1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Một trong những hiện tượng thay đổi của môi trường ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của thực vật là tình trạng hạn. Hạn hán có ảnh hưởng xấu ở các mức độ khác nhau trong suốt quá trình hay từng giai đoạn sống của cơ thể thực vật dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng, chậm phát triển và gây chết. Hiện nay trên thế giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán. Tại Việt Nam trong 7,3 – 7,4 triệu ha đất trồng thì có tới 1,5 – 1,8 triệu ha bị thiếu nước. Nghiên cứu bản chất tính chống chịu của cây trồng cho thấy đây là một tính trạng đa gen. Vai trò cụ thể của từng gen riêng rẽ liên quan đến tính chống chịu ở thực vật (ví dụ P5CS, RD22…) đã được nhiều nghiên cứu tìm hiểu và phân tích. Tuy nhiên, dưới tác động của các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, không chỉ các gen riêng rẽ được biểu hiện mà là một hệ thống các gen liên quan được kích hoạt biểu hiện nhằm đáp ứng với tình trạng bất lợi mà thực vật gặp phải. Một trong số những yếu tố kích hoạt hoạt động của các gen liên quan đến khả năng chống chịu là các nhân tố phiên mã (transcription factor – TF). Họ nhân tố phiên mã NAC (NAC transcription factor) là một trong những họ TF đặc trưng lớn nhất trong hệ gen thực vật [106]. Nhân tố phiên mã NAC có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng trong cơ thể thực vật [99]. Nhiều gen NAC tham gia vào phản ứng với những áp lực khác nhau từ môi trường trong đó có hạn [87], [113], [133]… Nhiều tác giả đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC thành công vào một số loài cây trồng như: cây lúa, lúa mỳ, thuốc lá, [54], [55], [60], [77], [87], [103], [127], [133]. Trên đối tượng cây lạc, các gen AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 liên quan đến tính chịu hạn đã được tách dòng thành công [71], AhNAC2 đã được sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc chịu hạn và chuyển thành công vào cây Arabidopsis [72]. Lạc là cây nông nghiệp ngắn ngày được trồng phổ biến trên thế giới. Ở nước ta, cây lạc được trồng trên khắp các miền và phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác nhau. Tuy nhiên, hạn, mặn, lạnh vẫn là yếu tố hạn chế đối với sự sinh trưởng và 2 năng suất của cây trồng trong đó có cây lạc. Cây lạc là cây họ đậu, thuộc nhóm chịu hạn kém [13]. Một số kỹ thuật chọn tạo giống có khả năng chịu hạn như lai giống hoặc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật đã được áp dụng [11], [13], [14], [15]. Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo ra những giống lạc có khả năng chịu khô hạn còn chưa được nghiên cứu nhiều. Từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)” nhằm thử nghiệm khả năng chuyển gen chỉ thị và tiến tới chuyển gen chịu hạn với mục đích tạo ra dòng cây chuyển gen phục vụ chọn giống chịu hạn ở cây lạc. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu nhằm cải tạo cây lạc và cải thiện về khả năng chống chịu trên đối tượng cây trồng này. 2. Mục tiêu nghiên cứu (1) Phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt. (2) Thiết kế được vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2. Tạo cây chuyển gen và biểu hiện được protein NAC2 ở cây thuốc lá. (3) Tạo được dòng cây lạc chuyển gen. Phân tích các dòng cây lạc chuyển gen. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mô sẹo và cây non. (2) Phân lập, tách dòng và giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 liên quan đến tính chịu hạn của cây lạc. (3) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2, tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp và chuyển vào cây thuốc lá mô hình. (4) Xác định sự có mặt của gen chuyển NAC2 trên cây thuốc lá, đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen thông qua sự thay đổi hàm lượng proline. Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp NAC2 ở cây thuốc lá chuyển gen. (5) Phát triển hệ thống tái sinh cây ở cây lạc và chuyển gen chỉ thị (GUS) qua mô sẹo và phôi soma. (6) Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 vào cây lạc, phân tích các dòng lạc chuyển gen. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN THỰC VẬT 1.1.1. Tác động của hạn đến thực vật và cây lạc 1.1.1.1. Cây lạc Cây lạc có nguồn gốc ở vùng Nam Bolivia, Tây bắc Achentina, Nam Mỹ. Người Bồ Đào Nha đưa cây lạc từ Brazin sang Tây Phi và sau đó đến Tây Nam Ấn Độ từ thế kỉ XVI. Sau đó được đem trồng ở rất nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam, cây lạc được du nhập từ Trung Quốc sang và được trồng vào khoảng thế kỉ XVII- XVIII [8], [13]. Về mặt phân loại, cây lạc có tên khoa học là Arachis hypogaea (L.) với 2n=40 NST. Theo Krapo Vikas và một số tác giả khác, cây lạc thuộc họ cánh bướm Fabaceae, thuộc chi Arachis. Loài lạc trồng Archis hypogaea (L.) gồm hai loài phụ: Loài phụ Hypogaea gồm hai chủng: Hypogaea loại hình Virginia và Bersuta kohter. Loài phụ Fastigiata gồm hai chủng: Fastigiata loại hình Valencia và Vulgaris harz loại hình Spanish. Về hình thái, cây lạc gồm các bộ phận chính là rễ, thân, lá, hoa và quả lạc. Rễ lạc có rễ cọc và rễ con. Trên rễ lạc có nhiều nốt sần được tạo thành do vi khuẩn Rhizobium sống cộng sinh, do vậy cây lạc có khả năng cố định nitơ phân tử trong không khí thành đạm cung cấp cho cây và đất trồng. Những nốt sần này tăng nhanh về số lượng và kích thước từ khi cây lạc có 6 - 7 lá đến lúc nở hoa. Thân chính của cây lạc thường chỉ cao khoảng 25cm - 50cm. Lá lạc là loại lá kép hình lông chim có 4 lá chét mọc đối nhau, hình trái xoan ngược, có 2 lá kèm hình dải nhọn bao quanh thân. Trên thân chính thường có khoảng 20 lá. Khi cây lạc có 5 - 6 lá trên thân chính thì lạc bắt đầu phân hoá các mầm hoa. Hoa lạc mọc ra từ các mắt của cành. Mỗi vị trí có thể có từ 3 - 5 hoa, khi cây lạc đã có 8 - 9 lá thì hoa nở. Lạc là loại cây tự thụ phấn nghiêm ngặt, khi thấy hoa nở là cây đã thụ phấn xong. Hoa lạc sau khi thụ phấn thì đâm tia xuống đất hình thành quả (thường gọi là củ). Quả 4 lạc có hình trụ thuôn thắt lại ở giữa các hạt vỏ quả cứng có gân mạng. Mỗi quả có 1 - 3 hạt. Hạt hình trứng, có vỏ lụa màu đỏ, vàng, cánh sen hoặc trắng [13]. Theo thời gian sinh trưởng của cây lạc người ta chia làm giống chín sớm (thời gian sinh trưởng 90 ngày - 125 ngày) và giống chín muộn (140 ngày - 160 ngày). Cây lạc đòi hỏi khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển của cây lạc từ 24 0 C - 33 0 C. Nhiệt độ để hạt nảy mầm thấp nhất phải trên 12 0 C, từ 15 0 C hạt lạc đã bắt đầu nảy mầm tốt, dưới 17 0 C hoa không thụ phấn, yêu cầu độ ẩm từ 60% - 70%, độ ẩm thấp dưới 60% đã kéo dài thời gian nảy mầm và hạt không nảy mầm được ở độ ẩm đất 40% - 50%. Đất