ỏnh giỏ tớnh an ton v hiu lc bo v ca khỏng huyt thanh khỏn Bacillus Anthracis tinh ch trờn ng vt thc nghim Hong Th Thu H * ; Tng Th Nga * ; Phm Thanh Hi * Nguyn Thỏi Sn ** ; Phan Bn *** ; Phựng c Cam* Tóm tắt Bnh than l bnh nhim khun cp tớnh, lm tn thng da, ng hụ hp di, ng tiờu húa v nhiu ph tng. Bnh hay gp ng vt n c, lõy sang ngi do tip xỳc. Bnh xy ra nhiu ni trờn th gii, trong ú cú Vit Nam. T l t vong cao i vi c ngi v ng vt. Vcxin v khỏng huyt thanh (KHT) chng vi khun (VK) than l ch phm cú tỏc dng phũng nga v iu tr bnh than. Hin trờn th trng cha cú sn nhng sinh phm ny dựng cho nhõn dõn v quõn i khi cú tỡnh hung xy ra. KHT chng VK than do Hc vin Quõn y phi hp vi Cụng ty Vcxin Pasteur Lt sn xut c th nghim, ỏnh giỏ tớnh an ton cng nh hiu lc bo v trờn ng vt thc nghim cho thy t yờu cu v tớnh an ton v hiu lc bo v liu gõy cht 10 x LD 50 ca chng VK c lc B. anthracis 17JB. * T khúa: Khỏng huyt thanh chng bnh than; Tớnh an ton; Hiu lc bo v. Evaluation of Safety and Potency of the Bacillus anthracis antisera in the experimental animals in Vietnam Summary Anthrax in nature is a usually fatal zoonotic disease and caused by Bacillus anthracis. Animals acquire the disease from consuming contaminated soil in which pre-existing anthrax spores are likely to have germinated, then repopulated under appropriate soil and weather conditions, increasing their concentration in soil to infectious levels. Human disease results from exposure to contaminated animal products. There is need to use the vaccine and/or anti-sera for prevention and treatment of the disease. The biological produces, however, need to evaluate their characteristics before using. The Bacillus anthracis anti-sera was produced in a rabies by injecting spores of the Sterne strain of Bacillus anthracis at in Dalat Vaccination Pasteur Institute and Military Medical University in Vietnam. The anti-sera was investigated for its safety and potency. The results showed that the anti-sera achieve the National Center for Control of Medical Biological Products and Vietnam pharmacopoeia- No.3 criteria for safety and potency with 10 x LD 50 of B. anthracis 17JB strain. * Key words: Anthrax anti-sera; Safety, Potency. * Viện Vệ sinh Dịch tễ TW ** Bệnh viện 103 *** Công ty Vắcxin Pasteur Đà Lạt Phản biện khoa học: PGS. TS. Nguyễn Văn Minh ặt vấn đề Bnh than l bnh nhim khun cp tớnh, thng lm tn thng da, ng hụ hp di v tiờu húa. Bnh hay gp ng vt n c, nhng cú th gõy bnh cho ngi v ng vt cú vỳ khỏc qua tiếp xúc. Bnh xy ra rng khp trờn th gii, t l t vong cú th rt cao i vi c ngi v ng vt [4, 5]. Tỏc nhõn gõy bnh l trc khun gram dng Bacillus anthracis (B. anthracis) cú nha bo, cú th chu c tỏc ng ca nhit , tia cc tớm, bc x v mt s húa cht [6]. Vỡ vy, VK cú kh nng tn ti nhiu nm mụi trng v phỏt tỏn nhanh. Hn na, B. anthracis cú th ch dng bt, nờn ó c s dng lm v khớ sinh hc gõy nguy him cho loi ngi. G n õy nht, nm 2001, v khng b sinh hc bng VK B. anthracis ti M lm 5 ngi cht trờn tng s 22 ca mc bnh [4]. gúp phn ngn nga dch bnh than trờn c ngi v ng vt, nhiu nc trờn th gii ó nghiờn cu sn xut KHT than tinh ch v vcxin nhng cỏc ch phm ny cú giỏ thnh khỏ cao. Trên thực tế nhu cu sn xut vcxin hay KHT trong n c rt cn thit. Tuy nhiờn, cỏc ch phm sinh hc nh KHT, vcxin cn kim tra tớnh an ton cng nh hiu lc bo v trờn ng vt thc nghim trc khi a vo s dng. Vỡ vy, nghiờn cu ny nhm mc tiờu: Đỏnh giỏ tớnh an ton v hiu lc bo v ca khỏng huyt thanh bacillus anthracis tinh ch trờn ng vt thc nghim. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Vt liu nghiờn cu. * Sinh ph m: - KHT than tinh ch, úng l 1ml (hiu giỏ 1/640) (do Hc vin Quõn y v Cụng ty Vcxin Pasteur Lt phi hp sn xut), hạn sử dụng đến năm 2012. - Chng VK cú c lc B. anthracis 17JB dựng th thỏch hiu qu bo v. - Nc mui sinh lý 0,85% (NaCl 0,85%), pH t 7,0 - 7,2. - Mụi trng thch mỏu cu 5%, thch dinh dng, thch bỏn lng. - Mụi trng ng cỏc loi: salicin, glucose, sacarose, manitol, arabinose. - Dung dch H 2 O 2 , NaClO 1%, 10%. * ng vt thớ nghim: - Chut lang cú trng lng t 250 - 350g. - Chut nht (ng gii) cú trng lng t 17 - 22g. * Dng c thớ nghim: b o c McFarland; týp nha 15 ml, vụ trựng (Corning); micropipette loi 200 àl, 1000 àl; u cụn 200 àl, 1000 àl; que cy nha vụ trựng 1 àl, 10 àl; bm tiờm 1 ml; bụng, cn 70 0 ; t m 37 0 C, ốn cn, lam kớnh; kính hiển vi, cõn in t hin s. 2. Phng phỏp nghiờn cu. ỏnh giỏ tớnh an ton v hiu lc KHT theo tiờu chun Dc in III [2], thc hin ti phũng thớ nghim an ton sinh hc cp 3, Vin V sinh Dch t TW. * ỏnh giỏ an ton ca KHT: - Chn chut khe mnh v nuụi cỏch ly 5 ngy trc th nghim, cho n ung y . - Chut chia lm 2 nhúm: + Chut lang: tr ng lng chut 250g/con (3 con). 42 + Chut nht: cõn trng lng chut 18g/con (3 con). - Cỏch tiờm: tiờm di da vựng ựi bn (01 con tiờm KHT tinh ch, 01 con tiờm NaCl 0,85% v 01 con khụng tiờm). - Liu tiờm: 5 ml/con i vi chut lang v 1 ml/con i vi chut nht. - Thi gian theo dừi: chm súc v theo dừi chut cho n ngy th 14, theo dừi sc khe v cõn trng lng chut. * Tiờu chun ỏnh giỏ: tiờu chun an ton ca KHT khỏng B. anthracis tinh ch l chut sng khe mnh, khụng cú du hiu bnh lý v trng lng gim khụng quỏ 1/5 so vi ban u [2, 4, 6]. 2. ỏnh giỏ hiu lc bo v ca KHT than tinh ch. * Cy chng VK v chun b liu tiờm chut: + Chng VK 17JB cy trong canh thang nóo tim bũ, nhit 37 0 C/24 gi. Sau ú, ly huyn dch ny cy lờn mụi trng thch mỏu cu 5% v thch dinh dng, nhit 37 0 C/24 gi. + Ly khun lc in hỡnh nhum soi di kớnh hin vi xỏc nh hỡnh th v kim tra tớnh cht sinh vt hoỏ hc, tớnh c ca VK bng cỏc mụi trng thch bỏn lng, catalase, ng (salicin, glucose, sacarose, manitol, arabinose). + Ly 01 khun lc hũa vo týp 10 ml dung dch NaCl 0,85% t nng McFarland 0,5 (tng ng 1 - 1,5 x 10 8 VK/ml) c coi l huyn dch ban u cho th nghim. Huyn dch ny tip tc pha loóng bc 10 c cỏc nng 10 0 , 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 . - Tin hnh th nghim trờn ng vt. - Chn chut nht khe mnh, trng lng chut 18 - 20g/con v nuụi cỏch ly 5 ngy trc th nghim v cho n ung y , c bit ch vitamin. - S lng chut s dng: 100 con. + Chut tớnh liu gõy c (LD 50 ): 40 con, chia 5 nhúm, tiờm cỏc liu gõy c sau: 10 1 , 10 0 , 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 . + Nhúm chut ỏnh giỏ hiu lc KHT: 60 con, chia thnh 4 nhúm: Nhúm 1: tiờm liu 2 x LD 50 . Nhúm 2: tiờm liu 4 x LD 50. Nhúm 3: tiờm liu 8 x LD 50 . Nhúm 4: tiờm liu 10 x LD 50. + Cỏch tiờm: tiờm di da vựng ựi bn. + Liu tiờm: nhúm tiờm tớnh liu gõy c: 1 ml/con. + Nhúm ỏnh giỏ hiu lc bo v ca KHT: 05 con tiờm 1 ml liu c + 1 ml KHT nng c. 05 con tiờm 1 ml liu c + 1 ml KHT nng pha loóng 1/2 05 con tiờm 1 ml liu gõy c + 1 ml NaCl 0,85%. - Thi gian theo dừi: . Nhúm tớnh liu gõy c: ngy th 3 n ngy th 14. . Nhúm ỏnh giỏ hiu lc: chm súc v theo dừi chut cho n ngy th 10, theo dừi tỡnh trng sc khe. * Tiờu chun ỏnh giỏ: theo tiờu chun ca Dc in Vit Nam III v T chc Y t Th gii [1, 3]. ỏnh giỏ hiu lc bo v ca KHT khỏng B. anthracis tinh ch da trờn nguyờn lý phn ng trung ho in vivo ca liu VK vi cỏc pha loóng KHT than v kt qu chut sng sau khi th nghim. Kết quả nghiên cứu và bàn luận 1. Kt qu ỏnh giỏ an ton. Thc t khụng cú KHT no c coi l tuyt i an ton. Cỏc phn ng ph cú th xy ra v i mt t l nht nh trong s nhng cỏ th dựng KHT. Vỡ th, tớnh an ton ca KHT cn c kim tra bng th nghim in vivo. õy, chỳng tụi ó ỏp dng th nghim tng trọng của chuột [2, 4]. Thử nghiệm này có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố không liên quan đến KHT như chủng loại chuột sử dụng, điều kiện nuôi dưỡng chăm sóc. Vì thế, ®· sử dụng 02 nhóm chứng và 02 chủng loại chuột khác nhau. Sau khi tiêm KHT kháng B. anthracis tinh chế vào chuột lang và chuột nhắt, theo dõi trong 14 ngày tại phòng nuôi động vật thí nghiệm, kết quả cho thấy: chuột sống khỏe mạ nh và không có dấu hiệu bệnh lý (100%) - Trọng lượng chuột tăng so với trọng lượng ban đầu (hình 1 và 2): 240 250 260 270 280 290 300 01234567891011121314 Ngày theo dõi Trọng luợng Tiêm KHT Tiêm NMSL Không tiêm (g) H×nh 1: Theo dâi chuét lang thö tÝnh an toµn cña kh¸ng huyÕt thanh tinh chÕ. 240 250 260 270 280 290 300 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ngày theo dõi Trọ ng luợ ng Tiêm KHT Tiêm NMSL Không tiêm (g)_ H×nh 2: Theo dâi chuét nh¾t thö tÝnh an toµn cña kh¸ng huyÕt thanh tinh chÕ. 44 So vi nhúm chut khụng tiờm, nhúm tiờm nc mui sinh lý v KHT u gim trng lng sau khi tiờm th nghim. õy l phn ng thụng thng ca ng vt th nghim sau khi tiờm. ở nhúm tiờm KHT, trng lng chut gim nhiu hn. Hin tng ny cú th do nh hng ca cỏc thnh phn trong KHT. Tuy nhiờn, sang ngy th 4, trng lng ca chut ở c 2 nhúm tiờm u tng tr li, iu ny chng t quỏ trỡnh tiờm th nghim t hiu qu. Vi kt qu thu c v theo tiờu chun ỏnh giỏ ca Dc đin Vit Nam [2] v T chc Y t Th gii [4], KHT khỏng B. anthracis tinh ch ny m bo tớnh an ton trờn ng vt thc nghim. 2. Kết quả đỏnh giỏ hiu lc bo v ca KHT tinh ch. * Liu gõy c (LD 50 ): tiờm cỏc liu gõy c vi nhng nng khỏc nhau, thu c kt qu: Bng 1: Tiờm chut tớnh liu gõy c LD 50 . tỷ lệ chết nồng độ liều gây độc số chuột sống số chuột chết Tỷ s Phn trm (%) 10 1 0 8 8/8 100 10 0 3 5 5/8 62,5 10 -1 7 1 7/8 12,5 10 -2 8 0 0/8 0 10 -3 8 0 0/8 0 LD 50 vo khong gia nng pha loóng 10 0 v 10 -1 VK, phn trm cht tng ng vi liu sỏt trờn 50% l 62,5%, phn trm tng ng liu sỏt di 50% l 12,5%. Tớnh toỏn bng Spearman - Kọrber [8] thỡ LD 50 titer = 10 -1,33 . * ỏnh giỏ hiu lc bo v: xỏc nh s chut tiờm liu gõy cht + KHT tinh ch cũn sng ỏnh giỏ hiu lc bo v ca KHT. Bng 2: Theo dừi chut sau tiờm liu gõy c LD 50 v 1 ml KHT pha loóng nng 1/2 . liều tiêm số lợng chuột số chuột sống tỷ lệ chuột