1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CHẾ BIẾN ====      ==== LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT POLYMANNURONIC AXÍT TỪ RONG NÂU Ở TỈNH KHÁNH HỒ GVHD : Nguyễn Duy Nhất SVTH : Nguyễn Văn Long MSSV : 47134271 LỚP : 47TP - 3 Nha Trang, tháng 06 năm 2009 2 LỜI CẢM ƠN ðược sự ñồng ý của ban giám hiệu trường ñại học Nha Trang, ban chủ nhiệm khoa chế biến tôi ñược giao thực hiện luận văn tốt nghiệp tại viện nghiên cứu và ứng dụng Nha Trang. Trong quá trình thực hiện luận văn tôi ñã nhận ñược sự gúp ñỡ của thầy cô trong khoa, giáo viên hướng dẫn, các bộ công tác trong viện nghiên cứu và ứng dụng nha trang. Tôi xin trân thành cảm ơn TS. Nguyễn Duy Nhất, TS. Vũ Duy ðô, thầy cô trong khoa chế biến, các bộ trong viện nghiên cứu và ứng dụng Nha Trang ñã gúp tôi hòan thành luận văn tốt nghiệp. 3 MỤC LỤC Trang ðẶT VẤN ðỀ 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 9 1.1. PHÂN LOẠI VÀ ỨNG DỤNG RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI 9 1.1.1. TÌNH HÌNH Sử DụNG RONG BIểN 9 1.1.2. PHÂN LOạI RONG BIểN 10 1.1.3. PHÂN Bố CủA 3 NGÀNH RONG BIểN TRÊN THế GIớI : 12 1.1.4. SảN LƯợNG RONG BIểN TRÊN THế GIớI: 13 1.1.5. RONG MƠ VIệT NAM: 14 1.2. XÁC ðỊNH POLYMANNURONIC AXÍT (MANNURONAN) 15 1.2.1.C ấU TRÚC MANNURONAN 15 1.2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU Sự CÓ MặT CủA NANNURONAN 16 1.2.2.1.Xác ñịnh thành phần mannuronic bằng phương pháp HPEAD: 16 1.2.2.2. Phổ NMR của mannuronan. 16 1.3. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH MANNURONAN TỪ RONG NÂU 18 1.3.1 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIếT MANNURONAN THÔNG QUA TÁCH CHIếT ALGINATE 18 I.3.1.1 Phương pháp chiết alginate 18 1.3.1.2 Thủy phân từng phần alginate thu mannuronan 21 1.3.2 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT MANNURONAN KHÔNG QUA TÁCH CHIẾT ALGINATE 22 1.4. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MANNURONAN 24 CHƯƠNG 2: ðỐI TƯỢNG VÀ THỰC NGHIỆM 25 2.1.ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: 25 2.2. THỰC NGHIỆM: 26 2.2.1. TÁCH CHIẾT MANNURONAN: SƠ ðỒ NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT THỰC NGHIỆM. 26 2.2.1.1. Bố trí khảo sát nhiệt ñộ chiết ñể sản phẩm không chứa alginate: 27 2.2.1.2. Khảo sát thời gian chiết: 28 4 2.2.1.3. Khảo sát nồng ñộ axít acetic ñể tách mannuronan ra khỏi dịch chiết nước ban ñầu: 30 2.2.1.4. Khảo sát nồng ñộ ethanol ñể tách mannuronan ra khỏi dung dịch: 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1: KHảO SÁT NHIệT ðộ CHIếT ðể SảN PHẩM KHÔNG CHứA ALGINATE 33 3.2 KHảO SÁT THờI GIAN CHIếT: 34 3.2 KHảO SÁT NồNG ðộ ETHANOL ðể TÁCH MANNURONAN RA KHỏI DUNG DịCH: 35 3.3. KHảO SÁT NồNG ðộ AXÍT ACETIC ðể TÁCH MANNURONAN RA KHỏI DịCH CHIếT NƯớC BAN ðầU 35 3.5. ðỀ XUẤT QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT POLYMANURONIC TỪ RONG NÂU 38 KẾT LUẬN 41 ðỀ XUẤT Ý KIẾN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 5 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1: Thành phần hoá học (trên 100g rong) của một số loài rong trong 3 ngành chính 10 Bảng 1.2: Các dạng hydratcacbon trong 3 ngành rong biển 11 Bảng 1.3 ñộ dịch chuyển hóa học trong phổ CNMR của mannuronan 17 6 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1: phổ CNMR của mannuronan 17 Hình 1.2 phổ HNMR và CNMR của alginate gồm khối G và khối M 18 Hình 1.3 : Sơ ñồ chiết alginate từ rong nâu 20 Hình 1.4 : Sơ ñồ tách chiết mannuronan từ alginate 22 Hình 2.1: Sơ ñồ nghiên cứu tổng quát thực nghiệm 26 Hình 2.2: sơ ñồ khảo sát nhiệt ñộ chiết ñể sản phẩm không chứa alginate. 