trồng lạc lí tưởng phải là đất thoát nước nhanh, chân đất nhẹ, thoáng, có màu sáng, tơi xốp, phù sa pha cát có đầy đủ canxi và lượng chất hữu cơ vừa phải sẽ tạo điều kiện cho lạc nảy mầm, dễ dàng ngoi lên mặt đất và sinh trưởng, hình thành quả tốt, độ pH của đất từ 6-7 là thích hợp nhất [13]. Cây lạc được coi là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị đa dạng về các mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt và trong công nghiệp. Diện tích trồng lạc tập trung nhiều nhất ở vùng Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh rồi tới đồng bằng trung du Bắc Bộ (Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình). Trên thực tế, diện tích trồng lạc ở nước ta còn nhỏ và phân tán, trừ một vài vùng lạc tập trung như Diễn Châu (Nghệ An), Hậu Lộc (Thanh Hoá). Gần đây cây lạc được khuyến khích phát triển mạnh, đặc biệt ở những nơi đất bạc màu, thoái hoá như vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ, những dải đất ven biển từ Thanh Hoá chạy dài tới giáp Đông Nam Bộ,… đều có thể trồng được lạc. Nhiều vùng đất nhất là ở miền Nam có thể trồng được 2 vụ lạc trong năm [13]. 1.1.1.2. Tác động của hạn đến thực vật Hạn là một trong những yếu tố cực đoan phi sinh học được quan tâm đến nhiều nhất hiện nay. Hiện tượng khô hạn xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước vào tế bào. Trong trường hợp này, tác động của môi trường bên ngoài rất lớn, gây ảnh hưởng đáng kể lên sự phát triển của thực vật, có thể dẫn đến hủy hoại cây cối và mất mùa [7], [23], [27], [36]. Các yếu tố bất lợi của môi trường có thể là: nhiệt độ cao, gió nóng, thời tiết và khí hậu. Khái niệm hạn dùng để chỉ tình trạng 5 mất nước của cây. Khả năng thực vật có thể giảm thiểu mức tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn [7]. Xu thế thay đổi của khí hậu làm cho hạn hán bất thường xảy ra ở nhiều nơi, đây là nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng [94]. Theo FAO, ước tính có 70% tiềm năng về năng suất bị mất đi do điều kiện bất lợi của môi trường và sâu bệnh hại, ngay cả ở những quốc gia có nền nông nghiệp phát triển. Hiện nay trên thế giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán [45]. Tại Việt Nam, trong 7,3-7,5 triệu ha đất trồng thì có tới 1,5-1,8 triệu ha thiếu nước. Khi gặp hạn trạng thái của chất nguyên sinh trong tế bào thay đổi mạnh, ảnh hưởng đến tính chất hoá lý của chất nguyên sinh như tính thấm, mức độ thuỷ hoá của keo, thay đổi pH, độ nhớt, cuối cùng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất bình thường của cơ thể. Hạn ảnh hưởng xấu đến quá trình hình thành diệp lục, phá hoại lục lạp nên hiệu suất quang hợp giảm xuống nhanh chóng. Hạn ảnh hưởng đến hoạt động hút khoáng của bộ rễ, dẫn đến tình trạng thiếu những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trong quá trình trao đổi và tổng hợp các chất hữu cơ khác nhau trong cơ thể thực vật [28], [36], [45]. Để chống khô hạn, cây có thể giữ không bị mất nước, giảm diện tích lá, rút ngắn chu kì sống. Bất kỳ sự mất nước nào cũng dẫn đến hiện tượng thiếu hụt nước trong tế bào. Nước vừa là nguyên liệu, vừa là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra. Vì vậy, sự vi phạm chế độ nước ảnh hưởng rất lớn đến mọi quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Về tác động của hạn đến thực vật, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu theo 2 hướng: khảo sát tính chịu hạn của các đối tượng thực vật trong điều kiện tự nhiên ngoài đồng ruộng hoặc trong điều kiện nhân tạo tại phòng thí nghiệm. Nhiều cây trồng như ngô, lúa, đậu tương, lạc…đã được các nhà nghiên cứu đánh giá, khảo sát về đặc tính chịu hạn thông qua các điều kiện tự nhiên ngoài đồng ruộng. Một trong những phương pháp được sử dụng là chủ động gây ra sự thiếu nước và tiến hành nghiên cứu phản ứng của các cơ thể thực vật trong điều kiện này. [5]. Khi gặp hạn, cây lạc cũng chịu ảnh hưởng nặng nề đến quá trình sinh trưởng và phát triển. Khi tiến hành nghiên cứu ngoài tự nhiên bằng phương pháp gây hạn nhân 6 tạo, nhận thấy sự thiếu hụt nước ở thời kì ra nụ hoa đã làm giảm diện tích lá, làm giảm sút cường độ quang hợp của lá, giảm khả năng đậu quả và khối lượng quả chắc, giảm hàm lượng lipit trong hạt lạc [8]. Những quan sát cho thấy, trong điều kiện thí nghiệm gây thiếu nước ở thời kì ra hoa đã làm giảm nghiêm trọng số hoa, đợt rộ không hình thành được, thời gian ra hoa kéo dài, tỉ lệ hoa có ích giảm đi do quá trình thụ phấn bị cản trở [13]. Trong điều kiện nhân tạo, nhiều nghiên cứu tiến hành đánh giá tác động của hạn ở một số giai đoạn phát triển của các đối tượng thực vật khác nhau như mô sẹo, hạt nảy mầm, cây non 3 lá…Trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá tác động của hạn và nâng cao tính chịu hạn ở cây trồng ở mức độ in vitro như ngô [42], lạc [11], [14], lúa [2], khoai tây [67],… Nhiều nghiên cứu đã sử dụng PEG, sorbitol, manitol… như những tác nhân gây khô hạn trong môi trường nuôi cấy nhằm nghiên cứu tác động của hạn lên thực vật. PEG là một hợp chất có ái lực rất lớn với nước, khi đưa vào môi trường nuôi cấy nó không chỉ ngăn cản rễ hút nước mà còn chiếm nước từ rễ cây, khiến cây nhanh chóng rơi vào tình trạng sốc hạn [67]. Như vậy có thể thấy, mức độ ảnh hướng của các yếu tố cức đoan trong đó có hạn đến khả năng phản ứng của cây trồng là rất rõ rệt. Hiện tượng mất nước cục bộ chỉ gây thiệt hại cho một nhóm nhỏ, nhưng hạn hán kéo dài sẽ gây thiệt hại cho nhiều loại cây trồng, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng. Các loài thực vật khác nhau sẽ có khả năng chống chịu khác nhau với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào bản chất di truyền từ bao thế hệ của chúng. Vì vậy, có cây có thể chống chịu được và tồn tại, có cây sẽ bị chết. Ngay trong cùng một loài, các cá thể khác nhau cũng phản ứng ở các mức độ không hoàn toàn như nhau [7]. 1.1.1.3. Tác động của hạn đến cây lạc Cây lạc được trồng trên 35,5 triệu ha ở 82 quốc gia trên thế giới. Hơn một nửa số khu vực sản xuất, chiếm 70% diện tích trồng lạc thuộc vùng khô hạn và bán khô hạn, ở những nơi này cây lạc thường xuyên chịu áp lực hạn hán với thời gian và cường độ khác nhau [50], [79], [92], [104]. Dự kiến giá trị tổn thất hàng năm trong sản xuất lạc tương đương với hơn 520 triệu USD gây ra bởi hạn [39], [40]. Tại Hoa 7 Kỳ, cây lạc đóng góp hơn 4 tỷ USD cho nền kinh tế của đất nước mỗi năm. Tại đây, phần lớn cây lạc được trồng dưới điều kiện nước trời và chỉ có một diện tích hạn chế được tưới tiêu [39]. Ở châu Á và châu Phi, cây lạc được trồng trong điều kiện nước trời trong mùa mưa và bị hạn hán liên tục do lượng mưa ít có thể xảy ra tại bất kỳ thời điểm nào trong chu kỳ sống của cây trồng. [40]. Ở Việt Nam, sản xuất lạc được phân bố ở tất cả các vùng sinh thái nông nghiệp, với khoảng 40% tổng diện tích các cây công nghiệp ngắn ngày [13]. Ảnh hưởng của hạn với cây lạc được thể hiện theo nhiều cách, ảnh hưởng đến cả số lượng và chất lượng của cây trồng. Thâm hụt nước, tùy thuộc vào thời gian xảy ra, có thể là nguyên nhân gây ra hiện tượng giảm đáng kể năng suất lạc bằng cách tác động lên các quá trình sinh lý như cố định đạm, quang hợp, và sự hấp thu canxi cho phát triển vỏ quả [50], [79]. Khi cây lạc gặp hạn sẽ làm mất độ ẩm từ quả dẫn đến làm giảm hoạt động sinh lý của hạt, bên cạnh đó ảnh hưởng của hạn hán còn làm thay đổi chất lượng dinh dưỡng của protein trong hạt lạc [39]. Hạn làm ảnh hưởng đến lipid màng tế bào, các phản ứng quang hợp [92], quá trình trao đổi chất, tăng trưởng và năng suất của cây lạc [39]. Thiếu hụt về độ ẩm làm cản trở quá trình hình thành nốt sần ở các cây họ đậu. Có nhiều bằng chứng cho thấy, quá trình hấp thụ N, P và K của cây lạc bị giảm do hạn hán [39]. Hạn đã ảnh hưởng xấu đến các mối quan hệ về nước, quang hợp, dinh dưỡng khoáng, sự trao đổi chất và tăng trưởng ở lạc. Hạn hán căng thẳng nghiêm trọng làm giảm hàm lượng chất diệp lục a, b và diệp lục tổng số. Sự sụt giảm chất diệp lục là do sự ức chế tổng hợp chất diệp lục. Tích lũy hàm lượng chất khô bị giảm khi tình trạng thiếu nước kéo dài [39], [40], [92]. Căng thẳng về nước thường xuyên dẫn đến thay đổi về giải phẫu học như giảm kích thước của các tế bào và các khoảng gian bào, vách tế bào dày hơn và phát triển hơn của mô biểu bì, giảm kích thước lá và thay đổi trong hệ rễ [40], [92]. Sự thoát ra của các chất hòa tan là kết quả của hiện tượng tổn thương màng tế bào. Đây là một phản ứng thông thường của mô cây lạc dưới ảnh hưởng của một số điều kiện bất lợi từ môi trường như nhiệt độ thấp hoặc cao, độ ẩm của đất thấp hoặc độ mặn của đất cao. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng canxi là yếu tố cần thiết 8 để duy trì tính toàn vẹn của màng. Quá trình bổ sung canxi có ảnh hưởng thuận lợi đến mối quan hệ về nước của cây trồng và khả năng chịu khô hạn trong cây lạc [39], [92]. Thiếu nước trong đất ở giai đoạn hình thành vỏ quả có thể làm giảm sự hấp thu canxi cho phát triển vỏ và gây ra hiện tượng vỏ không dày, hàm lượng canxi thấp trong vỏ và hạt. Dấu hiệu điển hình của sự thiếu hụt canxi trong hạt bao gồm tim rỗng, hư hỏng phôi hoặc phát triển chồi mầm. Hầu như tất cả các quá trình trao đổi chất đều bị ảnh hưởng bởi sự thiếu nước. Hoạt động của các enzyme bị suy giảm do hiện tượng thiếu hụt nước nghiêm trọng gây ra. Phức hệ carbohydrate và protein bị phá hủy bởi các enzyme thành các loại đường đơn giản và các amino acid tương ứng. Proline, một amino acid, được tích lũy mỗi khi thực vật gặp điều kiện bất lợi về độ ẩm. Hàm lượng proline được tích lũy nhiều hơn sau khi cây trồng gặp hạn, do đó hàm lượng này được coi là một chỉ số tốt khi nghiên cứu về cây trồng chịu hạn [39], [40]. Tốc độ tăng trưởng của rễ lạc bị ảnh hưởng bởi độ ẩm của đất. Thiếu hụt về nước kích thích sự tăng trưởng của rễ vào trong đất sâu hơn. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, rễ lạc chiết xuất nước trong đất có hiệu quả ở độ sâu ít nhất là 180 cm trong đất cát mịn. Tất cả những đặc điểm này góp phần làm tăng khả năng tránh bị khô hạn của cây lạc [92]. ng ca hn n phát trin ca cây lc a) Thời kì trước ra hoa Trong mỗi thời kì sinh trưởng cây lạc chỉ có khả năng chịu hạn ở một mức độ nhất định [31]. Biểu hiện bề ngoài khi cây lạc bị hạn ở tất cả các thời kì sinh trưởng rõ rệt nhất là ở bộ lá. Khi độ ẩm đất giảm, lá lạc nhỏ và dày hơn, màu lá từ xanh đậm chuyển dần sang xanh nhạt do diệp lục bị phá huỷ. Ở thời kì trước ra hoa, nhu cầu về nước không cao lắm. Cây lạc chịu được hạn nhất vào thời kì trước ra hoa, bị hạn trong thời gian ngắn ở thời kì này chỉ làm chậm sự phát triển và tốc độ sinh trưởng dễ được khôi phục trở lại nếu được tưới đủ ẩm [13], [62], [79]. b) Trong quá trình ra hoa Những quan sát cho thấy, thời gian bắt đầu ra hoa của cây lạc không bị trì hoãn bởi khô hạn [39]. Tuy nhiên thiếu nước trong thời kì ra hoa làm giảm nghiêm 9 trọng số hoa, đợt rộ không hình thành được, thời gian ra hoa kéo dài, tỉ lệ hoa có ích giảm đi do quá trình thụ phấn bị cản trở. Vì vậy, hạn ở thời kì ra hoa có thể kéo dài thời gian ra hoa – chín của lạc , gây ảnh hưởng đáng kể tới năng suất của lạc [13], [39]. Sự thiếu hụt nước ở thời kì ra nụ hoa đã làm giảm diện tích lá, làm giảm sút cường độ quang hợp của lá, giảm khả năng đậu quả và khối lượng quả chắc, giảm hàm lượng lipit trong hạt lạc [8]. c) Quá trình hình thành quả Cây lạc có thể gặp điều kiện bất lợi về nước trong suốt quá trình đâm tia và phát triển quả [79]. Điều này sẽ dẫn đến làm giảm rõ rệt về năng suất, mức độ giảm phụ thuộc vào từng giống lạc. Không chỉ năng suất lạc mà chất lượng của hạt cũng bị giảm dưới điều kiện hạn hán. Tia không có khả năng thâm nhập hiệu quả vào trong đất khô. Quá trình đâm tia và vùng rễ trong khu vực đất thiếu nước làm giảm tốc độ tăng trưởng của quả và hạt giống xấp xỉ 30% và giảm trọng lượng cho mỗi hạt từ 563 đến 428 mg [39]. Hạn trong giai đoạn hình thành quả và hạt làm giảm năng suất 56-85% [84], [104]. Trong giai đoạn hình thành quả, do diện tích lá đạt cao nhất, tốc độ chất khô tích luỹ cũng cao nên cần lượng nước lớn nhất so với các giai đoạn khác trong thời kì sinh trưởng. Độ ẩm đất có thể giảm đi trong thời kì quả chín (65% - 70%). Độ ẩm quá cao trong thời kì này (trên 90%) thường dẫn đến lốp đổ và dễ làm quả bị thối, nảy mầm [7], [79]. 1.1.2. Cơ chế chịu hạn của thực vật Sự chống chịu hoặc mẫn cảm đối với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào đặc tính của loài, kiểu gen, các giai đoạn phát triển của thực vật. Tính chống chịu là khả năng của thực vật có thể ngăn ngừa được thương tổn khi bị tác động bất lợi từ ngoại cảnh. Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính, làm tăng nhiệt độ cơ thể của cây và gây mất nước trong cây. Tính chịu hạn là khả năng của cây chịu đựng sự đốt nóng và khô [7]. Cơ chế chịu hạn của thực vật rất phức tạp, không chỉ liên quan đến đặc điểm hình thái giải phẫu mà còn liên quan đến những thay đổi thành phần hoá sinh trong tế bào, sự điều chỉnh hoạt động của gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật. Những thực vật tồn tại trên môi trường thiếu nước làm cho chúng bị mất cân 10 bằng về thẩm thấu và các cơ chế bảo vệ của thực vật được khởi động để phản ứng với tình trạng thiếu nước cực đoan [45]. 