sống/số chuột thí nghiệm 2 x LD 50 5 2 2/5 4 x LD 50 5 0 0 8 x LD 50 5 0 0 10 x LD 50 5 0 0 Từ hiệu giá của KHT sử dụng là 1/640, tiến hành tiêm liều KHT pha loãng 1/2 với các liều gây độc đã định trước. Kết quả bảng 2 cho thấy, chỉ duy nhất nhóm tiêm liều gây độc 2 x LD 50 có chuột còn sống. Tuy nhiên, số chuột sống sót ở nhóm này chỉ đạt 40%. Do vậy, sử dụng liều tiêm KHT pha loãng 1/2 là không có tác dụng bảo vệ. Bảng 3: Theo dõi chuột sau tiêm liều gây độc và 1 ml KHT tinh chế hiệu giá 1/640. liÒu tiªm sè chuét thö nghiÖm sè chuét sèng sãt 2 x LD 50 5 5 (100%) 4 x LD 50 5 5 (100%) 8 x LD 50 5 5 (100%) 10 x LD 50 5 5 (100%) 100% số chuột tiêm KHT không pha loãng với các liều gây độc khác nhau đều sống, không có biểu hiện bệnh lý đến ngày thứ 10 của thử nghiệm. Điều đó chứng tỏ KHT hiệu giá 1/640 có tác dụng bảo vệ với các liều gây độc đã tiến hành trong thử nghiệm. KÕt luËn KHT chống VK than tinh chế hiệu giá 1/640 do Học viện Quân y và Công ty Vắcxin Pasteur Đà Lạt sản xuất đảm bảo tính an toàn trên động vật thực nghiệm và có hiệu lực bảo vệ ở liều gây chết 10 x LD 50 của chủng VK độc lực B. anthracis 17JB. Tµi liÖu tham kh¶o 1. Dược điển học Việt Nam. Xuất bản lần 3. 2003. 2. Nguyễn Thị Lan Phương. Thẩm định thử nghiệm sinh học áp dụng trong kiểm định vắcxin và huyết thanh. Tạp chí Y học Dự phòng. 2003. Tập XIII, số 6 (63), tr.108-112. 3. General requirements for the sterility of biological substances (Requirements for Biological substances No.6, revised 1973). In: WHO. Expert Committee on Biological Standardization. Twenty-fifth report. Geneva, World Health Organization, 1973 (WHO Technical Report Series, No. 530); and Amendment 1995 in WHO Expert Committee on Biological Standardization. Forty-sixth report. Geneva, World Health Organization, 1998 (WHO Technical Report Series, No 872). 4. Shirin S, Ramona D., Stephen R and et al. Inhalation anthrax: Epidemiology, diagnosis, and management. CHEST. 1999. 5. Friedlander A.M, and Parker G.W Anthrax vaccine: evidence for safety and efficacy against inhalational anthrax. JAMA. 1999. 282: 2104-2106. 6. World Health Organization (WHO). Emerging and other communicable diseases, surveillance and control. Guidelines for the surveillance and control of anthrax in humans and animals. WHO Doc. No. WHO/EMC/ZDI/98.6. Geneva: WHO; 1998. Available at: http://www.who.int/emc-documents/ zoonoses/docs/whoemczdi986.html. Accessed October 11, 2001. 7. F. X Mesline, M.M. Kaplan, H.Koprowski. Laboratory techniques in rabies. 4th edition. WHO Geneva. 1996. Testing the safety and potency of vaccines. . than tinh chế hiệu giá 1/640 do Học viện Quân y và Công ty Vắcxin Pasteur Đà Lạt sản xuất đảm bảo tính an toàn trên động vật thực nghiệm và có hiệu lực bảo vệ ở liều g y chết 10 x LD 50 của. c lc B. anthracis 17JB. * T khúa: Khỏng huyt thanh chng bnh than; Tớnh an ton; Hiu lc bo v. Evaluation of Safety and Potency of the Bacillus anthracis antisera in the experimental animals. chứng và 02 chủng loại chuột khác nhau. Sau khi tiêm KHT kháng B. anthracis tinh chế vào chuột lang và chuột nhắt, theo dõi trong 14 ng y tại phòng nuôi động vật thí nghiệm, kết quả cho th y: