1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG o0o PHẠM HỒNG NGỌC THÙY BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CHITOSANASE KỸ THUẬT TỪ STREPTOMYCES GRISEUS VTCC – A – 1126 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ Sau thu hoạch Mã số: 60.54.10 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Trần Thị Luyến NHA TRANG – 06/2008 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Phạm Hồng Ngọc Thùy 3 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này Trước hết tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc nhất đến cô giáo hướng dẫn: GS.TS. Trần Thị Luyến đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Xin cảm ơn quý thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học cao học. Xin cảm ơn quý thầy cô trong hội đồng bảo vệ đề cương thạc sĩ đã có những ý kiến đóng góp quý báu. Xin cảm ơn Viện công nghệ sinh học và môi trường, phòng thí nghiệm Công nghệ chế biến, phòng thí nghiệm Hóa sinh - Vi sinh, Khoa Chế biến, Đại học Nha Trang. Cảm ơn quý thầy cô trong khoa Chế biến, đặc biệt tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô thuộc bộ môn CN Thực phẩm, ĐH Nha Trang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của các bạn cùng lớp và gia đình đã luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong suốt thời gian vừa qua. ] 4 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về enzyme và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật 3 1.1.1. Tổng quan về enzyme 3 1.1.2. Sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 12 1.2. Tổng quan về chitosanase và khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật 20 1.2.1. Định nghĩa 20 1.2.2. Phân loại enzyme chitosanase 21 1.2.3. Khả năng sinh tổng hợp chitosanase của vi sinh vật 22 1.3. Tổng quan về chitin, chitosan, glucosamine 25 1.4. Giới thiệu về xạ khuẩn và khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase 27 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 33 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 33 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu 34 2.2. Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1. Xác định hoạt tính enzyme chitosanase 34 2.2.2. Xác định hàm lượng đường glucosamine 34 2.2.3. Xác định hàm lượng protein hòa tan 35 2.2.4. Xác định số lượng tế bào 35 2.2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 35 2.2.6. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện ảnh hưởng đến hoạt độ của chitosanase 40 2.2.7. Áp dụng thủy phân chitosan bằng enzyme chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126 41 2.3. Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng 41 2.4. Phương pháp xử lý số liệu 41 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42 3.1. Xác định nguồn cacbon nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC-A-1126 để thu sinh khối tế bào 42 5 3.2. Xác định thời gian thu nhận sinh khối thích hợp 44 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng - chitosan - trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của Streptomyces griseus VTCC- A-1126 45 3.4. Xác định thời gian nuôi sinh chitosanase thích hợp 47 3.5. Ảnh hưởng của loại tác nhân kết tủa đến hoạt độ chitosanase 48 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ (%) aceton đến hoạt độ chitosanase 49 3.7. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ CPE chitosanase 50 3.7.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE chitosanase 50 3.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ CPE chitosanase 52 3.8. Kết quả sử dụng chế phẩm enzyme chitosanase để thủy phân dung dịch chitosan 1% 53 3.9. Quy trình thu chế phẩm chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHẦN PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN GlcN beta-D-Glucosamin 6 GlcNAc hoặc NAG N-acetyl-beta-D-glucosamin pH opt pH thích hợp t opt nhiệt độ thích hợp VSV vi sinh vật PL phụ lục CPE: Chế phẩm enzyme là chế phẩm thu được từ quá trình kết tủa chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 ra khỏi dịch chiết enzyme. 7 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU TT TÊN BẢNG TRANG 1 Bảng 3.1. Số lượng khuẩn lạc của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 1-PL 2 Bảng 3.2. Khối lượng tế bào trong các môi trường có nguồn carbon khác nhau 1-PL 3 Bảng 3.3. Số lượng khuẩn lạc của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 theo thời gian nuôi cấy 1-PL 4 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng - chitosan - trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 2-PL 5 Bảng 3.5. Hoạt độ chitosanase theo thời gian nuôi 2-PL 6 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của loại tác nhân kết tủa đến hoạt độ chitosanase 2-PL 7 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ (%) aceton đến hoạt độ chitosanase 3-PL 8 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE chitosanase 3-PL 9 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ CPE chitosanase 3-PL 11 Bảng 3.10. Sự giảm độ nhớt của dung dịch chitosan 1% theo thời gian thủy phân 4-PL 8 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TT TÊN HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRANG 1 Hình 1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ phản ứng enzyme 7 2 Hình 1.2. Ảnh hưởng của pH tới tốc độ phản ứng 8 3 Hình 1.