1.1.2.1. Cơ chế biến đổi hình thái của đặc tính chịu hạn Khả năng chịu hạn của thực vật liên quan đến việc thay đổi toàn bộ cơ thể, mức độ mô, mức độ sinh lý và phân tử. Biểu hiện của một hoặc sự kết hợp của những thay đổi này xác định khả năng cơ thể thực vật duy trì được sự sống dưới điều kiện độ ẩm giới hạn. Những cơ chế bảo vệ của thực vật đã được nhiều nhà nghiên cứu tìm hiểu và phân tích, trong đó cơ chế biến đổi về mặt hình thái trong điều kiện hạn đã được đề cập đến và giải thích [45]. Thực vật có thể phát triển nhanh về mặt hình thái và thúc đẩy quá trình hình thành hạt (cơ chế thoát hạn). Cơ chế này được thể hiện ở việc trưởng thành và ra hoa sớm, thay đổi thời gian sinh trưởng cho phù hợp với giai đoạn thiếu nước. Phát triển những giống có thời gian sinh trưởng ngắn là một chiến lược có hiệu quả cho việc giảm thiểu tổn thất về năng suất cây trồng dưới tác động của hạn, giúp cây trồng tránh được những điều kiện bất lợi của môi trường [45], [75]. Các cơ chế làm giảm sự mất nước từ thực vật như kiểm soát sự thoát hơi nước của khí khổng, hoặc duy trì sự hấp thu nước thông qua một hệ thống rễ tốt (cơ chế tránh hạn) [75], [104]. Sinh khối, mật độ, chiều dài và chiều sâu của rễ là các đặc điểm chính giúp cho việc tránh hạn và ảnh hưởng đến năng suất cây trồng dưới tác động thiếu nước của môi trường [45], [75], [121, [104]. Có hai cơ chế của cây trồng để làm giảm lượng nước mất đi đó là sự thay đổi độ mở của khí khổng và làm giảm lượng bức xạ hấp thụ. Khi cây gặp hạn khí khổng đóng lại, ngăn chặn sự thoát hơi nước ra ngoài. Khi mất nước nhiều, khí khổng không còn khả năng đóng, nước ồ ạt thoát ra ngoài dẫn đến cây héo và chết. Để duy trì cân bằng nước nội bộ có hiệu quả, khí khổng phải đóng chặt và sự mất nước qua tầng biểu bì phải nhỏ [45], [75]. Cơ chế làm giảm lượng nước mất đi bằng cách giảm lượng bức xạ hấp thụ đạt được nhờ hoạt động của lá hoặc sự thay đổi đặc điểm phản xạ của lá. Sự cuộn lá là chuyển động thụ động cũng có tác động làm giảm sự bức xạ. Giảm diện tích bề mặt thoát hơi nước để làm giảm lượng nước mất đi. Các cây trồng chịu hạn thường có số nhánh và số lá ít, diện tích lá giảm. Sự giảm sinh [...]... lập và chuyển vào thực vật nhằm mục đích kích hoạt một lúc nhiều gen có phản ứng với điều kiện cực đoan, làm tăng cường khả năng chịu hạn của cây trồng và tạo ra cây chuyển gen chống chịu tốt 1.2.2 NAC và gen mã hóa NAC liên quan đến tính chịu hạn 1.2.2.1 Nhân tố phiên mã NAC liên quan đến tính chịu hạn Họ NAC là một trong những họ nhân tố phiên mã đặc trưng lớn nhất trong hệ gen thực vật với 106 và. .. DREB1/CBF1, 22 DREB1/CBF2, DREB1/CBF3 dẫn đến cây chuyển gen tăng cường tính kháng hạn, mặn và lạnh [56] Biểu hiện của gen mã hóa DREB2A hoạt hóa sự biểu hiện của nhiều gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn ở thực vật [95] 1.2 CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN 1.2.1 Nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật Sự phản ứng của cơ thể thực vật ở các mức độ khác nhau trước tác động... [112] Rất nhiều gen được phân lập và biểu hiện có mối quan hệ với tính kháng hạn đã được chứng minh như trehalose6-phosphate-synthase (gen TPS) phân lập từ cây bông [66], gen CaAMP1 từ cây tiêu [69], gen TaAIDFFa từ lúa mỳ [126], gen codA từ cây khoai tây [20], gen mã hóa chaperonin từ cây đậu tương [10] … Đã có nhiều công bố nghiên cứu về gen mã hóa cho cystatin và thảo luận về mối liên quan của cystatin... EU755022) Gen AhNAC2 được chuyển thành công vào Arabidopsis Tăng cường khả năng chống chịu với