iii LỜI CẢM ƠN Sau hơn 3 tháng thực tập tại Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung, dưới sự hướng dẫn của thầy TS. Võ Thành Thìn và ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc cùng các anh, chị ở Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường đại học Nha Trang tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này. Qua đây, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến TS. Võ Thành Thìn - phó Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung và ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc – giảng viên Bộ môn công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp của mình. Tôi cũng xin chân thành cản ơn ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua. Cảm ơn cô Ths. Khúc Thị An – Trưởng Bộ môn công nghệ sinh học, đã giúp đỡ tôi hoàn thành một số giấy tờ của luận văn tốt nghiệp này Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Phạm Trung Hiếu, các anh chị trong Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung đã trực tiếp giúp đỡ và chỉ dạy cho tôi hoàn thiện về một số kỹ năng và thao tác trong phòng thí nghiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn Trần Minh Tùng, Đoàn Văn Tiến và Lại Nhật Linh đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, nhóm học tập “WAO”, cùng toàn thể bạn bè thân thiết đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu. Nha Trang, tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện Võ Lê Chi iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix LỜI NÓI ĐẦU 1 1.1. TỔNG QUAN VỀ LEPTOSPIRA 3 1.1.1. Phân loại Leptospira 3 1.1.1.1. Phân loại khoa học 3 1.1.1.2. Phân loại theo cấu trúc kháng nguyên 3 1.1.2. Các đặc điểm sinh học của Leptospira 5 1.1.2.1. Đặc điểm cấu tạo 5 1.1.2.2. Đặc điểm hình thái của Leptospira 6 1.1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy 6 1.1.2.4. Sức đề kháng của Leptospira 7 1.1.2.5. Một số yếu tố độc lực của Leptospira 7 1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA LEPTOSPIRA 9 1.2.1. Vật mang mầm bệnh 9 1.2.2. Con đƣờng lây nhiễm của bệnh Leptospirosis 10 v 1.2.3. Cơ chế sinh bệnh 12 1.2.4. Một số đặc điểm bệnh học và lâm sàn của bệnh Leptospirosis ở lợn và ngƣời 13 1.2.4.1. Bệnh Leptospirosis ở lợn 13 1.2.4.2. Bệnh Leptospirosis ở ngƣời 14 1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH LEPTOSPIROSIS 15 1.3.1. Chẩn đoán vi khuẩn học 15 1.3.2. Chẩn đoán huyết thanh học 17 1.3.3. Sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử 17 1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH LEPTOSPIROSIS TRÊN LỢN TẠI VIỆT NAM 18 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. ĐỐI TƢỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 19 2.1.1. Thời gian cứu 19 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 19 2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.2. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 19 2.2.1. Vật liệu 19 2.2.2. Môi trƣờng, hóa chất 19 2.2.3. Kháng nguyên chuẩn 20 vi 2.2.4. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 21 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 22 2.3.2. Phƣơng pháp phát hiện Leptospira trong mẫu bệnh phẩm 23 2.3.2.1. Chiết tách DNA 24 2.3.2.2. Chuẩn hóa phản ứng PCR 27 2.3.2.3. Phát hiện Leptospira trong mẫu bệnh phẩm 31 2.3.2.4. Phƣơng pháp điện di 32 2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 33 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. CHUẨN HÓA PHẢN ỨNG PCR 34 3.1.1. Xác nhận giá trị của phƣơng pháp PCR 34 3.1.2. Kết quả kiểm tra độ nhạy của phản ứng 34 3.1.3. Kết quả xác định tính đặc hiệu của phản ứng PCR 36 3.2. KẾT QUẢ PCR TRÊN MẪU DNA 38 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 4.1. KẾT LUẬN 43 4.2. KIẾN NGHỊ 43 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 51 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số serogroup thƣờng gặp của các loài Leptospira 3 Bảng 2.1. Danh sách các serovar Leptospira dùng trong chuẩn hóa PCR 20 Bảng 2.2. Kết quả thu mẫu bệnh phẩm thận lợn 23 Bảng 2.3. Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 30 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 2.5. Bảng kết quả số liệu sau khi chạy PCR 33 Bảng 3.1. Kết quả xác định độ nhạy của phản ứng PCR 35 Bảng 3.2. Kết quả xác định tính đặc hiệu của phản ứng PCR 36 Bảng 1. Kết quả sử dụng hàm CHITEST xác định sự có nghĩa của kết quả thống kê 51 viii DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1. Hình Leptospira Icterohaemorrhagiae chụp dƣới kính hiển vi điện tử 6 Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thực hiện để phát hiện bệnh Leptospirosis ở lợn 23 Hình 2.2. Nguyên lý phản ứng PCR 28 Hình 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 31 Hình 3.1. Sản phẩm phản ứng PCR trên thạch agarose 34 Hình 3.2. Sản phẩm phản ứng PCR xác định giới hạn nồng độ DNA 35 Hình 3.3. Sản phẩm phản ứng PCR xác định tính đặc hiệu 37 Hình 3.4. Kết quả PCR mẫu DNA tách chiết từ thận ở lấy mẫu ở các lò mổ tại Buôn Hồ - Đắk Lắk 39 Hình 3.5. Kết quả PCR mẫu DNA tách chiết từ thận ở lấy mẫu ở các lò mổ tại Phù Cát – Bình Định 40 ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT LPS : Lipopolysaccharide MAT : Microscopic Agglutination Test RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism VNRT : Variable Number of Tandem Repeats EMJH : Ellinghausen, Mc Cullough, Johnson, Harris ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay IF : Immuno Fluorescence PCR: Polymerase Chain Reaction 1 LỜI NÓI ĐẦU Tình hình chăn nuôi gia súc năm 2011 và đầu năm 2012 tương đối ổn định, nhưng cũng đã đối mặt với nhiều dịnh bệnh cũ và mới như heo tai xanh, lở mồm long móng, tiêu chảy ở đàn gia súc. Đặc biệt bệnh Leptospirosis một bệnh cũ nhưng mà mới (cơ chế gây bệnh và sự phá hủy các tổ chức bên trong cơ thể vật chủ của Leptospira đến nay vẫn chưa được làm rõ). Với nhiều chủng huyết thanh khác nhau, thì xoắn khuẩn Leptospira đã gây bệnh ở nhiều đối tượng gia súc, vật nuôi và kể cả con người. Ở mỗi loài gia súc khác nhau đều có thể mắc một hay nhiều serotype khác nhau. Leptospira gây bệnh trên động vật mà không biểu hiện triệu chứng lâm sàng được gọi là động vật mang trùng. Những động vật mang trùng, chúng không thể hiện triệu chứng lâm sàng nhưng mang một lượng lớn Leptospira trong thận và thải ra ngoài qua nước tiểu – đây là nguồn lây nhiễm mầm bệnh rất nguy hiểm cho người và động vật nuôi. Với tổng đàn lợn đạt 27,8 triệu con, tổng lượng thịt hơi xuất chuồng ước tính đạt 3,2 triệu tấn (tính đến cuối năm 2011) [1], như vậy đàn lợn là nguồn cung cấp thịt chủ yếu nhất cho thị trường cả nước. Nhưng trên lợn bệnh Leptospirosis đã tồn tại trên mấy chục năm cho tới nay vẫn không kiểm soát được các nguồn lây nhiễm. Hơn nữa, cấu trúc phân tử cũng như cơ sở di truyền phân tử của Leptospira vẫn còn trong quá trình nghiên cứu, thì bệnh Leptospirosis vẫn đang là một vấn đề nan giải. Lợn là đông vật mang trùng serovar Ponoma, Tarassovi, nên rất dễ lây truyền. Xoắn khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua da ẩm ướt, vết thương trên da, niêm mạc đường hô hấp, đường tiêu hóa. Chỉ với một lượng rất nhỏ, Leptospira sau khi xâm nhập vào cơ thể sẽ gây ra mẫm cảm. Động vật và người mắc bệnh Leptospirosis thường rất ít thể hiện triệu chứng và triệu chứng có thể biểu hiện khác nhau ở từng cá thể. Vì thế, việc chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm là rất cần thiết. Một trong những phương pháp sử dụng phổ biến là phát hiện kháng thể kháng Leptospira đặc hiệu trong huyết thanh bằng phản ứng vi ngưng kết tan trên phiến kính (MAT – microscopic agglutination 2 test). Ngoài ra có thể phát hiện kháng thể bằng phản ứng ngăn trở gián tiếp hồng cầu, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Leptospira có thể phân lập trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm hoặc phát hiện bằng kính hiển vi nền đen, nhuộm miễn dịch. Một số kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại khác cũng đã được ứng dụng để chẩn đoán Leptospira như RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), VNRT (Variable Number of Tandem Repeats), giải trình tự gen 16S. Hiện nay, kỹ thuật PCR (Polymerasa Chain Reaction) và RT – PCR cũng được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh do Leptospira gây ra. Một số ưu điểm của kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh là PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ nhạy cao, PCR chẳng những có thể phát hiện được tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm mà còn có thể phân loại type di truyền của các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy vi khuẩn, dễ thực hiện, nhanh cho kết quả. Ðây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các tác nhân gây bệnh trong cộng đồng Như vậy nhằm chuẩn hóa kỹ thuật PCR để phát hiện và thống kê tỷ lệ nhiễm bệnh Leptospirosis ở lợn nên chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh Leptospirosis ở lợn tại Đắk Lắk và Bình Định” với một số nội dung sau: - Chuẩn hóa phản ứng PCR để phát hiện Leptospira trong mẫu bệnh phẩm thận lợn. - Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh Leptospirosis. - Thống kê tỷ lệ nhiễm bệnh Leptospirosis ở lợn thịt trên địa bàn Đắk Lắk và Bình Định. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ LEPTOSPIRA 1.1.1. Phân loại Leptospira 1.1.1.1. Phân loại khoa học Về phân loại khoa học Leptospira được xếp vào: Giới: Monera Ngành: Spirochaetes Họ: Leptospiraceae Giống: Leptospira [43] Các loài gồm có L. alexanderi, L. biflexa, L. broomii, L. borgpetersenii, L. fainei, L. inadai, L. interrogans, L. kirschneri, L. licerasiae, L. meyeri, L. weilii, L. noguchii, L. santarosai, L. wolbachii, L. kmetyi, L. wolffii, L. genomospecies 1, L. genomospecies 3, L. genomospecies 4, L. genomospecies 5 Trong đó, loài L. interrogans và L. fiainei được xem là có động lực cao nhất trên người và động vật [51], [45], [9]. 1.1.1.2. Phân loại theo cấu trúc kháng nguyên Dựa vào cấu trúc đặc hiệu của kháng nguyên LPS (Lipopolysaccharide) trên bề mặt tế bào và cấu trúc di truyền của Leptospira, có hơn 260 serovar khác nhau đã được xác định. Các serovar này lại thuộc các serogroup khác nhau, trong đó có nhiều serovar gây bệnh cho vật nuôi [34]. Bảng 1.1. Một số serogroup thƣờng gặp của các loài Leptospira [34] STT Loài Serogroup 1 L. interrogans Icterohaemorrhagiae, Canicola, Ponoma, Australis, Autumnalis, Pyrogenes, Grippotyphosa, Djasiman, Hebdomadis, Sejroe, Bataviae, Ranarum, Luoisiana, Mini, Sarmin, Panama, Cynopteri, Tarassovi, Ballum, Celledoni, Manhao, Shermani, Hurstbrige. 2 L. noguchii Panama, Autumnalis, Pyrogenes, Tarassovi, Bataviae, [...]... bàn Buôn Hồ - Đắk Lắk và Phù Cát – Bình Định 2.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu Đề tài được nghiên cức trên mẫu thận lợn lấy lò mổ tại Buôn Hồ – Đắk Lắk và Phù Cát – Bình Định 2.2 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1 Vật liệu Mẫu thận lợn thu từ các lò mổ ở Buôn Hồ – Đắk Lắk và Phù Cát – Bình Định 2.2.2 Môi trƣờng, hóa chất  Môi trường, hóa chất dùng trong nuôi cấy, phân lập Leptospira: EMJH dạng lỏng và bán lỏng (semi-solid)... phương pháp chẩn đoán huyết thanh học để phân biệt các serovar Leptospira là: - Phản ứng với kháng nguyên chết (hấp thu hồng cầu thụ động) - Phản ứng vi ngưng kết tan – MAT với kháng nguyên sống - Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IF - Immuno Fluorescence) - Phản ứng ELISA 1.3.3 Sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử Hiện nay, kỹ thuật PCR và RT – PCR cũng được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh do Leptospira... gây bệnh cho chúng, nhưng không có khả năng bảo hộ với các serovar Leptospira Gia súc khỏi bệnh Leptospira là ổ chứa vi khuẩn, là vật mang trùng [28] 1.2.4 Một số đặc điểm bệnh học và lâm sàn của bệnh Leptospirosis ở lợn và ngƣời 1.2.4.1 Bệnh Leptospirosis ở lợn Các serovar thường gây bệnh mang tính đặc trưng loài như Autralis và Pomona ở lợn [11] Bênh cạch đó, có rất nhiều serovar khác có thể gây bệnh. .. [9] Một số kỹ thuật sinh học phân tử 18 hiện đại khác cũng đã được ứng dụng để chẩn đoán Leptospira như RFLP [31], VNRT [36], giải trình tự gen 16S rRNA [40], MLST [10] 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH LEPTOSPIROSIS TRÊN LỢN TẠI VIỆT NAM Ở Việt Nam, bệnh Leptospirosis trên gia súc được nghiên cứu từ rất sớm (1968-1978) Theo Vũ Đình Hưng và Nguyễn Thị Diện (1968-1978) trâu bò và chó đều mắc bệnh này với... lạnh ổn nhiệt và chuyển ngay về phòng thí nghiệm Trong thời gian từ 20/3/2012 đến 2/6/2012 chúng tôi sẽ tiến hành 2 đợt thu mẫu, bao gồm: - Đắk Lắk: Lấy mẫu tại huyện Buôn Hồ - Bình Định: Lấy mẫu tại huyện Phù Cát Mẫu được tiến hành lấy ngẫu nhiên ở các lò mổ lợn tại các địa bàn Buôn Hồ – Đắk Lắk và Phù Cát – Bình Định Do ở các địa phương trên phương thức giết mổ 23 không tập trung, giết mổ lợn theo quy... gây bệnh thường mang tính đặc trưng loài như Canicola chủ yếu gây bệnh ở chó, Bratislava ở ngựa và lợn, Hardjo ở bò, Australis và Pomona ở lợn [11], [15], [22], [26] Bên cạnh đấy, có rất nhiều serovar khác có thể gây bệnh ở vật nuôi như ở lợn là Grippotyphosa, Canicola, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae; ở bò là Pomona, Australis, Bratislava, Sejroe, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Canicola; ở chó... serovar khác có thể gây bệnh ở lợn như là Grippotyphosa, Canicola, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae [23], [34], [9] Bệnh xảy ra quanh năm, nhưng nhiều nhất thường vào mùa mưa, gây bệnh cho lợn ở các lứa tuổi và tính biệt khác nhau, đặc biệt là lợn nái và lợn đực giống Trong số các serovar gây bệnh trên lợn thì L Pomona là một trong những tác nhân gây sẩy thai phổ biến ở lợn nái, làm lợn con sinh ra chết sớm... với tỉ lệ rất cao, với 35,1% ở trâu, ở lợn là 22,9% và ở chó là 26,47%, đặc biệt đối với công nhân chăn nuôi tỉ lệ dương tính lên tới 56,0% [3] Tại khu vực Nam Trung Bộ - Tây Nguyên, Hoàng Mạnh Lâm và cs (2001) đã tiến hành xét nghiệm và 357 mẫu huyết thanh lợn thu thập từ 3 vùng sinh thái của tỉnh đắk Lắk Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm ở lợn là 3,53% [5] Theo Ho Thi Viet Thu và Tran Chi Hieu (2002), tỷ... phương pháp cơ bản và quan trọng nhất trong chẩn đoán Leptospirosis vì nó không chỉ xác định được vi khuẩn gây bệnh mà còn cho biết serovar Leptospira nào gây bệnh [44] Phương pháp này đòi hỏi phải có các serovar Leptospira đã biết, số lượng serovar tuỳ thuộc từng nơi, từng nước sử dụng và huyết thanh chẩn đoán lấy ở gia súc nghi bệnh Gia súc sau khi nhiễm bệnh khoảng một tuần trong máu có kháng thể,... chủ chốt làm chúng tồn tại trong môi trường và làm ô nhiễm đất và nước Nước nhiễm trùng là một nguồn bệnh gián tiếp rất quan trọng cho người và động vật [23] Thời gian mang xoắn khuẩn và bài xuất mầm bệnh ra ngoài tùy thuộc vào loài vật mang trùng, mùa vụ, thói quen sinh hoạt và các Serovar Leptospira khác nhau như: Trâu, bò 120 ngày, lợn 300 ngày và chó 700 ngày Mầm bệnh tồn tại lâu trong đất, nước, . bệnh Leptospirosis ở lợn tại Đắk Lắk và Bình Định với một số nội dung sau: - Chuẩn hóa phản ứng PCR để phát hiện Leptospira trong mẫu bệnh phẩm thận lợn. - Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán. bệnh trong cộng đồng Như vậy nhằm chuẩn hóa kỹ thuật PCR để phát hiện và thống kê tỷ lệ nhiễm bệnh Leptospirosis ở lợn nên chúng tôi tiến hành đề tài Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh. Hiện nay, kỹ thuật PCR (Polymerasa Chain Reaction) và RT – PCR cũng được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh do Leptospira gây ra. Một số ưu điểm của kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh là PCR có