i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang đã tạo một môi trường học tập và cơ hội quý báu cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo của Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình dìu dắt, dạy bảo tôi trong suốt khóa học 2007 – 2011. Đặc biệt, để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của:  TS. Nguyễn Văn Duy, thầy Lê Đình Đức đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn cho tôi.  Chị Nguyễn Minh Nhật – Cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm luận văn tại phòng thí nghiệm.  Chị Lưu Thị Thúy học viên cao học và các bạn trong nhóm sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học của khóa 49, 50 Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, đã giúp đỡ cho tôi. Các bạn lớp 49 SH – những người bạn đồng hành luôn bên cạnh và giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học tập và sống tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó! Cuối cùng, gia đình và người thân luôn là những người tôi khắc ghi sự biết ơn vô hạn vì công lao sinh thành, nuôi dưỡng, và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi. Nha Trang, tháng 07 năm 2011 Sinh viên thực hiện Hoàng Thị Giang ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1 Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Vi khuẩn lactic 3 1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 3 1.1.2. Phân loại lactic 3 1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic 5 1.1.4. Vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 6 1.2. Cá giò và các phương pháp bảo quản cá giò 8 1.2.1. Đặc điểm chung về cá giò 8 1.2.2. Các phương pháp bảo quản cá giò 9 1.3. Tình hình nghiên cứu về sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic trong thực phẩm 14 1.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước 14 1.3.2.Những nghiên cứu trong nước 16 Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Vật liệu 18 2.1.1. Vi sinh vật 18 iii 2.1.2. Nguyên liệu cá giò 19 2.1.3. Hóa chất và môi trường 19 2.1.4. Thiết bị chuyên dụng 21 2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Xác định khả năng sinh trưởng 21 2.2.2. Xác định hoạt tính sinh bacteriocin 22 2.2.3. Thí nghiệm nhúng da cá giò trong dịch tế bào vi khuẩn lactic 22 2.2.4. Thí nghiệm bảo quản cá giò nguyên liệu tươi nguyên con bằng dịch tế bào vi khuẩn lactic kết hợp bảo quản lạnh 24 2.2.5. Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí 24 2.2.6. Xác định tổng vi khuẩn lactic 26 Chương III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8 27 3.1. Tổng số vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu tươi 31 3.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò nguyên liệu tươi 33 3.4. Tổng số vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 36 3.5. Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 iv BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Stt Ký hiệu Nghĩa 1 CFU Colony forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) 2 LAB Lactic acid bacteria (Vi khuẩn lactic) 3 MRS de Man, Rogosa and Shatpe (Môi trường nuôi cấy LactoBacillus) 4 PCA Plate Count Agar (Môi trường nuôi cấy vi khuẩn tổng số) 5 OD Optical Density (Mật độ quang) 6 TSA Trypton soy agar (Môi trường rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số) 7 TSB Trypton soy broth (Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn tổng số) v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Thành phần môi trường MRS 20 Bảng 2. Thành phần môi trường TSB 20 Bảng 3. Khả năng sinh trưởng, đường kính vòng kháng khuẩn, hoạt độ riêng của chủng T8 trên môi trường MRS 29 Bảng 4. Sự phát triển của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò 31 Bảng 5. Sự phát triển tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò 33 Bảng 6. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 36 Bảng 7. Khả năng sinh bacteriocin của tổng vi khuẩn lactic 36 Bảng 8. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 42 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Vi khuẩn lactic T8 nuôi trên môi trường MRS sau 48 giờ ở nhiệt độ 37 0 C. 18 Hình 2. Vi khuẩn Bacillus trên môi trường TSA sau 24 giờ nuôi ở nhiệt độ 37 0 C 19 Hình 3. Cá giò nguyên liệu tươi 19 Hình 4. Mặt ngoài da cá 23 Hình 5. Mặt trong da cá 23 Hình 6. Mẫu 1: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 cho vào túi PE 23 Hình 7. Mẫu 2: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic không cho vào túi PE 24 Hình 8. Mẫu 3: Mẫu đối chứng 24 Hình 9. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 6 -18 giờ nuôi 27 Hình 10. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 15 - 19 giờ nuôi 28 Hình 11. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 12 - 24 giờ nuôi 28 Hình 12. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 12 - 27 giờ nuôi 29 Hình 13. Đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8 30 Hình 14. Vi khuẩn lactic trên môi trường thạch MRS, nuôi ở nhiệt độ 37 0 C sau 48 giờ nuôi cấy 31 Hình 15. Sự phát triển của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò 32 Hình 16. Sự phát triển tổng vi sinh vật hiếu khí trên da cá giò 33 Hình 17. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên môi trường PCA sau 48 giờ 34 Hình 18. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 36 Hình 19. Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic ở mẫu 1 37 Hình 20. Khả năng kháng Bacillus của vi khuẩn lactic T8 theo thời gian bảo quản 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày 37 vii Hình 21. Vi khuẩn lactic T8 sau 3 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 39 Hình 22. Vi khuẩn lactic T8 sau 5 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 40 Hình 23. Vi khuẩn lactic T8 sau 7 ngày bảo quản ở mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 40 Hình 24. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 41 Hình 25. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 lúc 0 ngày 43 Hình 26. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 lúc 3 ngày 44 Hình 27. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 lúc 5 ngày 45 Hình 28. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 lúc 5 ngày và 7 ngày 46 1 LỜI MỞ ĐẦU Nuôi trồng thủy sản thủy sản trước kia vốn chỉ góp phần nhỏ bé trong tổng sản lượng thủy sản toàn cầu, tuy nhiên từ những năm 1950 đến năm 2008 đã tăng 50 lần và hiện nay chiếm gần 50% trong tổng sản lượng sản xuất trên toàn thế giới. Ở Việt Nam, diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng: năm 2004 đạt 1,4 triệu tấn, chiếm 68% tổng sản lượng thủy sản, năm 2010 sản lượng thủy sản đạt 2706,8 nghìn tấn bằng 105,4% so với cùng kỳ năm 2009 và 102,1% so với kế hoạch năm 2010. Kỳ vọng năm 2011, theo kế hoạch nghành thủy sản phấn đấu mức tăng trưởng chung là 7% so với năm 2010. Tổng sản lượng năm 2011 phấn đấu đạt khoảng 5,3 triệu tấn, trong đó khai thác là 2,3 triệu tấn và nuôi trồng là 3 triệu tấn. Mặc dù, nghành nuôi trồng đạt được nhiều kết quả nhưng nó đang đối mặt với những thách thức về môi trường nuôi, dịch bệnh, công nghệ sau thu hoạch… Nguyên liệu thủy sản nói chung là loại nguyên liệu dễ bị hư hỏng nếu không được bảo quản hợp lý. Hiện nay, các loại nguyên liệu sau đánh bắt và thu hoạch của người dân chủ yếu bảo quản bằng phương pháp ướp đá lạnh. Ngoài ra, để giữ nguyên liệu thủy sản tươi lâu người dân sử dụng các loại hóa chất độc hại như ure, borit, nitrat, hàn the, chất kháng sinh để bảo quản. Những chất bảo quản này nếu sử dụng không hợp lý sẽ gây nên tình trạng mất an toàn thực phẩm, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng. Do đó, việc sử dụng hóa chất để bảo quản nguyên liệu ít được sử dụng và một số chất bảo quản độc hại bị cấm. Yêu cầu đặt ra phải tìm được phương pháp bảo quản nguyên liệu an toàn và kinh tế. Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu thay thế những chất bảo quản hóa học bằng phương pháp sinh học an toàn hơn cho người sử dụng và người tiêu dùng. Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính: ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng, gây thối nguyên liệu, an toàn cho người tiêu dùng. Một trong những nhóm vi khuẩn có những đặc tính này là vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic được công nhận là an toàn để sử dụng, nó được sử dụng trong quá trình bảo quản như lên 2 men dưa chua, nem chua, sữa chua…vì trong quá trình sống vi khuẩn lactic ngoài việc sinh bacteriocin còn sinh acid lactic là tác nhân ức chế nhiều vi sinh vật. Cá giò (Rachycentron canadum) hay còn gọi là cá bớp (Cobia/Black King fish) là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao nên nó được nuôi phổ biến trong lồng bè ở các vùng biển tại các địa phương như: Hải Phòng, Nghệ An, Quảng Ninh, Vũng Tàu, Huế, Phú Yên, Khánh Hoà, Kiên Giang. Hiện nay, cá giò được tiêu thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài ở dạng cá tươi hoặc chế biến đông lạnh. Trên thị trường, sự chênh lệch giữa cá giò tươi và cá giò ươn lớn có thể tới 60.000đ/kg. Do đó việc nghiên cứu bảo quản cá giò có ý nghĩa kinh tế cao. Sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật liên quan chặt chẽ với các điều kiện bên ngoài, môi trường nuôi cấy. Đa số mỗi sinh vật có môi trường nuôi cấy đặc hiệu, MRS là môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic nói chung, ở đó vi khuẩn lactic sinh trưởng và phát triển tốt nhưng khi ứng dụng vi khuẩn này bảo quản nguyên liệu thủy sản như cá giò thì sao? Để trả lời cho câu hỏi đó chúng tôi tiến hành đề tài “Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên liệu tươi”. Mục tiêu của đề tài: - Xác định khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS. - Xác định khả năng sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS. - Xác định khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên cá giò nguyên liệu tươi. 3 Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn lactic 1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, bất động, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường thành acid lactic. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaccae. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau như: trực khuẩn hoặc cầu khuẩn. Cầu khuẩn xếp các giống Streptococcus và Leuconostoc, còn trực khuẩn thành một giống Lactobacillus. MRS là môi trường để phân lập và nuôi cấy chủng lactic. Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng, có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem, đôi khi khuẩn lạc có màu trắng đục, tròn lồi. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí, vi hiếu khí. Vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất dinh dưỡng phức tạp, không một đại diện nào của nhóm này có thể phát triển trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose. Đa số chúng cần các loại vitamin như: Lactoflavin, tiamin, pantotenic acid, folic acid, và các amino acid… Các vi khuẩn lactic lên men được đường monno và disaccharide nhưng không lên men được tinh bột và các polysaccharide khác, ngoại trừ L.delbrueckiin đồng hóa được tinh bột. Đa số vi khuẩn lên men lactic dị hình có khả năng sử dụng pentose và acid citric, một số có hoạt tính protease (Lương Đức Phẩm, 2002). 1.1.2. Phân loại lactic Dựa vào khả năng lên men lactic từ các nguyên liệu chứa đường, người ta chia thành hai nhóm vi khuẩn lactic: vi khuẩn lactic dị hình và vi khuẩn lactic đồng hình.  Vi khuẩn lactic lên men đồng hình Vi khuẩn lactic đồng hình là những vi khuẩn trong tế bào của chúng chứa enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase. Khi lên men các loại đường chúng sinh ra chủ yếu là acid lactic. Vi khuẩn lactic lên men đồng hình như: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casein, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum [...]... về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thủy sản, thực phẩm còn hạn chế 18 Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vi sinh vật  Vi khuẩn lactic Hình 1 Vi khuẩn lactic T8 nuôi trên môi trường MRS sau 48 giờ ở nhiệt độ 370C Chủng vi khuẩn lactic T8 sinh bacteriocin phân lập từ nước dưa cải được lấy từ bộ sưu tập chủng vi sinh vật của Vi n Công nghệ sinh học và Môi trường, ... Thí nghiệm nhúng da cá giò trong dịch tế bào vi khuẩn lactic Sau khi xây dựng được đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa khả năng sinh trưởng, hoạt tính sinh bacteriocin và hoạt độ riêng của chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS chúng tôi tiến hành xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn 23 đó trên da cá giò Hoạt hóa chủng lactic sinh bacteriocin dựa vào đồ thị để thu dịch nhúng da cá Lấy dịch ở giai... 3.1 Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8 Hình 9 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 6 18 giờ nuôi 28 Hình 10 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 15 - 19 giờ nuôi Hình 11 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 12 - 24 giờ nuôi 29 Hình 12 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối... nay, cá giò được tiêu thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài ở dạng cá tươi hoặc chế biến đông lạnh Trên thị trường, sự chênh lệch giữa cá giò tươi và cá giò ươn lớn có thể tới 60.000 đ/kg Do đó vi c nghiên cứu phòng và chữa bệnh cũng như bảo quản cá giò có ý nghĩa kinh tế cao 1.2.2 Các phương pháp bảo quản cá giò Nguyên liệu thủy sản nói chung và cá giò rất dễ bị biến chất và. .. thành phần thực phẩm cũng như hệ vi sinh vật của thực phẩm Sự phát triển gần đây trong lĩnh vực vi sinh vật phân tử, đồng thời những nghiên cứu về sinh học phân tử của bộ gen vi khuẩn có thể tiết lộ các nguồn sinh bacteriocin mới (Gálvez và cs, 2007) 1.2 Cá giò và các phương pháp bảo quản cá giò 1.2.1 Đặc điểm chung về cá giò Cá giò (Rachycentron canadum) hay còn gọi là cá bớp (Cobia/Black King fish)... nhất trong phòng thí nghiệm  Vitamin Hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Vitamin B6 là vitamin rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp các amino acid ở vi khuẩn lactic  Muối khoáng Các chất khoáng có vai trò quan trọng trong qua trình trao đổi chất ở vi sinh vật Các chất khoáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy có thể là những... loài vi khuẩn Gram (-) bị ức chế bởi bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn Gram (+) Những vi khuẩn Gram (+) sinh bacteriocin có khả năng ức chế vi khuẩn Gram (-) như: Lactobacillus, Bacillus crecus, Streptococci, Staphylococci Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram (+) có hoạt tính ức chế các loại vi khuẩn Gram (+) Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi sinh vật khác do sự tạo thành các... cá Hình 6 Mẫu 1: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 cho vào túi PE 24 Hình 7 Mẫu 2: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic không cho vào túi PE Hình 8 Mẫu 3: Mẫu đối chứng 2.2.4 Thí nghiệm bảo quản cá giò nguyên liệu tươi nguyên con bằng dịch tế bào vi khuẩn lactic kết hợp bảo quản lạnh Tiến hành tương tự như thí nghiệm nhúng da cá nhưng ở đây chúng tôi nhúng cá nguyên con vào dịch tế bào vi khuẩn. .. tập chủng vi sinh vật của Vi n Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang Chủng vi khuẩn lactic T8 sinh bacteriocin được nuôi trên môi trường lỏng MRS (bảng 1), trong tủ ấm 37oC Chúng tôi đã bảo quản giống lactic trên môi trường thạch nghiêng MRS và trong glycerol Bảo quản vi khuẩn lactic trên môi trường thạch nghiêng MRS, các ống được bảo quản ở nhiệt độ 4 - 6oC Định kỳ cấy truyền giống,... / 30 µl, các ống được giữ ở 700C  Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus phân lập từ mẫu tôm sú được lấy từ bộ sưu tập chủng vi sinh vật của Vi n Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang Sau khi có chủng gốc, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus trên môi trường lỏng TSB (bảng 2) ở nhiệt độ 28 - 300C, lắc 200 vòng/phút Bảo quản 19 giống Bacillus trên môi trường thạch . Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên liệu tươi . Mục tiêu của đề tài: - Xác định khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic. tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò 33 Bảng 6. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 36 Bảng 7. Khả năng sinh bacteriocin của tổng vi khuẩn lactic 36 Bảng 8. Tổng vi khuẩn. trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8 27 3.1. Tổng số vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu tươi 31 3.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò nguyên liệu tươi 33 3.4.