hạn và muối đã được quan sát ở cây Arabidopsis chuyển gen qua phân tích Northern blot và RT-PCR [72] Sau khi phân lập, những gen thuộc họ NAC được thiết kế với các promoter mạnh, đặc hiệu (CaMV35S promoter, rd29A promoter,…) và chuyển thành công vào một số loài thực vật nhờ kỹ thuật chuyển gen Một số nghiên cứu. .. gen liên quan đến khả năng kháng hạn ở thực vật đang rất được quan tâm nghiên cứu Gen NAC (mã hóa cho nhân tố phiên mã NAC) khi được chuyển vào cây không chỉ biểu hiện tính chống chịu lại cùng lúc với nhiều điều kiện bất lợi như hạn, mặn, lạnh mà còn ảnh hưởng tích cực đến sự phát triển và năng suất cây trồng [57] Gen TERF1 điều khiển tổng hợp ethylene responsive factor (ERF) protein đã được chuyển vào... đến việc hoạt hóa các nhân tố phiên mã và tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện gen đích ở giai đoạn phiên mã Trong quá trình này, có thể đồng 19 thời tham gia nhiều gen, tổng hợp cùng một lúc nhiều loại protein điều hòa phiên mã cũng như protein liên quan đến tính chống chịu Hình 1.2 Mô hình hoạt động của gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn [76] Việc tìm kiếm gen liên quan đến khả năng chịu. .. hiện khả năng chịu hạn của cây và sống sót trong môi trường có nồng độ muối cao [48], ngoài ra gen TERF1 cũng đã được phân lập và chuyển gen, giúp cây thuốc lá tăng cường khả năng chống chịu trong điều kiện hạn [130] Gen điều khiển tính chịu hạn DREB (Dehydration responsive element/C repeat) được phân lập từ các cây trồng nhau như đậu tương, súp lơ, cà chua, lúa, lúa mỳ Biểu hiện của gen DREB1/CBF1,... Ramesh và đtg (2007) nghiên cứu Các tác giả đã chứng minh được sự liên quan về chức năng của các protein này với việc phát triển các giống lạc có khả năng chịu hạn Trong nghiên cứu, một số protein liên quan đến sự 18 bất lợi về nước trong kiểu gen cây lạc đã được xác định, đánh giá vai trò của các protein này trong cây lạc để thích nghi với khí hậu và thích ứng với hạn hán [91] 1.1.2.3 Cơ chế phân tử... tơ ở rễ, cài xen vào vùng T-DNA (Transferred-DNA) những gen thích hợp, gen này sẽ được chuyển và 34 gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng Những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A tumefaciens [134] 1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng cƣờng khả năng chịu hạn ở thực vật 1.3.2.1 Hệ thống tái sinh cây và quy trình chuyển gen. .. của gen ERD1 (early responsive to dehydration stress 1) và kết quả là tăng cường khả năng chịu hạn [114] Nhiều thành viên trong họ gen NAC liên quan đến hạn hán đã được mô tả ở lúa SNAC1 được cảm ứng bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp, ABA 32 trong lá và rễ [133] SNAC1 tham gia vào khả năng chống chịu hạn và bảo vệ tế bào ở lúa, kết quả của sự biểu hiện này là làm tăng khả năng chống chịu hạn . năng chịu khô hạn còn chưa được nghiên cứu nhiều. Từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea. năng chuyển gen chỉ thị và tiến tới chuyển gen chịu hạn với mục đích tạo ra dòng cây chuyển gen phục vụ chọn giống chịu hạn ở cây lạc. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu nhằm cải tạo cây lạc và. phiên mã NAC2. Tạo cây chuyển gen và biểu hiện được protein NAC2 ở cây thuốc lá. (3) Tạo được dòng cây lạc chuyển gen. Phân tích các dòng cây lạc chuyển gen. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Phân nhóm