tương đối lớn của họ Sim. Ngoài đặc điểm chung của họ sim, các loài cây thuộc chi Cleistocalyx còn có đặc điểm thực 7 vật riêng : quả nạc, khi chín không nở. Vòi không có lông, ô quả không có vách ngang chia thành ô nhỏ, ống đài nguyên hay rách bất định, đài nguyên thành mũ, quả mập có một hạt. Cụm hoa xim hay chuỳ. Sau đây là giới thiệu một số cây đại diện thuộc chi Cleistocalyx thường thấy ở Việt Nam. 1.2.1 Cleistocalyx circumcissa Tên ở Việt Nam là Trâm Ô. Đặc điểm thực vật : Cây đại mộc cao 15m, nhánh mảnh, lá có phiến xoan thon, dài 4-7cm, chót có mũ, có đốm trong gân phụ, rất mảnh, nụ cao 13mm, rộng 3mm, phần của đài và cánh hoa làm thành một lớp rụng sớm với nhị, noãn gồm 3 buồng, quả mập. Phân bố : rừng Biên Hoà. 1.2.2 Cleistocalyx nigrans Tên Việt Nam : Trâm lá đen. Đặc điểm thực vật : Cây đại mộc nhỏ, nhánh vàng đỏ. Lá có phiến bầu dục, màu nâu đen trên mặt lúc khô, gân phụ cách nhau 2-3mm, cuống dài 1cm. Chùm tụ tán cao 6cm ở ngọn nhánh, hoa trắng, nụ dài 5mm, hoa 5 cánh rụng 1 lượt, tiểu nhị nhiều. Quả mập tròn, lúc khô đen, to hơn 1cm, một hạt. Phân bố : rừng Bình Dương, Thủ Đức. 1.2.3 Cleistocalys nervosum Tên Việt Nam : Trâm nấp vối. Đặc điểm thực vật : Cây đại mộc trung, nhánh non dẹp, không lông. Lá có phiến bầu dục thon, dài 12-13cm, có đốm nâu, gân phụ vào 10 cặp, gân cách bìa 3-5mm. Phát hoa ở nách lá rụng, cao 5-8cm, đài hình đĩa hơi đứng, 8 nắp cao; hoa có 4 cánh, cao 3mm, có nhiều tiểu nhụy. Phì quả tròn hay dài, to 7-14mm, đỏ hoặc đỏ đen chói, nạc ngọt, một hạt. Phân bố : rừng và Bắc Trung Nam. 1.2.4 Cleistocalyx rehnervinus Tên Việt Nam : Vối gân mạng Đặc điểm thực vật : Cây đại mộc nhỏ, nhánh tròn xám, to 2-3mm. Lá có phiến bầu dục đến trái xoan, to 9-14x5.5-7cm chót lá rộng, đáy tròn gân phụ mịn, cách nhau 4-8mm, gân cách bìa 2-3mm. Phát hoa ở lá và ngọn. Hoa như không cọng, cao 7mm, đài rụng thành chóp, tiểu nhụy nhiều. Trái tròn, to 1.5mm, lùm bụi. 1.2.5 Cleistocalyx consperipuactatus Tên Việt Nam : Vối nước Đặc điểm thực vật : Cây gỗ thường xanh, cao 20-25m. Vỏ dày 6-8mm, màu xám trắng hay nâu đen nhạt. Cành non màu nâu xám, hình vuông, lúc già hình cột tròn. Lá đơn, mọc đối, hình bầu dục dạng trứng ngược dài 6-12cm, rộng 2.5-5.5cm, đầu tròn tù. Hoa mọc cụm, sinh ra đầu cành. Hoa lưỡng tính, đài đính thành 1 thể dạng mũ, lúc nở hoa rụng dạng vòng. Nhiều nhị, rời nhau, lúc chồi hoa cong vào. Quả mọng hình cầu hay hình trứng, lúc chín có màu nâu tím. Một năm có 2 mùa hoa nở vào tháng 3 và giữa tháng 7. Phân bố : Thanh Hoá, Nghệ Tĩnh, Bình Trị Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng, GiaLai-KonTum. 9 1.3 Tổng quan về cây Vối (Cleistocalyx operculatus) 1.3.1 Đặc điểm thực vật Cây nhỡ, cao 5-6m có khi hơn, cành non, tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn. Lá có cuống, dài 8-20cm, hình trứng, rộng 5-10cm. Hai mặt lá có những đốm màu nâu, cuống dài 1-1.5cm. Hoa gần như không có cuống, màu lục trắng nhạt hợp thành cụm hoa hình tháp toả ra ở những lá đã rụng. Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đường kính 7-12cm, xù xì. Toàn lá, cành non, và nụ vối có mùi thơm đặc biệt dễ chịu của vối. [3,5] 1.3.2 Phân bố Cây vối được trồng và mọc hoang ở khắp các tỉnh nước ta, chủ yếu để lấy lá ủ nấu nước uống. Vối còn thấy ở các nước nhiệt đới châu Á, Trung Quốc. [3,4] 1.3.3 Ứng dụng của cây vối Vối được trồng để lấy gỗ dùng trong xây dựng, làm công cụ, vỏ có chất dùng để nhuộm đen. Quả vối ăn được. Lá vối tươi đem thái nhỏ, rửa sạch nhựa rồi cho vào thùng ủ cho đến khi đen đều thì lấy ra rửa sạch, phơi khô dùng để nấu làm nước uống rất thông dụng ở nông thôn Việt Nam. Nụ và hoa thu hái vào vào tháng tư hoặc tháng sáu dương lịch cũng được pha làm trà uống. Kinh nghiệm dân gian thường phối hợp lá vối với lá Hoắc hương làm nước uống lợi tiêu hóa. Nước sắc đậm đặc của lá cây dùng như thuốc sát trùng, để rửa mụn nhọt, lở loét, ghẻ. Lá, vỏ thân, hoa còn dùng làm thuốc chữa bệnh đầy bụng, khó tiêu, mụn nhọt, viêm đại tràng mãn tính, ly trực trùng. [3,4,5] 10 Năm 2003, Đào Thị Thanh Hiền, trường ĐH Dược Hà Nội và những người khác đã tiến hành thử nghiệm nghiên cứu một số tác dụng của cây vối. Kết quả cho thấy : - Tính kháng khuẩn của lá vối, đặc biệt là lá vối ủ có tác dụng rất tốt trên vi khuẩn E.coli, là loại vi khuẩn thường gây ra bệnh đường ruột, và hai vi khuẩn Gr(+) và Gr(-) thường gặp ở bệnh viêm da. Điều này làm sáng tỏ việc uống nước sắc lá vối để chữa bệnh tiêu chảy và tắm nước sắc lá vối để chữa bệnh viêm da của nhân dân. - Nước sắc lá vối ủ có tác dụng lợi mật rất mạnh, kết quả này góp phần giải thích được vì sao nhân dân ta thường uống nước sắc lá vối để chữa bệnh đầy bụng, khó tiêu. - Kết quả thử tác dụng độc tế bào của mẫu chiết từ lá vối bước đầu cho thấy cả tinh dầu và cao thô toàn phần đều có khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư (ung thư gan, ung thư màng tim, ung thư tử cung). Điều này mở ra hướng nghiêm cứu mới đối với dược liệu lá vối. Năm 1986, Nguyễn Đức Minh, phòng đông y thực nghiệm Viện nghiên cứu đông y đã tiến hành nghiên cứu thăm dò tính chất kháng sinh của lá và nụ cây vối đối với một số vi khuẩn Gram(+) và Gr(-) đã đi tới kết luận rằng: ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây, lá và nụ vối đều có tác dụng kháng sinh, vào mùa đông, tính kháng sinh cao nhất ở lá và hoàn toàn không độc đối với cơ thể [7]. Đặc biệt năm 2002, một nhóm nhà khoa học Trung Quốc đã công bố kết quả ngiên cứu về cây vối: nước chiết của nụ vối là thành phần của nước uống bổ dưỡng trợ tim, làm giảm khả năng nhiễm bệnh. [18] [...]... phổ 13C-NMR và khảo sát phổ HMQC và HMBC cấu trúc của chất C5 đã được xác định là 2,4-đihidroxi-6-metoxi-3,5dimetylchalcon Chất này đã được nhóm nghiên cứu của PGS Nguyễn Văn Đậu tách từ cây vối Nam Định [Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học của lá cây vối - Nguyễn Văn Thuấn, Khóa luận tốt nghiệp, trường ĐHKHTN, ĐHQG HN, 2005] ch3 3 HO oh 4 2 , , 3 , , 1 4 1 5 h3c 2 6 c , 6, 5 oCH 3 o 2,4-dihidroxi-6-metoxi-3,5-dimetyl... Phần 3 Kết quả và thảo luận 3.1 Xử lý mẫu và chiết Xử lí mẫu Lá vối (Cleistocalyx operculatus Roxb) được thu hái ở Vĩnh phúc, vào tháng 8 năm 2005 Lá không bị sâu được rửa sạch, rồi phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở nhiệt độ khoảng 45-500C cho đến khô giòn Nghiền nhỏ lá thành bột mịn để làm nguyên liệu chiết Các lớp chất có mặt trong lá vối mà chúng tôi quan tâm là các flavonoit và các axit tritecpen-cacboxylic... chính tách ra từ cây Cam thảo nhãn (Glycyrrhiza glabra) lại ức chế sự phát triển của một số loài virus bao gồm cả virus HIV-1 in vitro Các kết quả nghiên cứu trên bệnh nhân AIDS ở Nhật cho thấy Glycyrhizin làm chậm quá trình phát triển của virus HIV Rất có thể nó đã kìm hãm quá trình sao chép của virus HIV in vitro HOOC O O COOH O O OH O OH OH COOH OH OH Glycyrrhizin Theo những nghiên cứu mới nhất thì... flavonoit Cũn cn C v E thỡ cú flavonoit Cỏc axit hu c, c bit l cỏc axit cú phõn t lng ln hay mch