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới tốc độ phản ứng 8 4 Hình 1.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới tốc độ phản ứng 9 5 Hình 1.5. Xác định K m và K bằng phương pháp của Lineaweaver và Berk 9 6 Hình 1.6. Cấu trúc không gian của chitosanase từ Streptomyces sp. N174 20 7 Hình 1.7. Cấu trúc của chitosanase từ Bacillus circulans MH-K1 và chitosanase từ Streptomyces sp. N174 23 8 Hình 1.8. Sự phát triển của khuẩn ti ở xạ khuẩn 29 9 Hình 1.9.Các loại khuẩn ti ở xạ khuẩn 29 10 Hình 1.10. Một số dạng bào tử ở xạ khuẩn 29 11 Hình 1.11. Sự hình thành chuỗi bào tử dài ở xạ khuẩn chi Streptomyces (A, B, C, D) và chi Nocardiopsis (E) 30 12 Hình 2.1. Streptomyces griseus VTCC-A-1126 33 13 Hình 2.2. Streptomyces griseus VTCC-A-1126 được nhuộm xanh mêtylen 33 14 Hình 2.3. Streptomyces griseus VTCC-A-1126 được nhuộm Gram 33 15 Hình 3.1. Số lượng khuẩn lạc của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 trong các môi trường có nguồn cacbon khác nhau 42 16 Hình 3.2. Khối lượng tế bào trong các môi trường có nguồn cacbon khác nhau 42 17 Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 theo thời gian nuôi cấy tĩnh 44 18 Hình 3.4a. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng - chitosan - trong môi trường nuôi cấy đến tổng hoạt độ chitosanase 45 19 Hình 3.4b. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng - chitosan - trong 46 9 môi trường nuôi cấy đến hoạt độ riêng chitosanase 20 Hình 3.5a. Tổng hoạt độ chitosanase theo thời gian nuôi 47 21 Hình 3.5b. Hoạt độ riêng chitosanase theo thời gian nuôi 47 22 Hình 3.6. Ảnh hưởng của loại tác nhân kết tủa đến hoạt đ ộ chitosanase 48 23 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ (%) aceton đến hoạt độ chit osanase 49 24 Hình 3.8a. Dịch enzyme chitosanase sau khi ly tâm loại tế bào 50 25 Hình 3.8b. Dịch enzyme chitosanase sau khi kết tủa bằng aceton 75% 50 26 Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE chitosanase 50 27 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ CPE chitosanase 52 28 Hình 3.11. Sự giảm độ nhớt của dung dịch chitosan 1% theo thời gian thủy phân 54 10 MỞ ĐẦU Chitin, chitosan là polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên. Trong động vật thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiếm tỷ lệ khá cao, từ 14-35% so với trọng lượng chất khô. Chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như trong nông nghiệp, trong công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y – dược, Do đó, việc nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu. COS (Chitin/Chitosan - Olygosaccharide) là sản phẩm thủy phân của chitin, chitosan, chúng là những chất có hoạt tính sinh học cao. Chúng có tác dụng điều hòa lượng cholesterol, điều hòa áp suất trong máu, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, thúc đẩy quá trình bài tiết axit uric, chống ung thư, trị được bệnh viêm loét dạ dày, chuột rút và có khả năng làm tăng sức đề kháng cho cây trồng. Do vậy, chúng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như Y-dược, Nông nghiệp, Công nghệ Thực phẩm, Hiện nay, tại Đại học Nha Trang GS.TS. Trần Thị Luyến và các cộng sự đã nghiên cứu sản xuất COS bằng phương pháp hóa học (thủy phân chitin, chitosan bằng axit HCl đậm đặc) hoặc thu COS bằng phương pháp sinh học (dùng các enzyme như papain, hemicellulase, cellulase để thủy phân chitin, chitosan) [10], [15], [20]. Việc thủy phân chitin, chitosan bằng axit đậm đặc có nhiều nhược điểm như chi phí tốn kém, hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường, hao mòn máy móc thiết bị và sản phẩm có hoạt tính không cao. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất COS bằng phương pháp sinh học là một hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, ít gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm có chất lượng tốt. Vì vậy đề tài "Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126" là cần thiết, CPE chitosanase này được sử dụng thay thế cho axit HCl đậm đặc để thủy phân chitosan thu COS có chất lượng tốt, đồng thời hạn chế ô nhiễm môi trường và hao mòn máy móc thiết bị. Mục đích của luận văn: Bước đầu nghiên cứu các điều kiện thích hợp để thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126. [...]