Bộ y tế Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ ứng dụng kỹ thuật PCR và fish nghiên cứu biến đổi adn ở một số thể bệnh lơ xê mi và hemophilia A Chủ nhiệm đề tài : PGS. TS. Phạm Quang vinh Cơ quan chủ trì đề tài : viện huyết học - truyền máu TW 6872 22/5/2008 hà nội - 2007 Bộ y tế Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ ứng dụng kỹ thuật PCR và fish nghiên cứu biến đổi adn ở một số thể bệnh lơ xê mi và hemophilia A Chủ nhiệm đề tài : PGS. TS. Phạm Quang vinh Cơ quan chủ trì đề tài : viện huyết học - truyền máu TW Cơ quan quản lý : Bộ Y tế Thời gian thực hiện : Từ tháng 10 năm 2003 đến tháng 6 năm 2007 Tổng kinh phí thực hiện đề tài : 260 triệu đồng Trong đó : Kinh phí SNKH : 260 triệu đồng hà nội - 2007 Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ 1. Tên đề tài: ứng dụng kỹ thuật PCR và FISH nghiên cứu biến đổi ADN ở một số thể bệnh Lơ xê mi và Hemophilia A. 2. Chủ nhiệm đề tài : PGS. TS. Phạm Quang vinh 3. Cơ quan chủ trì đề tài : viện huyết học - truyền máu TW 4. Cơ quan quản lý đề tài : Bộ Y tế 5. Th ký đề tài : ThS. Võ Thanh Bình 6. Phó chủ nhiệm đề tài 7. Những ngời thực hiện : Đơn vị : - Khoa Miễn dịch Di truyền - Viện Huyết học - Truyền máu TW - Khoa Tế bào - Viện Huyết học - Truyền máu TW - Khoa lâm sàng các bệnh máu viện huyết học - truyền máu TW - Khoa điều trị hemophilia viện huyết học - truyền máu TW - Phòng Sinh hoá, Khoa Di truyền - Sinh học phân tử Viện Vệ sinh Dịch tễ TW Cá nhân : 1. PGS. TS. Phạm Quang Vinh - Viện HH-TM TW 2. PGS. TS. Bạch Khánh Hoà - Viện HH-TM TW 3. CN. Nguyễn Quốc Cờng - Viện HH-TM TW 4. CN. Trần Công Hoàng - Viện HH-TM TW 5. ThS. Nguyễn Thị Mai - Viện HH-TM TW 6. ThS. Võ Thanh Bình - Viện HH-TM TW 7. ThS. Nguyễn Quang Tùng - Viện HH-TM TW 8. ThS. Vũ Minh Phơng - Viện HH-TM TW 9. CN. Nguyễn Minh Phơng - Viện HH-TM TW 10. BSNT. Nguyễn Thiên Lữ - Viện HH-TM TW 11. TS. Nguyễn Hạnh Phúc - Viện VSDT TW 12. TS. Nguyễn Hoài Giang - Viện VSDT TW 8. Các đề tài nhánh 9. Thời gian thực hiện đề tài : Từ tháng 10/2003 đến tháng 6/2007. chữ viết tắt AML ( Acute Myeloid leukemia) : Lơ xê mi cấp dòng tuỷ ALL ( Acute Lymphocytic leukemia) : Lơ xê mi cấp dòng lympho APL ( Acute promyelocytic leukemia) : Lơ xê mi cấp thể tiền tuỷ bào FISH ( Fluorescense In situ Hybridization) : Kỹ thuật lai huỳnh quang MDS ( Myelodysplastic syndrome) : Hội chứng rối loạn sinh tuỷ MLL ( Mixed Lineage leukemia) : Lơ xê mi cấp lai tuỷ - lympho PCR (polymerase chain reaction) : Phản ứng khuếch đại gen RT - PCR (Reverse Trans-criptase Polymerase chain reaction) : Phản ứng khuếch đại gen đảo ngợc RFLPs ( Restriction Fragment Length Polymorphism) : Kỹ thuật cắt ADN bằng enzym hạn chế Mục lục Trang Phần A. Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài 1 Mở đầu 3 Chơng 1. Tổng quan tài liệu 5 1.1. Bất thờng vật chất di truyền và bệnh máu 5 1.1.1. Bất thờng di truyền bẩm sinh 5 1.1.2. Bất thờng di truyền mắc phải 6 1.2. Bất thờng di truyền và Hemophilia 6 1.2.1. Giới thiệu bệnh Hemophilia 6 1.2.2. Di truyền phân tử yếu tố VIII 8 1.2.3. Di truyền bệnh Hemophilia 9 1.2.4. Các tổn thơng di truyền ở bệnh nhân Hemophilia A 10 1.2.5. Các phơng pháp phát hiện ngời mang gen bệnh Hemophilia 11 1.3. Bất thờng di truyền và lơ xê mi 17 1.3.1. Cơ chế sinh lơ xê mi 17 1.3.2. Hệ thống gen trong tế bào liên quan đến ung th 17 1.3.3. Hoạt hoá các oncogene ở bệnh máu ác tính 25 1.3.4. Bất hoạt gen ức chế u 32 1.3.5. Vai trò phát hiện bất thờng di truyền trong nghiên cứu bệnh lơ xê mi 33 Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 36 2.1. Xác định ngời mang gen Hemophilia 36 2.1.1. Đối tợng 36 2.1.2. Phơng pháp nghiên cứu 36 2.2. Nghiên cứu bất thờng gen ở bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh 40 2.2.1. Đối tợng 40 2.2.2. Phơng pháp nghiên cứu 40 2.3. Xác định gen hỗn hợp AML/ETO ở lơ xê mi cấp M2 và gen PML/RAR ở M3 48 2.3.1. Đối tợng 48 2.3.2. Phơng pháp 49 Chơng 3. Kết quả 54 3.1. Hemophilia 54 3.1.1. Tỉ lệ dị hợp tử với dạng đa hình ADN có điểm cắt với enzym BclI trên intron 18 và HindIII trên intron 19 của gen yếu tố VIII 54 3.1.2. Xác định ngời phụ nữ mang gen bệnh dựa vào phân tích kết quả PCR-RFLPs với BclI 58 3.2. Phát hiện gen hỗn hợp BCR/ABL ở lơ xê mi hạt kinh 60 3.2.1. Phát hiện bằng kỹ thuật PCR 60 3.2.2. Phát hiện gen hỗn hợp BCR/ABL bằng kỹ thuật FISH 64 3.3. Phát hiện gen hỗn hợp ETO/AML ở M2 và PML/RAR ở bệnh nhân M3 66 Chơng 4. Bàn luận 68 4.1. Tính đa hình gen Hemophilia và xác định ngời mang gen bệnh 68 4.1.1. Tỉ lệ dị hợp tử của PCR-RFPs với vị trí cắt đặc hiệu của BclI và HindIII 68 4.1.2. áp dụng PCR-RFLPs với BclI vào chẩn đoán ngời mang gen Hemophilia A 70 4.2. Gen hỗn hợp BCR/ABL và lơ xê mi hạt kinh 72 4.3. Kết quả phân tích gen ETO/AML và RAR/PML 75 Kết luận 77 Tài liệu tham khảo 79 1 Phần A Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài Hoàn cảnh ra đời và mục tiêu của đề tài : Các bất thờng ADN là nguyên nhân của nhiều bệnh bẩm sinh, có tính di truyền mà hai bệnh thờng gặp trong chuyên khoa Huyết học - Truyền máu là Thalassemia và Hemophilia. Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong nớc và trên thế giới về gen bệnh gây Thalassemia. Một số kết quả đã đợc ứng dụng trong chẩn đoán sớm và chẩn đoán trớc sinh. Trong khi đó bất thờng ADN trong Hemophilia rất phức tạp và đa dạng, những hậu quả của bệnh rất nặng nề. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen bệnh, về phát hiện ngời lành mang gen bệnh để có biện pháp đề phòng. ở Việt Nam công tác quản lý, chăm sóc ngời bệnh Hemophilia cha thật tốt. Tính chất di truyền, đặc điểm gen di truyền cha đợc nghiên cứu; cha có biện pháp hiệu quả xác định ngời lành mang gen bệnh. Bên cạnh đó một số biến đổi ADN trong tế bào gốc tạo máu có thể đa đến hậu quả rối loạn phát triển và gây ra bệnh máu ác tính. Mỗi loại bất thờng gen có những bệnh cảnh khác nhau. Vì vậy năm 2001 Tổ chức Y tế Thế giới đã đa ra cách xếp loại bệnh máu và cơ quan lympho. Theo cách xếp loại này với lơ xê mi cấp cần xem xét trớc hết là sự có mặt hay không của các biến đổi gen đặc trng. Để xác dịnh gen này cần thực hiện kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử. Viện Huyết học - Truyền máu trong nhiều năm đã xây dựng Trung tâm Hemophilia và tổ chức các hoạt động tuyên truyền về phát hiện, chăm sóc, điều trị bệnh. Hàng năm số bệnh nhân do Viện quản lý càng tăng lên. Trong những năm qua Viện đã triển khai các kỹ thuật chẩn đoán hiện đại nh xác định CD màng tế bào, phân tích bất thờng nhiễm sắc thể trong lơ xê mi. Viện là cơ sở đầu ngành của chuyên khoa Huyết học - Truyền máu cần triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng trong chẩn đoán ngời 2 mang gen hemophilia, chẩn đoán trớc sinh với bệnh này. Đồng thời Viện phải tổ chức sớm việc ứng dụng các kỹ thuật chẩn đoán và phân loại mới theo quốc tế. Vì vậy đơn vị nghiên cứu đã đề xuất đề tài nhằm mục đích : 1. Sử dụng kỹ thuật PCR xác định các bất thờng ADN ở bệnh nhân hemophilia tiến tới tìm ngời lành mang gen bệnh. 2. Triển khai kỹ thuật PCR và FISH trong việc phát hiện một số gen đặc trng ở bệnh lơ xê mi cấp, lơ xê mi hạt kinh. Kết quả nổi bật của đề tài: 1. Triển khai đợc kỹ thuật PCR và FISH ở Viện Huyết học - Truyền máu Trung ơng. - Đa kỹ thuật hiện đại vào áp dụng và đào tạo đợc đội ngũ cán bộ kỹ thuật thực hiện đợc qui trình kỹ thuật xét nghiệm PCR, FISH làm cơ sở cho việc ứng dụng phơng pháp sinh học phân tử chẩn đoán bệnh. - ứng dụng dụng kỹ thuật PCR - RFLPs xác định ADN đa hình gen yếu tố VIII. Bớc đầu xác định tỷ lệ dị hợp tử của dạng đa hình ADN cắt bằng enzym BclI là 48% ở phụ nữ bình thờng. Đây là tỷ lệ có ý nghĩa để giúp phát hiện ngời mang gen Hemophilia A. - ứng dụng đợc kỹ thuật PCR và kỹ thuật FISH để xác định gen hỗn hợp ABL/BCR ở lơ xê mi kinh dòng tủy . ứng dụng kỹ thuật RT PCR phát hiện gen AML/ETO và RAR/PML ở lơ xê mi cấp dòng tủy, tiến tới góp phần phân loại lơ xê mi. 2. Xây dựng đợc qui trình sử dụng kỹ thuật PCR xác định ngời lành mang gen trong gia đình bệnh nhân Hemophilia A và đã áp dụng để phát hiện đợc 2 ngời lành mang gen bệnh, xác định 7 ngời không mang gen bệnh. 3. Đào tạo: - Một luận văn nội trú (đã bảo vệ) - Làm cơ sở một luận án Nghiên cứu sinh 3 Mở đầu Bệnh máu là các bệnh liên quan đến tế bào máu, cơ quan tạo máu và hệ thống cầm, đông máu. Tế bào máu và cơ quan tạo máu hoạt động, sinh sản, bệnh hoá thực chất là quá trình hoạt động của hệ thống gen - protein. Các yếu tố tham gia vào cầm, đông máu cũng là protein - đó là sản phẩm của tế bào thông qua hoạt động gen - protein. Nh vậy, dù thuộc loại bệnh nào đều có liên quan đến hoạt động của gen - protein. Các kỹ thuật sinh học đặc biệt là kỹ thuật sinh học phân tử phát triển đã có đóng góp trong việc chẩn đoán nhiều bệnh và phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh. Những bệnh máu liên quan đến vật chất di truyền có thể là do bẩm sinh: hệ thống gen đã bị tổn thơng ngay khi cơ thể đợc hình thành, các tế bào của cơ thể đều mang gen bất thờng. Thuộc nhóm này có rất nhiều bệnh nhng 2 loại bệnh hay gặp là thalassemia