z TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CHẾ BIẾN  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI SINH VẬT BIỂN SINH ENZYM CÓ KHẢ NĂNG CẮT MẠCH FUCOIDAN Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. NGÔ ĐĂNG NGHĨA TS. TRẦN THỊ THANH VÂN Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN HÀ VY Lớp: 48 CNSH NHA TRANG, NĂM 2010 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy i LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa- giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và TS. Trần Thị Thanh Vân- trưởng phòng hóa phân tích và triển khai công nghệ Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn toàn thể ban lãnh đạo, các cán bộ của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ và giúp đỡ tôi để tôi có đủ điều kiện thực hiện đồ án. Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, phòng đào tạo Đại học và sau Đại học cùng các thầy cô Trường đại học Nha Trang đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm đồ án. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, chia sẻ những khó khăn, động viên để tôi hoàn thành đồ án này. Trần Nguyễn Hà Vy Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 5 1.1. Tổng quan về rong biển 5 1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển 5 1.1.2. Phân loại rong biển 6 1.1.3. Phân bố và ứng dụng rong Nâu trên thế giới 6 1.1.4. Rong Mơ Việt Nam 7 1.2. Tổng quan về enzyme 8 1.2.1. Khái niệm chung về enzyme 8 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 9 1.2.3. Tính chất của enzyme 11 1.3. Giới thiệu về Fucoidan 14 1.3.1. Fucoidan 14 1.3.2. Hoạt tính sinh học của Fucoidan 16 1.3.3. Ứng dụng của fucoidan và oligosacharit của nó 19 1.3.3.1. Một số ứng dụng của Fucoidan tự nhiên 19 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy iii 1.3.3.2. Một số ứng dụng của oligosaccharit từ một fucoidan 20 1.3.3.3. Một số sản phẩm Fucoidan trên thế giới 20 1.4. Enzyme có khả năng phân cắt fucoidan 21 1.4.1. Enzyme fucoidanase 21 1.4.2. Một số nghiên cứu về fucoidanase trên đối tượng vi sinh vật 21 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1. Chủng giống 23 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật 23 2.2.2. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật 25 2.2.3. Thử nghiệm họat tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan 26 2.2.4. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan 28 2.2.4.1. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào 28 2.2.4.2. Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme 28 2.2.4.3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme 28 2.2.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên họat tính enzyme 28 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật biển theo định hƣớng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan 29 3.2. Sàng lọc vi sinh vật biển theo định hƣớng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan 32 3.3. Khảo sát điều kiện tách chiết enzyme 35 3.3.1. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào 35 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy iv 3.3.2. Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạtt tính enzyme 36 3.3.3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme 36 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 38 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1. Kết luận 40 4.2. Kiến nghị 41 PHỤ LỤC 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số ứng dụng của fucoidan chiết từ rong nâu. 19 Bảng 1.2: Ứng dụng của ologosacarit từ fucoidan. 20 Bảng 1.3: Vi sinh vật biển và enzym của chúng 22 Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan 23 Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn biển đã phân lập được. 30 Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme khi lên mem vi sinh vật trên môi trường lỏng chứa fucoidan từ rong S. mcclurei 33 Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme khi ly tâm với tốc độ khác nhau. 35 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme. 36 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme. 37 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme. 38 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Một số loài rong có chứa fucoidan. 