27 Cách tiến hành: 27 Hình 2.3. Sơ ñồ khảo sát thời gian nấu chiết 28 Hình 2.4: Sơ ñồ khảo sát nồng ñộ axít acetic ñể tách mannuronan 30 Hình 2.5: Khảo sát nồng ñộ ethanol ñể tách mannuronan ra khỏi dung dịch 31 Hình 3.1: sơ ñồ quy trình chiết polymannuronic axit từ rong nâu 38 7 ðẶT VẤN ðỀ Việt Nam có hơn 3.000 km bờ biển với sự thay ñổi môi trường sinh thái rất ña dạng, phong phú. Trong số các tài nguyên sinh vật biển của Việt Nam thì nguồn rong biển, ñặc biệt là rong nâu có ý nghĩa rất quan trọng. Theo thống kê chưa ñầy ñủ thì chỉ riêng chi Sargassum của ngành rong nâu ở nước ta ñã có hơn 70 loài với sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm . Các hợp chất trong rong nâu có nhiều tính chất hóa lý, hoạt tính sinh học quí như alginate, fucoidan, laminaran, mannitol, iod hữu cơ, các hợp chất chuyển hóa thứ cấp …, ñược sử dụng rất nhiều trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dệt, nhuộm, in, thức ăn gia súc, dược liệu …Ngoài những thành phần ñó, rong nâu còn chứa một lượng tương ñối lớn polymannuronic axít (mannuronan), thông thường ñể có ñược mannuronan, người ta phải tách chiết alginate sau ñó thủy phân trong môi trường axít mạnh thành các khối mannuronan (block M), guluronan (block G) và block MG. Tuy nhiên, trong một vài nghiên cứu gần ñây các nhà khoa học ñã cho thấy mannuronan thực tế là một thành phần riêng biệt có mặt trong rong nâu, có thể tách chiết khỏi các polysacarit khác mà không cần phải thủy phân từ alginic axít. Mannuronan có hoạt tính sinh học rất quí ñó là có khả năng sử dụng ñể ñiều trị bệnh ung thư. Khác với các polysacarit khác có hoạt tính kháng ung thư trong rong nâu như fucoidan, alginate (heteropolysaccharide), laminaran (có tỉ lệ liên kết 1→3 và 1→6 biến ñổi tùy theo loài rong), mannuronan có cấu trúc rõ ràng, thành phần ñơn phân tử chỉ có mannuronic axít, các ñơn phân tử liên kết với nhau theo mạch thẳng. ðó chính là ñặc ñiểm cần thiết ñể ổn ñịnh hoạt lực và là ñiều kiện kiên quyết ñể sử dụng làm thuốc trong y học. ðẩy mạnh nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các loài rong biển Việt Nam, trong ñó có rong nâu, tìm ra các công nghệ sử dụng, khai thác có hiệu quả chúng là hoàn toàn phù hợp với chiến lược phát triển kinh tế của 8 ðảng và Chính phủ. ðây là vấn ñề có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế xã hội rất cao, phù hợp với xu hướng phát triển của ñất nước. Từ những lý do nêu trên, ñể hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về rong nâu, nhằm khai thác nguồn tài nguyên biển dồi dào và ñể tạo ra những chế phẩm phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng ñồng chúng tôi ñặt vấn ñề thực hiện ñề tài: “ Tách chiết polymannuronic axít từ rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà sử dụng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ ñiều trị bệnh ung thư” Với nhiệm vụ của luận án là: - Nghiên cứu các phương pháp tách chiết polymannuronic axít ñã ñược công bố, từ ñó rút ra phương pháp chiết polymannuronic axít, phù hợp với ñiều kiện sử dụng làm thực phẩm chức năng. - Tách chiết polymannuronic axít từ rong nâu ñộc lập với tách chiết alginic axít. - Xác ñịnh sự có mặt và hàm lượng của polymannuronic axít trong sản phẩm. - Phân tích các chỉ tiêu hóa, lý, sinh và tìm tài liệu ñã công bố polymannuronic axít có khả năng ñiều trị bệnh ung thư ñể chứng minh sản phẩm ñủ ñiều kiện làm thực phẩm chức năng. 9 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1. PHÂN LOẠI VÀ ỨNG DỤNG RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI 1.1.1. Tình hình sử dụng rong biển. Rong biển ñã ñược sử dụng từ rất sớm, khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Trung quốc, 600 năm trước công nguyên, rong biển ñã ñược chế biến thành một món ăn quí dành cho vua chúa. Thuốc “trường sinh bất tử” ñược vị hoàng ñế ñầu tiên của Trung Hoa là Tần Thuỷ Hoàng sử dụng vào năm 200 trước công nguyên ñã ñược khoa học hiện ñại chứng minh ñó chính là hợp phần của rong nâu sau hơn 2000 năm. Trong mười năm gần ñây, chính quyền Trung Quốc ñã chi phí ñến 12 triệu USD ñể phát triển một loại thuốc trị AIDS từ rong nâu với tên thương phẩm là FUCOIDAN-GLYCOCALYX (F-GC). Loại thuốc tự nhiên này có khả năng diệt virus HIV, tăng sức chịu ñựng của phân tử miễn dịch. Ngày 01 tháng 01 năm 2003 loại thuốc này ñã ñược chính phủ Trung Quốc cấp phép cho sản xuất và ñưa vào sử dụng. Tại Nhật rong nâu ñã ñược sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ V. Cuối năm 2001 cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm của Mỹ ñã xem xét và xác nhận các sản phẩm thực phẩm chức năng ở Nhật ñược bổ sung thêm thành phần fucoidan có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, giảm cholesterol, giảm mỡ máu, các sản phẩm này ñã trở thành thực phẩm hỗ trợ trị bệnh nan y phổ biến của nước Nhật . Rong biển ñã ñược dùng làm thực phẩm trên toàn thế giới rất quen thuộc với chúng ta (rong ñỏ: agar, carrageenan, rong nâu: alginat), chúng cũng là nguồn bổ sung dưỡng chất (protein, vitamin, khoáng vi lượng) cho thức ăn nuôi tôm, thức ăn gia súc, ñược dùng trong công nghiệp dệt, nhuộm, mực in, sơn, hàn ñiện, lọc và hấp phụ các hợp chất, công nghiệp giấy, trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh, ñiện di. Sản phẩm từ rong biển còn là nguyên liệu không thể thiếu cũng như trong công nghiệp nước giải khát và ñồ hộp, socola, 10 mỹ phẩm cao cấp (carrageenan). Ngoài ra rong biển còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng với chất oligo alginat, laminaran (rong nâu) cùng các hợp chất như auxin, gibberelin, cytokinin, thường có trong hầu hết các ngành rong. Rong biển còn ñược sử dụng chữa trị ung thư theo các bài thuốc gia truyền dưới dạng dùng kết hợp với các thuốc khác và polyphenol trong rong nâu cũng ñược dùng làm trà chống lão hoá. ðặc biệt trong thời gian gần ñây ñã có sáng chế ñăng ký tại Mỹ về nghiên cứu rong biển ñể sản xuất nhiên liệu sinh học (biodiesel). 