BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ ÚT VI NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ PHÁT SINH LOÀI CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.) TẠI VÙNG BIỂN NAM TRUNG BỘ VIỆT NAM DỰA VÀO CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Nha Trang, tháng năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ ÚT VI NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ PHÁT SINH LOÀI CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.) TẠI VÙNG BIỂN NAM TRUNG BỘ VIỆT NAM DỰA VÀO CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Công nghệ sinh học GVHD: TS ĐẶNG THÚY BÌNH Nha Trang, tháng năm 2012 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp: Trước hết xin gửi tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Bộ môn Công nghệ sinh học Mơi trường, Phịng đào tạo - Trường Đại học Nha Trang kính trọng, lịng biết ơn, tự hào học tập nghiên cứu trường năm qua Đặc biệt xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình, người tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu thực đồ án Tôi xin chân thành cảm ơn cô Văn Hồng Cầm cô Nguyễn Thị Anh Thư góp ý giúp đỡ tơi kĩ thuật thao tác Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ sinh học, thầy phụ trách phịng thí nghiệm dẫn, dạy bảo suốt thời gian học tập trình thực đồ án tốt nghiệp Và tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người thân quan tâm, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho tơi thực đồ án Vì kiến thức thời gian có hạn nên luận văn tốt nghiệp tơi khơng tránh khỏi thiếu sót, tơi mong góp ý thầy giáo để luận văn tơi hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn ! Cuối cùng, tơi xin kính chúc người sức khỏe, hạnh phúc thành công ! Nha Trang, tháng năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Út Vi ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi LỜI MỞ ĐẦU vii Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Tổng quan ốc cối (Conus spp) 1.1.1 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm phân bố 1.1.4 Đặc điểm sinh học , sinh sản 1.1.5 1.2 Phân loại .1 Chế độ dinh dưỡng phương thức săn mồi Tổng quan vùng nghiên cứu 10 1.2.1 Đặc điểm vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên sinh thái môi trường đảo Cù Lao Chàm ven bờ Quảng Nam 10 1.2.2 Đặc điểm vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên, sinh thái môi trường đảo Lý Sơn ven bờ Quảng Ngãi .12 1.2.3 Đặc điểm điều kiện tự nhiên sinh thái môi trường ven biển Sông Cầu, Phú Yên .13 1.2.4 Đăc điểm điều kiện tự nhiên sinh thái mơi trường vịnh Vân Phong, Khánh Hịa 14 1.3 Các nghiên cứu di truyền 15 1.3.1 Giới thiệu hệ gen ti thể .15 1.3.2 Ứng dụng thị ti thể thị nhân phân loại xây dựng hệ thống phát sinh loài ốc cối 19 iii 1.3.3 Nghiên cứu di truyền ốc cối 20 1.3.3.1 Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa .20 1.3.3.2 Mối liên hệ phát sinh loài chế độ dinh dưỡng (Conus spp.) .23 1.3.3.3 Nghiên cứu di truyền ốc cối Việt Nam 24 Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng địa điểm thu mẫu 26 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.3 Tách chiết DNA 28 2.3.1 Tách chiết DNA với kít Wizard SV genomic DNA purification System .28 2.3.2 2.3.3 2.4 Chuẩn bị gel agarose 28 Điện di đọc kết 29 Phản ứng PCR .29 2.4.1 2.4.2 2.5 Cơ sở lý thuyết .29 Tiến hành thực nghiệm 30 Giải trình tự gen 32 2.5.1 2.5.2 2.6 Cơ sở lý thuyết .32 Phương pháp tiến hành 32 Xử lí số liệu xây dựng phát sinh loài 33 Chương 3: Kết thảo luận 3.1 Kết .38 3.1.1 Đặc điểm hình thái 38 3.1.2 Tách chiết DNA tổng số 40 3.1.3 Khuếch đại gen 12S mtDNA calmodulin 41 3.1.4 So sánh trình tự gen 12S mtDNA Calmodulin (DNA gen) 42 3.1.5 Xây dựng phát sinh loài 43 iv 3.2 Thảo luận .51 3.2.1 Sự khác biệt trình tự gen nhóm lồi ốc cối phân loại 51 3.2.2 Mối quan hệ loài ốc cối dựa thị phân tử 12S