Đang tải... (xem toàn văn)
Enzyme glucose oxidase (GOD: βDglucose:oxygen 1oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là enzyme xúc tác quá trình oxi hóa của βDglucose thành axit gluconic với sự tham gia của phân tử oxi như chất nhận điện tử, đồng thời giải phóng ra hydroperoxide (H2O2). GOD được biết đến từ những năm 1950, ngày nay được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và các lĩnh vực khác như: y dược, hóa học lâm sàng, công nghệ sinh học, trong công nghiệp dệt… 10.
Đồ án tốt nghiệp 1 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật LỜI MỞ ĐẦU Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực kinh tế. Enzyme đã dần từng bước làm thay đổi và nâng cao một số các quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của xã hội. Enzyme glucose oxidase (GOD: β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là enzyme xúc tác quá trình oxi hóa của β-D-glucose thành axit gluconic với sự tham gia của phân tử oxi như chất nhận điện tử, đồng thời giải phóng ra hydroperoxide (H 2 O 2 ). GOD được biết đến từ những năm 1950, ngày nay được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và các lĩnh vực khác như: y dược, hóa học lâm sàng, công nghệ sinh học, trong công nghiệp dệt… [10]. Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm mục đích thu nhận và ứng dụng GOD vào thực tế sản xuất nhưng ở nước ta thì việc nghiên cứu này còn rất hạn chế và chưa thể sản xuất được chế phẩm GOD. Và đây đang là vấn đề thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước, nắm bắt tình hình đó tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger”. Mục đích của đề tài: - Xác định đơn biến ảnh hưởng của nồng độ các nguồn dinh dưỡng carbon, nitơ và muối canxi cacbonat trong môi trường nuôi cấy, để khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergillus niger là cao nhất. - Xác định nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 và pH của môi trường nghiên cứu để hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme GOD ngoại bào thô là tốt nhất. - Thu nhận chế phẩm enzyme ngoại bào thô. Nội dung nghiên cứu của đề tài: SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger” Đồ án tốt nghiệp 2 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật - Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của saccharose, peptone và CaCO 3 đến quá trình sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergilus Niger. - Sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ để đánh giá hoạt lực của enzyme GOD ngoại bào. - Khảo sát nồng độ bão hòa của muối (NH 4 ) 2 SO 4 và sự ảnh hưởng của pH của MTNC đến khả năng kết tủa enzyme GOD ngoại bào. - Thu nhận và xác định hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme thô. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: - Đóng góp dẫn liệu nghiên cứu điều tra sự ảnh hưởng của một số nguồn dinh dinh dưỡng, tạo tiền đề cho quá trình tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho quá trình sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergillus niger, - Kiểm định và khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại từ nấm mốc Aspergillus niger, - Lựa chọn được điều kiện thích hợp cho khả năng kết tủa enzyme GOD ngoại bào. Tạo tiền đề bước đầu xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme GOD tinh khiết. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger” Đồ án tốt nghiệp 3 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật Giới thiệu chung về nấm mốc Nấm mốc là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, có hay không có cellulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất [23] . Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm mốc [23] Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng, đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3÷5 µm, có khi đến 10 µm, thậm chí đến 1 mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm khí sinh xù xì như bông. Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm. Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào vi sinh vật chân hạch khác. Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có cellulose. Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm Oomycetina. Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzyme chitinsyntase. Tế SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger” Hình 1.1. Sợi nấm và cấu tạo vách tế bào sợi nấm (theo Samson v ctv., 1995) Đồ án tốt nghiệp 4 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật bào chất của tế bào nấm mốc chứa mạng nội mạc, không bào, ty thể và hạt dự trữ, đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật. Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribose thể và những thể khác chưa rõ chức năng. Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng mà Matsueda và cộng sự (1978) đầu tiên trích ly được và gọi là neocercosporin (C 29 H 26 O 10 ) có màu tím đỏ ở nấm Cercosporina kikuchi. Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân. Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipid và protein, bên trong màng nhân chứa ARN và ADN. 1.1.2. Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950). Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2 0 C đến 5 0 C, tối thích là 22 0 C÷27 0 C và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35 0 C÷ 40 0 C, cá biệt có một số ít loài có thể sống sót ở 0 0 C và ở 60 0 C. Nói chung, nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường axit (pH = 6) nhưng pH tối thích là 5÷6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967). Oxi cũng cần cho sự phát triển của nấm mốc vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi và tất nhiên nước là yếu tố cần thiết cho sự phát triển. Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất định. Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucose, muối ammonium sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzym SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger” Đồ án tốt nghiệp 5 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào. 1.1.3. Sinh sản của nấm mốc Nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức chính: vô tính và hữu tính. Trong sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái. Sinh sản vô tính: The Alexopoulos và Mims (1979), nấm mốc sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử. Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái có trải qua giai đoạn giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn: - Tiếp hợp tế bào chất với sự hòa hợp 2 tế bào trần của 2 giao tử . - Tiếp hợp nhân với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội. - Giảm phân giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội qua sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội). 1.1.4. Tìm hiểu về nấm mốc Aspergillus [3] Giống nấm Aspergillus có thể tới hơn 200 loài, sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả hoặc cuống bào tử đính. Bào tử đính phát triển thành tế bào rất dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc (foot cell). Nó tạo thành sợi cuống dài (stalk) và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi ( Xung quanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể bình). Từ bộ cuống đính bào tử cuối cùng, bào tử được sinh ra gọi là bào tử đính (conidia). SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger” Đồ án tốt nghiệp 6 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật Không có một giống nấm sợi nào khác ngoài giống nấm này có hệ bào tử đính tương tự. Giống nấm này phát triển rất nhiều trong các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nấm mốc Aspergillus niger [28] Aspergillus niger là một nấm sợi đơn bội và là một vi sinh vật rất cần thiết trong lĩnh vực sinh học. Ngoài việc sản xuất các enzyme ngoại bào và acid citric, A. niger được sử dụng cho xử các lý chất thải và biến đổi sinh học. Nấm mốc Aspergillus niger là loài phổ biến nhất của giống nấm mốc Aspergillus. Nó gây ra một căn bệnh gọi là mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như nho, hành tây, và đậu phộng, và là một chất gây ô nhiễm phổ biến trong thực phẩm. Nó tồn tại phổ biến trong đất, từ các môi trường trong nhà… Cấu trúc tế bào: Quan sát vi thể các sợi nấm của A. niger cho thấy các sợi được phân chia và có vách ngăn rõ ràng, chiều dài sợi nấm nằm trong khoảng 900- 1600μm. Trên đỉnh sợi nấm có chứa các bào tử túi khác nhau có đường kính 4- 60μm. Cấu trúc bộ gen: A. niger có tổng kích thước bộ gen rằng khoảng 35,5-38,5 Mb và bao gồm khoảng 13.000 gen. Trong số những gen này, khoảng 8.000-8.500 gen có nhiệm vụ chức năng rõ ràng. Ngoài ra, khoảng 14.000 khung đọc mở (open reading frames -ORF) đã được xác định trong hệ gen có khả năng có thể mã hóa một protein. Các trình tự DNA của A. niger bao gồm khoảng 33.900.000 cặp bazơ. SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger” Hình 1. 2. Hình ảnh về bào tử và sợi nấm A. niger quan sát dưới kính lup và kính hiển vi Đồ án tốt nghiệp 7 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật Ứng dụng: A. niger là một loài nấm mốc rất quan trọng, được sư dụng trong các lĩnh vực công nghệ sinh học. Nhiều sản phẩm sinh học và chế phẩm enzyme được sản xuất từ A. niger như acid citric, amylase, lipases, cellulolase, xylanase, protease… A. niger cũng được sử dụng để xử lý các chất thải và quá trình biến đổi sinh học (biotransformations). Trong 20 năm qua, A. niger được xem là nguồn vi sinh vật chính để sản xuất chế phẩm enzyme. Công nghệ enzyme Khái quát về enzyme:[7] Ennzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hòa tan trong nước và trong dung dịch muối loãng. Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến 100.000 dalton nên không qua được màng bán thấm. Tất cả các yếu tố làm biến tính protein như acid đặc, kiềm đặc, muối kim loại nặng…đều có thể làm enzyme bị biến tính và mất hoạt lực xúc tác. Enzyme có cường lực xúc tác rất lớn: ở điều kiện thích hợp hầu hết các phản ứng có xúc tác xảy ra với vận tốc nhanh gấp 10 8 - 10 11 lần so với phản ứng không có chất xúc tác. Enzyme có tính đặc hiệu cao: mỗi enzyme chỉ xúc tác làm chuyển hóa được một hoặc một số cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Sự tác dụng có tính chất lựa chọn này gọi là tính đặc hiệu của enzyme. Enzyme có tính đặc hiệu cao cho nên không tạo ra những sản phẩm phụ. Enzyme tác dụng trong điều kiện “êm dịu”. enzyme thường tác dụng thích hợp ở nhiệt độ 30÷50 0 C, pH trung tính và ở áp suất thường, không cần nồng độ acid hay nồng đọ kiềm mạnh, áp suất cao, do đó không đòi hỏi các thiết bị chịu acid, kiềm và chịu áp suất cao đắt tiền. Tất cả các enzyme có nguồn gốc tự nhiên không độc. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và trong y học. 1.2.2. Công nghệ sản xuất enzyme [23] Trong sản xuất chế phẩm enzyme, cần chú ý đến những yếu tố: Nguồn enzyme SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger” Đồ án tốt nghiệp 8 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật Có thể thu nhận enzyme từ động vật như trypsin, chimotrypsin, từ thực vật như papain của đu đủ, amylase của đại mạch. Nhưng enzyme vi sinh vật là nguồn phổ biến và giá thành có ý nghĩa kinh tế nhất. Cách thu nhận Phải dựa vào đặc trưng sinh học của đối tượng. Đối với vi sinh vật cần chú ý đến khâu chọn giống, vấn đề di truyền giống, khả năng sinh trưởngvà phát triển của giống ,đặc tính sinh lí hóa sinh của giống. 1.2.2.3. Các phương pháp nuôi cấy - Môi trường nuôi cấy: Tùy chủng để chọn môi trường thích hợp, thành phần dinh dưỡng phải phù hợp với sinh trưởng phát triển, đặc biệt là các yếu tố cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp protein. Cần nắm vững cơ chế điều hòa để có những thay đổi thích nghi. - Phương pháp nuôi cấy bề mặt: là nuôi cấy trên môi trường rắn với hàm lượng nước thấp khoảng 15÷20%. Ngoài thành phần dinh dưỡng là protein, tinh bột, khoáng …có thể trộn các chất làm xốp để thoáng khí. Tùy chủng để khống chế nhiệt độ, pH môi trường, độ ẩm, thời gian nuôi cấy…cho đạt hiệu quả sinh tổng hợp enzyme cao nhất. - Phương pháp nuôi cấy chìm: là nuôi cấy trong môi trường dịch thể, hàm lượng chất khô tối đa từ 25÷30%, thường từ 10÷15%. Ngoài protein, tinh bột, khoáng…còn có thể bổ sung kích thích tố. Cũng