và hemophilia. Cũng có thể bất thờng vật chất di truyền xảy ra ở 1 tế bào gốc tạo máu và tạo ra các tế bào con cháu mang bất thờng này. Có nhiều bất thờng gây rối loạn phát triển tế bào mà điển hình là bệnh ác tính cơ quan tạo máu. Trên thế giới các nghiên cứu phát hiện bất thờng vật chất di truyền (ADN) trong các bệnh thalassemia, hemophilia và bệnh ác tính hệ tạo máu đã đợc thực hiện ở các trung tâm và các nớc phát triển, đang phát triển. Kết quả nghiên cứu đợc ứng dụng trong chẩn đoán và phòng ngừa bệnh Hemophilia, Thalassemia. Riêng đối với bệnh máu, Tổ chức Y tế Thế giới đã đề nghị xếp loại trớc hết căn cứ vào bất thờng di truyền [21]. 4 ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu vật chất di truyền trong bệnh Thalassemia. Tuy nhiên cha có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc xác định đột biến (bất thờng ADN) ở bệnh nhân Hemophilia và lơ xê mi. Nhằm dần dần triển khai áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu bệnh máu, chúng tôi thực hiện đề tài này với mục tiêu: 1. ứng dụng kỹ thuật PCR xác định bất thờng ADN ở bệnh nhân hemophilia A góp phần phát hiện ngời mang gen bệnh. 2. ứng dụng kỹ thuật PCR và và FISH phát hiện bất thờng ADN ở một số thể bệnh lơ xê mi cấp và lơ xê mi hạt kinh. [...]... bazơ (bp) ARN thông tin mã h a một protein gồm 2351 acid amin Yếu tố VIII đợc sản xuất nh một protein chuỗi đơn với cấu trúc 6 domain (a1 -A2 -BA3-C1-C2) và ở dạng bất hoạt Protein yếu tố VIII sẽ thay đổi khi có sự phân hủy protein Dới tác dụng c a thrombin và yếu tố Xa, yếu tố VIII bị cắt ở vị trí 372 (chỗ nối A1 - A2 ), 740 (chỗ nối A2 -B) và 1689 (chỗ nối B -A3 ) Khi domain A2 tơng tác với phức hợp A1 /A3 -C1-C2... mang gen và ngời phụ nữ có khả năng mang gen Ngời phụ nữ chắc chắn mang gen khi: - có ít nhất hai con trai bị bệnh - là con c a bệnh nhân hemophilia - có 1 con trai bị bệnh và có ít nhất 1 ngời đàn ông trong họ mẹ bị bệnh Ngời phụ nữ có khả năng mang gen khi: - có 1 con trai bị bệnh - có ít nhất 1 ngời đàn ông trong họ mẹ bị bệnh và không có con trai bị bệnh khả năng mang gen c a một ngời phụ nữ d a. .. gen d a vào phân tích tổn thơng di truyền: Sau khi gen yếu tố viii và yếu tố ix đợc nhân lên nhiều lần thì ngời ta có thể xác định chính xác tình trạng mang gen cũng nh chẩn đoán trớc sinh thai nhi hemophilia A và B bằng cách phân tích adn việc phân tích trực tiếp đột biến nh trong thalassemia hoặc bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm có thể coi là một biện pháp lí tởng, có thể áp dụng trong a số các... marker a hình cần biết sự tơng quan liên kết gi a chúng 15 3 khoảng cách gi a marker a hình và gen cần đợc biết vì nguy cơ tái tổ hợp liên quan trực tiếp đến khoảng cách gi a marker và đột biến 4 tỉ lệ có thông tin phụ thuộc vào tỉ lệ dị hợp tử về marker a hình c a từng quần thể và cần xác định tỉ lệ này trớc khi tiến hành phân tích adn ví dụ: trong một gia đình Hemophilia A, phân tích pcr- rflps... gen AML1/ETO cho chuột thì chuột thể hiện bị bệnh nh đồng hợp tử không