mtDNA Calmodulin nDNA .52 3.2.3 Mối quan hệ loài chế độ dinh dưỡng 56 Chương 4: Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận 60 4.2 Kiến nghị 61 Tài liệu tham khảo 62 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các genome ti thể có gen mã hóa cho RNA protein 18 Bảng 2.1: Trình tự đoạn mồi sử dụng phản ứng PCR 31 Bảng 2.2: Mã số trình tự gen 12S mtDNA, Calmodulin (DNA nhân) chế độ ăn loài ốc cối nghiên cứu từ Genbank 34 Bảng 3.1: Tỷ lệ tương đồng (khác biệt) di truyền loài ốc cối dựa gen 12S mtDNA … 42 Bảng 3.2: Tỷ lệ tương đồng (khác biệt) di truyền loài ốc cối dựa gen Calmodulin 42 Bảng 3.3: Các nhóm lồi ốc cối phân loại 12S mtDNA Calmodulin nDNA từ phương pháp MP BI Các loài giống in đậm KXĐ: loài vị trí khơng xác định Nhóm phân loại dựa theo chế độ ăn (V: ăn giun biển, M: ăn nhuyễn thể, P: ăn cá, U: chưa biết ) 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái vỏ số lồi ốc cối giới Việt Nam Hình 1.2: Cấu tạo bên ngồi ốc cối thơng số hình thái Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác ốc cối (Conus spp.) .3 Hình 1.4: Cấu tạo bên ốc cối Hình 1.5: Một số loài ốc cối phân bố Việt Nam Hình 1.6: Vịng đời ốc cối Hình 1.7: Phương thức săn mồi theo dạng móc câu ốc cối Hình 1.8: A Ốc cối sử dụng súc tu (siphon) để tìm kiếm vịi hút (proboscis) để cơng mồi (cá); B Conus textile săn mồi theo dạng móc câu Hình 1.9: Phương thức bắt mồi dạng lưới ốc cối .9 Hình 1.10: Conus striatus phát mồi nhờ súc tu (siphon) 10 công mồi (cá) 10 Hình 1.11: DNA ti thể người, bao gồm 22 gen tRNA, gen rRNA, 13 vùng mã hóa protein Mũi tên vùng gen sử dụng nghiên cứu 16 Hình 2.1: Các địa điểm thu mẫu ốc cối Conus spp 26 Hình 2.2: Quy trình bố trí thí nghiệm Hình 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 30 Hình 3.1: Hình thái vỏ loài ốc cối phân bố biển Việt Nam 38 Hình 3.2: Kết điện di DNA tổng số mẫu ốc cối 40 Hình 3.3: Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen 12S mtDNA mẫu ốc cối 41 Hình 3.4: Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen Calmodulin số mẫu ốc cối 41 Hình 3.5: Cây phát sinh loài dựa gen 12S mtDNA ốc cối thu vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam 49 vii Hình 3.6: Cây phát sinh loài dựa gen calmodulin ốc cối thu vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam 50 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BI Bayesian Interence BT Bootstrap Calmodulin CALcium – MODULated proteIN CO1 Cytochrome c oxidase subunit DNA Deoxyribonucleic acid M Molluscivorous MP Maximum Parsimony mtDNA Mitochondrial DNA nDNA Nuclear DNA P Piscivorous PCR Polymerase chain reaction PP Posterior Probability rDNA ribosomal DNA RNA Ribonucleic acid V Vermivorous viii LỜI MỞ ĐẦU Ốc cối họ động vật thân mềm thuộc loài ăn thịt, có nọc độc, sống chủ yếu vùng nước nơng nhiệt đới Ở Việt Nam có 76 lồi (Hylleberg Kilburm, 2003) khoảng 500 – 700 loài ghi nhận toàn giới (Nam cs, 2009) Vỏ lồi ốc cối có màu sắc hoa văn đẹp nên thường khai thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ, vật phẩm lưu niệm nguồn thực phẩm cao cấp số quốc gia Vanuatu, New Caledonia, Philippines Ngoài ra, ốc cối nguồn nguyên liệu sản xuất loại thuốc chữa đau mạn tính, bệnh động kinh, bệnh tim mạch, rối loạn tâm thần, rối loạn vận động, ung thư đột quỵ (McIntosh Jones, 2001) (Olivera, 2002; Terlau Olivera, 2004; Puillandre cs, 2010) Các nghiên cứu lâm sàng cận lâm sàng cho thấy độc tố ốc cối có hiệu giảm đau cao gấp 10.000 lần so với morphin mà không gây nghiện phản ứng phụ - điều khó tránh khỏi với tất loại thuốc giảm đau (Olivera, 1990) Vì lợi ích kinh tế y học mà tình trạng khai thác bừa bãi loài ốc cối ngày gia tăng Vì vậy, địi hỏi nỗ lực nhà môi trường biển, nhà khoa học chủ trương, sách hợp lý Nhà nước để bảo tồn kịp thời, khai thác hợp lý phát triển cách bền vững, đắn nguồn tài