cỏc bon di thng cho kt ta vi chỡ axetat p dng phn ng ny chỳng tụi nhn thy cn C cú cỏc axit tritecpenoit 3.4 Nghiên cứu thành phần của cặn chiết clorofom (cặn C) 3.4.1 Phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (TLC) Cặn chiết clorofom được khảo sát bằng TLC để định hướng cho việc phân tách các thành phần của nó Sự phân tích... 8 7 22 17 18 16 15 o c 28 oh 27 6 h 24 (6) (7) h h h cooh 8 7 ho (8) (9) 15 1.4 Mt s tritecpenoit cú hot tớnh sinh hc liờn quan n i tng nghiờn cu 1.4.1 Các tritecpen khung oleanan Theo các kết quả nghiên cứu của Woldemichael G.M [28], axit oleanolic có hoạt tính kháng 2 chủng vi khuẩn B Subtilis (MIC=8 g/ml) và S.aureus (MIC=64 g/ml) Trong khi đó, hoạt tính chống ung thư của nó lại dựa trên sự ngăn... có mặt trong lá vối mà chúng tôi quan tâm là các flavonoit và các axit tritecpen-cacboxylic Do vậy, một qui trình xử lí mẫu đã được xây dựng để chiết định hướng hai lớp chất này Qui trình chiết Bột lá vối (1,2kg) được ngâm chiết với etanol 950 ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1-2 ngày Sau đó lọc lấy dịch chiết etanol, bã lại cho vào bình ngâm tiếp với etanol Quá trình được lặp lại như vậy 3 lần Các... này với nước cất, và chiết với ete dầu hoả (30-600C) để loại sắc tố, các axit béo, Tiếp theo, chiết dịch etanol-nước lần lượt với cloroform và etylaxetat Hiệu suất thu 3 cặn chiết này so với lượng mẫu cây khô ban đầu như sau: cặn ete dầu hỏa (kí hiệu cặn A) 50,8g, (hiệu suất 8,26%); cặn CHCl3 (cặn C) 86,8g (hiệu suất 14,26%) và cặn chiết EtOAc (cặn E) 7,4g (hiệu suất 1,24%) Quy trình chiết được chỉ... Lm khụ, loi ete du ho Cn A : 50,8g Hiu sut : 8,26% Cn C : 86,8g Hiu sut : 14,26% Chit bng EtOAc Dch EtOAc Lm khụ, loi EtOAc Cn E : 7,4g Hiu sut : 1,24% Hình 3.1 Quy trình điều chế các cặn chiết từ lá vối 3.2 Khảo sát hoạt tính sinh học của các phần chiết Do sự quan tâm của chúng tôi tập trung vào hai cặn chiết clorofom và etylaxetat nên sự khảo sát hoạt tính sinh học như kháng khuẩn và kháng ôxi hóa... OH R2 = OH COOH R1 = H R2 = O O R1O R2 = H CH2OR2 18 R1 = OH 1.4.2 Các hợp chất khác Các dẫn xuất tritecpen khung ursan: axit 2,19-đihiđroxy-3-oxo-12ursen-28-oic, axit ursolic, axit maslinic tách ra tư cây Geum japonicum đều thể hiện hoạt tính ức chế enzym proteaza của virus HIV-1 khá tốt Giá trị nồng độ ức chế 50% tế bào HIV của axit ursolic là 18,6 g/ml HO COOH HO O 2,19-Dihiđroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic... môi etylaxetat/ n-hexan : 7/3 (v/v) Kết quả cho thấy phần chiết này gồm nhiều vệt có Rf khá gần nhau, trong đó các vệt chất được phát hiện qua sự hiện màu xanh sẫm với thuốc thử FeCl3 5% Do bị hạn chế về thời gian, các thành phần của cặn C chưa được phân tách tinh khiết 3.6 Khảo sát cấu trúc của các chất phân lập 3.6.1 Cấu trúc chất C5 Dựa vào phản ứng định tính cũng như đặc điểm mang màu vàng của chất . quan tâm là nghiên cứu các hợp chất được tách ra từ sản phẩm thiên nhiên. Trong số các loài cây cần quan tâm nghiên cứu có cây vối (Cleistocslyx Operculatus Roxb). Ở nước ta cây vối mọc nhiều. lợi về nguyên liệu thì đây là những lý do khích lệ chúng tôi nghiên cứu cây vối Việt Nam. 6 PHẦN I. TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về họ Sim Myrtaceae Cây vối có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus. thế giới nghiên cứu cây vối cho thấy hàm lượng flavonoit chứa trong cây cao và một số chất có hoạt tính kháng HIV. Đặc biệt một nghiên cứu gần đây nhất cho thấy nước chiết của nụ Vối là thành