như trên, tùy chủng để khống chế nhiệt độ, pH môi trường, độ ẩm, thời gian nuôi cấy…cho đạt hiệu quả sinh tổng hợp enzyme cao nhất. Với hai phương pháp trên, mỗi loại có ưu khuyết điểm riêng. Nuôi cấy bề mặt thường cho hiệu suất cao, dễ gở bỏ từng phần nếu bị nhiễm, nhược điểm là tốn mặt bằng nhiều, khó tự động hóa. Phương pháp nuôi cấy chìm dễ tự động hóa, phải loại bỏ hoàn tan khi bị nhiễm. SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger” Đồ án tốt nghiệp 9 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật Thu nhận chế phẩm enzyme: Đối với canh trường bề mặt hay các đối tượng thực vật, có thể đồng hóa nếu cần, đó dùng dung dịch đệm hay nước cất để chiết rút enzyme ra khỏi canh trường bề mặt ta có dịch chiết enzyme. Đối với canh trường bề sâu chỉ cần lọc bỏ sinh khối là có dịch chiết tương tự trên. Sau đó có thể dùng các tác nhân kết tủa thuận nghịch như aceton, ethanol, muối trung tính để có chế phẩm enzyme ở dạng sạch hơn. Từ chế phẩm sạch này, bằng kỹ thuật điện di, lọc gel… ta có thể tách từng phần để có enzyme tinh khiết hơn.Tùy mục đích sử dụng để ta tạo ra chế phẩm thích hợp. Để nâng cao giá trị sử dụng, hiện nay người ta thường tạo ra chế phẩm enzyme gọi là enzyme không tan. Enzyme cảm ứng [4] Định nghĩa: Một quá trình sinh tổng hợp được gọi là cảm ứng nếu như nó chỉ xảy ra ở mức độ đáng kể khi trong môi trường có cơ chất đặc hiệu của enzyme này hoặc các chất trao đổi có cấu trúc tương tự cơ chất. Các enzyme thuộc loại này gọi là enzyme cảm ứng, các cơ chất kích thích quá trình tổng hợp này gọi là chất cảm ứng. Muốn tổng hợp được enzyme cảm ứng cần có 4 điều kiện: Thứ nhất: có gen tương ứng trong nhiễm sắc thể, Thứ hai: có nguyên liệu đầy đủ để xây dựng các phân tử enzyme đó (các axit amin, các hợp phần coenzyme). Thứ ba: có năng lượng cần thiết cho việc tổng hợp enzyme, Thứ tư: có chất cảm ứng. Phân loại enzyme [7] Dựa vào vị trí khu trú của enzyme trong tế bào người ta chia làm 3 nhóm chính: Enzyme ngoại bào: Enzyme được sinh tổng hợp ra ở trong tế bào rồi sau đó mới được tiết ra ngoài môi trường trong quá trình nuôi cấy chìm. Đó là trường hợp các enzyme hydrolase. SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger” Đồ án tốt nghiệp 10 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật Enzyme nội bào: Enzyme được tổng hợp và sử dụng ở bên trong tế bào. Nói chung các loại enzyme này thường có mặt hoặc dưới dạng liên hợp, dưới dạng liên kết hoặc dưới dạng bị ‘nhốt” trong các bào quan của tế bào. Các enzyme periplasmic: Là những enzyme nằm ở xoang ngoài màng sinh chất nhưng trong màng tế bào. 1.2.5. Ưu điểm của vi sinh vật trong công nghệ enzyme [4] So với động vật và thực vật thì thu nhận enzyme từ vi sinh vật có nhiều lợi thế hơn. - Từ vi sinh vật có thể thu nhận được nhiều enzyme khác nhau, trong đó có những loại không thể thu nhận từ động vật hoặc thực vật. - Bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy hoặc dùng tác nhân điều chỉnh người ta có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật theo ý muốn. - Vi sinh vật có khả năng sinh sản và phát triển nhanh, tổng hợp enzyme với tốc độ cực kỳ lớn trong thời gian ngắn. Chính vì thế việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật ít tốn thời gian. - Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các enzyme thu nhận từ các nguồn khác. - Vi sinh vật có khả năng sinh sản, phát triển và tổng hợp enzyme trên các môi trường dinh dưỡng đơn giản, dễ kiếm, rẻ tiền (có thể là phế liệu của các ngành sản xuất khác nhau). Cho nên việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật cũng rất kinh tế. Giới thiệu về enzyme glucose oxidase Glucose oxydase (GOD: β-D-glucose: oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là enzyme xúc tác quá trình oxi hóa β-D-glucose thành acid gluconic bằng cách sử dụng oxi làm chất chất nhận điện tử, đồng thời sinh ra hydroperoxit (H 2 O 2 ). Vi sinh vật sinh enzyme GOD gần đây đã nhận được sự qua tâm rộng rãi trong việc mở rộng ứng dụng trong hóa học, dược phẩm, thực phẩm, đồ uống, hóa học lâm sàng, công nghệ sinh học và trong một số ngành công nghiệp khác. Ứng dụng mới của GOD là sử dụng trong thiết bị cảm biến sinh học đã làm gia tăng nhu cầu về enzyme này trong những năm gần đây. Hiện nay đang xem xét và nghiên cứu về quá trình sản xuất, thu nhận, mô tả đặc tính, cố định và ứng dụng của GOD. Quá trình sản xuất GOD bằng phương pháp lên men và phương pháp tái tổ hợp được SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger” [...]