... ngh a c a Ủy ban về enzyme thu c họ enzyme thủy phân glycoside 46 - Họ enzyme thủy phân glycoside 75: Gồm 4 loại enzyme chitosanase k á tương đồng với nhau: chitosanase từ h Nectria haematococca var Brevicona, chitosanase từ Aspergillus oryzae, chitosanase từ Aspergillus fumigatus và chitosanase từ Metarhizium anisopliae 31 - Họ enzyme thủy phân glycoside 80: Một loại enzyme chitosanase mới từ Matsuebacter... Vào năm 1999, Jae Kweon Park, Kumiko Shimono, Nobuhisa Ochiai, Kazutaka Shigeru, Masako Kurita, Yukari Ohta, Katsunori Tanaka, Hideyuki Matsuda, và Makoto Kawamukai thu c Bộ môn Khoa học đời sống và Công nghệ sinh học, Khoa Khoa học môi trường và đời sống, Đại học Shimane, Nhật Bản đã tinh sạch và phân tích gen c a enzyme chitosanase ngoại bào từ vi khuẩn gram âm Matsuebacter chitosanotabidus 3001 Giá... GlcN-GlcN Ví dụ: chitosanase từ Bacillus sp no 7-M - Loại III: có thể phân cắt cả liên kết GlcN-GlcN và GlcN-GlcNAc Ví dụ: chitosanase từ Bacillus circulans MH-K1, chitosanase từ Streptomyces griseus HUT 6037, chitosanase từ Nocardia orientalis, chitosanase từ Bacillus circulans WL-12  D a vào trình tự sắp xếp, chitosanase gồm 5 họ enzyme thủy phân glycoside: 5, 8, 46, 75, 80 - Họ enzyme thủy phân... Yatsunami, Y Sakihama, Mamie Suzuki, Tesuya uri t Fukazawa, Shinji Shimizu, Tomoko Sunami, Kimiko Endo, Akio Takenaka và Satoshi Nakamura ở Viện Kỹ thu t Tokyo, Midori-ku, Yokohama, Nhật Bản đã phát hiện ra gen mã h a một loại chitosanase mới từ Bacillus sp chủng K17 Trật tự nucleotide c a gen tương ứng với một protein có 453 amino acid Trật tự các amino acid c a chủng K17 có tính tương đồng cao với họ enzyme. .. oryzae, Aspergillus , fumigatus Metarhizium , anisopliae Cụ thể là: Năm 1996, Anthony L Tarentino và Frank Maley đã tinh sạch và nghiên cứu các đặc tính c a enzyme Endo--N-acetylglucosaminidase từ Streptomyces griseus Năm 1997, Masaru Mitsutomi thu c Bộ môn Khoa học sinh học ứn dụng, g Khoa Nông nghiệp, Đại học Saga, Nhật Bản đã nghiên cứu tinh sạch chitosanase từ Streptomyces griseus HUT 6037 Streptomyces. .. thu nhận ì enzyme chitosanase kỹ thu t từ Streptomyces griseus VTCC- A- 1126 - Từ enzyme chitosanase này có thể được dùng để sản xuất COS bằng phương pháp sinh học - Làm phong phú thêm nguồn tài liệu khoa học về lĩnh vực nghiên cứu enzyme từ VSV nói chung và enzyme chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC- A- 1126nói riêng, bổ sung vào tài liệu phục vụ giảng dạy và nghiên cứu 12 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU... ARNvc, một ARNvc nào đó sẽ vận chuyển nhiều lần các axit amin cùng loại Giai đoạn này được thực hiện bởi 2 phản ứng cùng xúc tác bởi một enzyme đặc hiệu Aminoaxit-ARNvc Syntertase Trong quá trình có sự tham gia c a hợp chất giàu năng lượng ATP và Mg++ 24 Enzyme Axit amin + ATP _ P [Aminoaxil~AMP -enzyme] P [Aminoaxil~AMP -enzyme] + ARNvc Aminoaxil~ARNvc AMP Enzyme Trong phức hợp Aminoaxil - ARNvc, axit... dung nghiên cứu c a luận văn: - Nghiên cứu một số điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC- A- 1126 - Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme kỹ thu t từ Streptomyces griseus VTCC- A- 1126 - Xác định một số đặc tính c a enzyme này (nhiệt độ thích hợp, pH thích hợp) Ý ngh a khoa học và tính thực tiễn c a luận văn - Đ a ra được các điều kiện thích hợp cho quá trnh nuôi cấy và thu nhận. .. trúc không gian c a chitosanase từ Streptomyces sp N174 [24] 30 1.2.2 Phân loại enzyme chitosanase  D a vào vị trí phân cắt đặc trưng trên phân tử chitosan, chitosanase từ vi sinh vật được chia thành 3 loại: - Loại I: có thể phân cắt liên kết GlcN-GlcN và GlcNAc-GlcN Ví dụ: chitosanase từ Streptomyces sp N174, chitosanase từ Bacillus pumilus BN-262, chitosanase từ Penicillium islandicum - Loại II:... có cellulases, licheninases and endo-xylanases Loại chitosanase được mô tả tốt nhất từ họ n là enzyme từ Bacillus sp No.7M, là loại ày chitosanase thủy phân giới hạn liên kết GlcN-GlcN Các loại chitosanase khác được nghiên cứu sâu thu c họ này được sản sinh từ Bacillus circulans WL-12 Paenibacillus fukuinensis chủng D2 - Họ enzyme thủy phân glycoside 46: Các enzyme chitosanase này được nghiên cứu nhiều . BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CHITOSANASE KỸ THU T TỪ STREPTOMYCES GRISEUS VTCC – A – 1126 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THU T Chuyên ngành: Công nghệ Sau thu hoạch. trường và sản phẩm có chất lượng tốt. Vì vậy đề tài " ;Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thu t từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126& quot; là cần thiết, CPE chitosanase. chitosanase kỹ thu t từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126. 11 Nội dung nghiên cứu của luận văn: - Nghiên cứu một số điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC-A-1126.