1.1.2. Phân loại rong biển. Hiện nay, rong biển ñược phân thành 3 ngành chính : 1. Ngành rong ðỏ (Rhodophyta) 2. Ngành rong Nâu (Phaeophyta) 3. Ngành rong Lục (Chlorophyta) Thành phần hoá học của rong biển chủ yếu là nước, các dạng polysacarit của 3 ngành rong ñược ñưa trong bảng 1.2, thành phần các polysacarit trong các loài rong ñược thể hiện trong bảng 1.1 Bảng 1.1: Thành phần hoá học (trên 100g rong) của một số loài rong trong 3 ngành chính Ascophyllum nodosum Laminaria digitata Alaria esculenta Palmaria palmata Porphyra sp. Porphyra yezoensis Ulva species Ngành rong Nâu Nâu Nâu ðỏ ðỏ ðỏ Lục Nước (%) 70-85 73-90 73-86 79-88 86 Nd 78 Tro 15-25 73-90 73-86 15-30 8-16 7.8 13-22 hydratcacbon - - - - 40 44.4 42-46 Axít polyuronic 15-30 20-45 21-42 0 0 0 0 Xylan 0 0 0 29-45 0 0 0 Laminaran 0-10 0-18 0-34 0 0 0 0 [...]... nh ñư c s có m t và ñ s ch c a polymannuronic axít trong s n ph m ñi u ch ñư c d a trên ph NMR 1.3 PHƯƠNG PHÁP CHI T TÁCH MANNURONAN T RONG NÂU 1.3.1 Phương pháp tách chi t mannuronan thông qua tách chi t alginate I.3.1.1 Phương pháp chi t alginate Cho ñ n nay, trên th gi i cũng như trong nư c ñã có r t nhi u bài vi t công b v phương pháp chi t alginat H u h t các phương pháp ñ u d a vào tính tan c a... r n Hình 1.4 : Sơ ñ tách chi t mannuronan t alginate 1.3.2 Phương pháp tách chi t mannuronan không qua tách chi t alginate M t ph n mannuronan n m ñ c l p bên ngoài kh i alginate có th chi t th ng t rong nâu b ng phương pháp như sau: Rong nâu yêu c u c n ph i s ch s không m c, không th i, không giòn gãy ðem rong ngâm r a trong nư c ng t t 1,5-2 gi cho s ch t p ch t mu i còn l i Rong sau khi ñã ngâm... trình s n xu t Alginate b ng phương pháp x lý Formol trên hai lo i rong S.mcclurei và S.kjellmanianum vùng bi n Nha Trang – Khánh Hòa Trư c h t, rong nâu phơi khô ñư c chi t v i HCl loãng pH=2 ñ lo i b ph n l n fucoidan và laminaran tan trong d ch chi t Ti p theo ñó, bã rong còn l i ñư c r a h t axít và n u v i dung d ch Na2CO3 3% trong 3 gi ñ chuy n alginic axít có trong rong thành d ng alginate tan,... sơ ñ chi t Polymannuronic Phân tích thành ph n mannuronic trong s n ph m Ch n nhi t ñ chi t t i ưu Hình 2.2: sơ ñ kh o sát nhi t ñ chi t ñ s n ph m không ch a alginate Cách ti n hành: Cân 1kg rong nâu khô, ngâm và r a s ch trong nư c ng t 1,5-2 gi ñ ráo, Ngâm rong trong EtOH t l dung d ch w/v=1/1, ngâm trong th i gian 24 gi , nhi t ñ bình thư ng, sao cho lư ng rong luôn ng p trong dung d ch Rong sau... ho t tính kháng ung thư t rong nâu 25 CHƯƠNG 2: ð I TƯ NG VÀ TH C NGHI M 2.1.ð i tư ng nghiên c u: ð i tư ng nghiên c u là m t s loài rong nâu trong h sargassum khai thác t i v nh nha trang, khánh hòa Rong nâu sau khi ñư c thu ho ch ñư c phơi khô t i ñ m ≤ 22% và ñư c b o qu n dùng làm nguyên li u th c nghi m Rong nâu thu v nh nha trang g m các loài: sargassum polycystum Sargassum denticarpum Sargassum... alginic axít pH . Tách chiết polymannuronic axít từ rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà sử dụng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ ñiều trị bệnh ung thư” Với nhiệm vụ của luận án là: - Nghiên cứu các phương pháp tách chiết. sạch của polymannuronic axít trong sản phẩm ñiều chế ñược dựa trên phổ NMR. 1.3. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH MANNURONAN TỪ RONG NÂU 1.3.1 Phương pháp tách chiết mannuronan thông qua tách chiết alginate chiết polymannuronic axít ñã ñược công bố, từ ñó rút ra phương pháp chiết polymannuronic axít, phù hợp với ñiều kiện sử dụng làm thực phẩm chức năng. - Tách chiết polymannuronic axít từ rong nâu