15 Hình 1.2: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus 16 Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi sinh vật biển. 24 Hình 2.2: Xử lý mẫu rong trước khi phân lập. 25 Hình 2.3: Sơ đồ nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi sinh vật. 26 Hình 2.4: Đường chuẩn fucose. 27 Hình 3.1: Lên men vi sinh vật để tạo enzym fucoidanase 32 Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme. 37 Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme. 38 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy vii BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT AMPA α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate DNA Deoxyribonucleic acid Ex Extract Fuc Fucose Gal Galactose HGF Human Hepatocyte Growth Factor HIV Human immunodeficiency virus IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry CE Control enzym CS Control substrate Man Mannose NITRA Nha Trang Institute of Technology Rearcher and Application Rha Rhamnose RNA Ribonucleic acid Xyl Xylose Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Viện CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy 1 MỞ ĐẦU Với hơn 3200 km chiều dài bờ biển, nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, Việt Nam có hệ sinh thái động-thực vật thủy sinh là vô cùng đa dạng và phong phú. Trong đó hệ thực vật tảo biển chiếm một lượng sinh khối lớn với khoảng 1000 loài được dự đoán, 639 loài đã xác định bao gồm 151 loài rong lục, 269 loài rong đỏ, 143 loài rong nâu và 76 loài rong lam [13]. Ngay từ xa xưa nhiều loài rong tảo đã được con người sử dụng làm thức ăn cho người và gia súc, một số nước tại vùng biển Châu Á, Châu Mỹ một số loài rong còn được sử dụng để làm thuốc. Câu chuyện về tỉ lệ người chết thấp và tỉ lệ người cao tuổi sống khỏe mạnh (trên 100 tuổi) khác thường ở đảo Tonga (Nam Thái Bình Dương) vẫn hấp dẫn các nhà khoa học khi những người dân đảo này cho biết họ sống được như vậy là nhờ rong nâu, loài thực vật mà họ đã thu hoạch và sử dụng hơn 3000 năm nay. Người Tonga tin rằng rong nâu chính là nguồn dược liệu giúp họ tăng tuổi thọ, sức khỏe và sinh lực. Vì một trong những lí do này mà các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu vào đối tượng rong nâu và tìm ra được rất nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như là kháng khuẩn, kháng khối u, tăng cường khả năng miễn dịch Đăc biệt là fucoidan được tìm thấy trong rong nâu là chất có rất nhiều hoạt tính sinh học quý giá. Ngoài fucoidan trong rong nâu còn có nhiều hợp chất có giá trị kinh tế như: laminaran, mannitol, gibberelin, cytokinin, auxin, iod, khoáng, axit béo … và nhiều loại vitamin. Việt Nam có hơn 120 loài rong nâu với sản lượng ước tính trên 10000 tấn khô/năm, nhưng đa số người dân thường thu hoạch rong này để làm phân bón và thức ăn chăn nuôi. Thấy được tiềm năng này Viện Nghiên Cứu và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang đã triển khai nghiên cứu và sản xuất thành công fucoidan là một hướng nghiên cứu thiết yếu cho khoa học và có giá trị thực tiễn [1],[2]. Fucoidan, một sulphat polysaccharide sinh học được chiết từ rong nâu, đặc biệt được quan tâm nghiên cứu nhờ nhiều hoạt tính dược lý đặc biệt như chống đông tụ, chống viêm nhiễm, điều tiết miễn dịch, ức chế sự phát triển ư bướu, kháng Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m [...]... đồ án tốt nghiệp này tôi chọn đề tài nghiên cứu là Phân lập và sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan Nội dung luận văn bao gồm:  Phân lập vi sinh vật biển theo định hướng phân cắt fucoidan  Sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme cắt mạch fucoidan  Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme fucoidanase Vi n CNSH & MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy d o m o o c... tâm đến enzyme cắt mạch fucoidan có nguồn gốc vi sinh vật là vì các lí do sau: thứ nhất tốc độ sinh trưởng và sinh sản của vi sinh vật rất nhanh, enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất cao, thứ hai có thể kiểm soát được điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật sinh tổng hợp các chất theo định hướng của chúng ta, thứ ba nuôi cấy vi sinh vật ta có thể thu toàn bộ sinh khối vi sinh một cách dễ dàng và ít tốn... các nhà khoa học Nhật Bản [9],[10] đã phân lập được vi khuẩn có khả năng cắt mạch fucoidan từ trầm tích biển và nước biển Trong vài thập kỉ trở lại đây có nhiều nghiên cứu thú vị về enzyme fucoidanase phân lập từ vi sinh vật biển được công bố Chẳng hạn, Sakai và cộng sự [43],[44] đã phân lập từ biển Nhật Bản vi khuẩn Flavobateriacea có thể phân cắt nhiều loại fucoidan khác nhau được chiết từ các loài... japonica có các chức năng kháng loại vi rút RNA và DNA Vai trò của Sulphat thì cần thiết cho hoạt tính kháng virut Hơn nữa, fucoidan còn có các hoạt tính ức chế chống lại sự sao chép vỏ ngoài một số vi rút quan trọng như HIV và HCMV [40]  Hoạt tính kháng khuẩn Fucoidan có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, fucoidan cũng có khả năng ngăn chặn loại vi m màng... trường nước biển vô trùng (2g pepton/1 l); (b) Mẫu rong biển sau một tháng, tán rong đã bị phân hủy 2.2.2 Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật Chủng vi sinh vật đã phân lập được tiến hành nuôi cấy lắc (150 vòng/ phút, ở nhiệt độ 28-300C, trong 24h), trong môi trường muối khoáng có bổ sung fucoidan sạch (được chiết từ rong S mcclurei) như là chất cảm ứng vi sinh vật sản xuất enzyme cắt mạch fucoidan. .. tính sinh học nhiều triển vọng, trong đó bao gồm các enzyme quý hếm Khi bị phân hủy rong sẽ trở thành đối tượng tấn công của các vi sinh vật mà hệ enzyme của chúng có khả năng bẻ ngắn mạch polysaccharide về mono- và oligosaccharide Vì vậy mà những năm gần đây các nhà khoa học trên thế giới bắt đầu nghiên cứu về vi sinh vật biển sinh enzyme phân cắt fucoidan Một số kết quả đã được công bố tuy nhiên các... evanesces 87 10 0 0 1 - - - 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật Từ các nguồn nước biển, bùn biển và rong biển đã thu thập ở trên, chúng tôi tiến hành cấy phân lập các chủng vi sinh vật biển trong môi trường argar-nước biển có bổ sung nguồn carbon là fucoidan thô được chiết từ rong S mcclurei Sau từ 3-7 Vi n CNSH&MT SVTH: Trần Nguyễn Hà Vy d o m o o c u -tr a c k C w... e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k c h a n g e Vi e N y to k lic c 1.4 Enzyme có khả năng phân cắt fucoidan 1.4.1 Enzyme fucoidanase Hiện nay có 2 loại enzyme tác động lên fucoidan là fucoidanase(EC3.2.1.44) và α-L-fucoisidase(EC.3.2.1.51) Hoạt tính của α-L-fucoisidase được mô tả dễ dàng như là sự giải phóng L-fucose khỏi đoạn cuối của một phân tử polysaccharide, thì vi c xác định hoạt tính của fucoidanase... rong biển có tác dụng điều hòa kích thích sinh trưởng đối với cây trồng nên đã được sản xuất thành phân bón hữu cơ [6] Giá trị dinh dưỡng của rong biển là cung cấp đầy đủ các chất khoáng, các acid amin cần thiết, các loại vitamin, các carbohydrat đặc trưng và các chất có hoạt tính sinh học có lợi cho cơ thể và có khả năng phòng bệnh tật Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng và. .. 10.000 rpm/20’/40C Phần dịch nổi Ex Thử nghiệm hoạt tính enzyme Hình 2.3: Sơ đồ nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi sinh vật 2.2.3Thử nghiệm họat tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan Một hỗn hợp dung dịch gồm 50µl dịch chiết tế bào vi sinh vật được trộn đều với 250µl cơ chất fucoidan 0.5% (pha trong nước) ủ 5 giờ ở 370C Hoạt tính enzyme cắt mạch fucoidan được đánh giá là sự tăng đường khử trong hỗn hợp . Phân lập và sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan . Nội dung luận văn bao gồm:  Phân lập vi sinh vật biển theo định hướng phân cắt fucoidan.  Sàng lọc vi sinh. phân lập được vi khuẩn có khả năng cắt mạch fucoidan từ trầm tích biển và nước biển. Trong vài thập kỉ trở lại đây có nhiều nghiên cứu thú vị về enzyme fucoidanase phân lập từ vi sinh vật biển. PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI SINH VẬT BIỂN SINH ENZYM CÓ KHẢ NĂNG CẮT MẠCH FUCOIDAN Giáo vi n hướng dẫn: PGS.TS. NGÔ ĐĂNG NGHĨA TS. TRẦN THỊ THANH VÂN Sinh vi n thực