có gen AML1 [7] mặc dù ngoài gen ghép, chuột còn gen AML1 bình thờng Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, Downing và Head phân tích ADN c a 26 bệnh nhân ngời Anh có t(8;21) (q22; q22) [12] Cùng thời gian này Kozu và Miyoshi cũng dùng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) để nghiên cứu điểm nối các gen trong chuyển đoạn (8; 21) ở. .. bệnh nhân Hemophilia A: Gen mã hoá yếu tố viii có kích thớc lớn gồm 26 exon và 25 intron Hemophilia có thể là hậu quả c a các đột biến điểm, mất một phần hoặc tất cả gen, chuyển đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hoặc đột biến ở bộ ba khởi đầu hay bộ ba kết thúc Các nghiên cứu cho thấy tổn thơng di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành kháng thể kháng viii cũng nh mức độ nặng c a bệnh những bệnh. .. ở 28 53% bệnh nhân hemophilia thể nặng ở nhiều nớc [14]Độ lớn c a gen cũng nh tỉ lệ đột biến mới cao dẫn tới khó khăn trong việc xác định trực tiếp tổn thơng gen yếu tố VIII [14],[42] Ngoài các đột biến làm giảm hoặc bất thờng tổng hợp yếu tố viii, gen mã h a yếu tố VIII còn có một số biến đổi không gây bệnh gọi là a hình (polymorphism) các a hình có thể xảy ra ở bệnh nhân hemophilia và ở cả những... trai bị bệnh và 50% con trai bình thờng về Hemophilia 9 Mẹ mang gen bệnh h XX Bố bình thờng XY - Có 50% khả năng con trai bị Hemophilia - Có 50% khả năng con gái trở thành XXh XX Con gái bình thờng Con gái mang gen XY Con trai bình thờng ngời mang gen bệnh XhY Con trai bị bệnh Nếu bố bị bệnh lấy mẹ mang gen bệnh (trờng hợp này rất hiếm gặp và thờng do kết hôn gần) thì 50% con trai c a họ là ngời bị bệnh, ... hợp tử về marker nào là ngời có 2 alen khác nhau về marker đó trên 2 nhiễm sắc thể x c a mình, và đợc gọi là có thông tin tỉ lệ dị hợp tử c a các marker a hình rflps này rất thay đổi ở các tộc ngời khác nhau vì vậy để đảm bảo hiệu quả cho việc chẩn đoán, việc chọn l a sử dụng a hình nào cần căn cứ vào tỉ lệ dị hợp tử c a quần thể ngời đó bên cạnh đó, có một số rflps liên kết tơng quan với nhau; nói... trị lớn, vì vậy, a số bệnh nhân hemophilia không đợc điều trị đầy đủ dẫn tới tỉ lệ tàn tật cao Chính vì vậy việc phát hiện ngời mang gen bệnh để t vấn cho họ về sinh sản, để có thể sinh ra thế hệ sau khoẻ mạnh là một nhu cầu bức bách và có ý ngh a nhân văn cao cả Có nhiều phơng pháp phát hiện ngời mang gen bệnh: d a vào phân tích phả hệ, d a vào kiểu hình (tỉ lệ fviii:c/vwf:ag), d a vào kiểu gen trong . nghiên cứu đề tài cấp bộ ứng dụng kỹ thuật PCR và fish nghiên cứu biến đổi adn ở một số thể bệnh lơ xê mi và hemophilia A Chủ nhiệm đề tài : PGS. TS. Phạm Quang vinh Cơ quan. kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ ứng dụng kỹ thuật PCR và fish nghiên cứu biến đổi adn ở một số thể bệnh lơ xê mi và hemophilia A Chủ nhiệm đề tài : PGS. TS. Phạm Quang vinh. quả nghiên cứu đề tài cấp bộ 1. Tên đề tài: ứng dụng kỹ thuật PCR và FISH nghiên cứu biến đổi ADN ở một số thể bệnh Lơ xê mi và Hemophilia A. 2. Chủ nhiệm đề tài : PGS. TS. Phạm Quang