... men sản xuất enzyme glucose oxidase Những loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme glucose 1.3.5.1 oxidase [20] Nguồn vi sinh vật phổ biến nhất cho sản xuất lên men GOD là các loài Aspergillus, Penicillium và Saccharomyces GOD được tìm thấy trong nhiều dòng SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án... Duy [25] và Nghiên cứu khả năng gắn enzyme glucose oxidase vào sợi nano platinum để tạo cảm biến glucose của Lê Thị Thanh Tuyền (2008) [27] 1.4 Nhận xét chung SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp 28 GVHD: TS Đặng Minh Nhật Từ những bằng chứng trên, GOD là một trong những enzyme quan... thu nhận enzyme Glucose oxidase thể của GOD A thì nhỏ và có hoạt tính enzyme cao GOD B mang nhiều điện tích âm hơn GOD A, và do đó nó có thể chỉ được chiết ra sau GOD A và cũng phá hủy SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp 26 GVHD: TS Đặng Minh Nhật hình thể riêng, làm giảm hoạt tính enzyme. .. của sợi nấm, đuổi bọt khí trong sợi nấm, và làm sợi nấm nở to ra để dễ quan sát Sử dụng kính hiển vi quang học Olympus CX31, quan sát tại tiêu cự 40cm hình ảnh bào tử và sợi nấm được thể hiện trên hình 3.2 SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp 34 Bào tử GVHD: TS Đặng Minh Nhật Sợi nấm Hình... có gai rõ rệt Như vậy, từ quá trình phân lập, đánh giá hoạt độ, quan sát đại thể và quan sát vi thể chúng tôi có thể kết luận chủng nấm mốc Aspergillus của chúng tôi đã được thu n chủng và có thể sử dụng làm giống cho quá trình nghiên cứu tiếp theo SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp... 1995, Hatzinikolaou và Macris nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến sự phát triển và hoạt tính tổng của GOD từ A niger nuôi trên SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp 20 GVHD: TS Đặng Minh Nhật nguồn carbon duy nhất là saccharose và rỉ đường Họ nhận thấy nồng độ peptone có... tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp 32 GVHD: TS Đặng Minh Nhật ngờ là A niger (có màu đen, hoặc nâu thẫm lấm tấm như bã cafe), dùng que cấy nhọn đầu lấy một ít bào tử cấy ba điểm cách đều nhau trên đĩa thạch Czapek, ủ ấm 280C trong 5 ngày Thực hiện lặp lại các thao tác trên nhiều lần cho đến khi thu nhận được gioonsng thu n... được giải phóng từ CAT bởi sử dụng sắc ký trao đổi ion SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp 25 GVHD: TS Đặng Minh Nhật Mốc giống Tăng sinh Lên men Dịch lên men Lọc Sinh khối (NH4)2SO4 Khuấy trộn Kết tủa Phân cắt tế bào Ly tâm (NH4)2SO4 Loại muối Kết tủa Làm khô lạnh Kể từ khi phân tách... Hoạt tính của enzyme phụ thu c vào trạng thái ion hóa của amino axit ở trạng thái hoạt động pH đóng vai trò quan trọng duy trì hình thể riêng của enzyme SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp 13 GVHD: TS Đặng Minh Nhật Hầu hết protein chỉ hoạt động trong khoảng pH hẹp, thường là từ 5÷9 pH tối... ngâm bắp sinh tổng hợp bởi Aspergillus nige R P Kona và cộng sự kết luận hoạt tính enzyme tăng đến 640±36U/ml khi bổ sung nước ngâm bắp vào môi trường, họ nhận thấy đây là nguồn nitơ tốt nhất cho sự tổng hợp enzyme GOD hơn hẳn so với các nguồn SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp 27 GVHD: . nhất. - Thu nhận chế phẩm enzyme ngoại bào thô. Nội dung nghiên cứu của đề tài: SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus. 06H2B Đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp 9 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật Thu nhận chế phẩm enzyme: Đối. tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger Đồ án tốt nghiệp 11 GVHD: TS. Đặng Minh Nhật xem xét một cách cặn kẽ. Nhiều kỹ thu t tinh chế