nguyên Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu đa dạng loài ốc cối Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu ốc cối khảo sát, thu thập mẫu (Hylleberg Kilburm, 2003), phân loại, mơ tả đặc điểm hình thái giải phẫu (Nguyễn Ngọc Thạch, 2002), xác định độc tính kiểm chứng tính chất số độc tố (http://www.vnio.org.vn/) Ngô Đăng Nghĩa cs (2010) tiến hành khảo sát, phân loại, mơ tả đặc điểm hình thái, xây dựng mối quan hệ tiến hóa khảo sát độc tính lồi ốc cối thu vùng biển Nam Trung Bộ Đặng Thúy Bình cs (2011) nghiên cứu đa dạng sinh học, đặc điểm di truyền mối quan hệ tiến hóa lồi ốc cối (Conus spp.) vùng ven biển Nam Trung Bộ, Việt Nam Trong đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ loài ốc cối vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam dựa vào thị phân tử 12S mtDNA Calmodulin” 52 24,1% (C miliaris (M)/C ebraus (V)) - 35,1% (C miliaris (M)/C lividus (V)) Điều thể lồi có chế độ dinh dưỡng khác tỉ lệ khác biệt di truyền cao loài có chế độ dinh dưỡng So sánh khác biệt di truyền lồi phân tích 12S calmodulin (bảng 3.1 bảng 3.2) ta thấy, nhiều lồi phân tích Calmodulin có tỉ lệ khác biệt di truyền thấp lồi phân tích 12S Ví dụ, khác biệt di truyền hai lồi C betulinus – C carracteriscus 7,4%, khác biệt di truyền hai loài C tulipa - C geographus 2,7% Trong đó, tỉ lệ khác biệt C betulinus – C carracteriscus; C tulipa - C geographus phân tích 12S 15,4% 7,3% Điều cho thấy gen 12S thể mức độ tiến hóa cao gen calmodulin 3.2.2 Mối quan hệ loài ốc cối dựa thị phân tử 12S mtDNA Calmodulin Chọn lọc tự nhiên xảy tuyệt chủng đa dạng hóa lồi bị ảnh hưởng khác biệt mặt di truyền tính trạng mức độ lồi Cụ thể, vùng phân bố địa lí tiềm di chuyển gen quần thể bị ảnh hưởng khả phân tán loài Các loài sinh vật biển hạn chế khả phát tán loài thường có vùng phân bố hẹp, cấu trúc quần thể khơng đồng so với lồi có mức độ phát tán cao Thông thường, thay đổi đột ngột mức độ địa phương có nhiều khả loại bỏ loài với vùng phân bố giới hạn Các loài có ấu trùng khơng phát tán thường đối mặt với tuyệt chủng nhiều so với lồi có giai đoạn ấu trùng trôi (Duda Palumbi, 1999) Phân loại ốc cối thơng thường dựa vào kích thước vỏ, kiểu, hoa văn màu sắc hay vân vỏ, cụ thể đường gờ hay phần lồi vỏ (Kohn cs, 1999) Bên cạnh tiêu quan trọng mô tả dải kitin loài ốc (Frankin cs, 2007, Duda cs, 2009) Tuy nhiên, việc định danh loài ốc cối mẫu sống thường gặp nhiều khó khăn biến dị liên quan đến điều kiện tự nhiên khu vực phân bố, biến dị cá thể Hơn nữa, lớp nhầy bọc vỏ ốc (periostracum) thường đục bao phủ toàn vỏ khiến vân màu sắc 53 đường gờ vỏ bị che khuất Việc loại bỏ lớp bao KOH (hoặc NaOH) ảnh hưởng đến vân màu áp dụng mẫu vật sống Mẫu vật thường xuyên thiếu vỏ ấu trùng vân màu nhạt hẳn Đặc điểm hình thái chịu tác động mơi trường, biến dị cá thể lồi (intraspecific) khác loài (interspecific), dễ gây nhầm lẫn trình phân loại Khơng có thành phần độc tố đặc trưng cho loài, biến dị liên quan đến vùng địa lí năm sinh sống ghi nhận (e.g Bingham cs, 1996) Chính vậy, hệ thống phân loại ốc cối nhiều tranh cãi (Duda cs, 2009) Hiện thị phân tử sử dụng rộng rãi ngày đóng vai trị quan trọng nghiên cứu định danh loài, mối quan hệ tiến hóa di truyền quần thể (Blaxter 2003, 2004; Hebert et al 2003a,b; Stoeckle, 2003) Chỉ thị phân tử sử dụng chủ yếu gen hệ gen DNA ti thể (COI 16S mtDNA (Duda Rolan, 2005; Duda Kohn, 2005; Nam cs, 2009); 12S, tRNA-Val, cytochrome b (cytb) (Cunha cs, 2008); vùng liên gen coxI/coxII (Bandyopadhyay cs, 2008), hệ gen nhân (Duda Palumbi, 2004); ITS2 (Nam cs, 2009); megalin - like gene (Cunha cs, 2008), calmodulin (Duda Kohn, 2005), kết hợp thị (Duda Palumbi, 2004; Cunha cs, 2008; Nam cs, 2009) Hơn nữa, nghiên cứu thời gian gần tập trung giải hình thức tiến hóa (Duda Palumbi, 1999, 2004), nguồn gốc phát sinh mối quan hệ tiến hóa lồi (Duda Rolan, 2005), phân hóa ốc cối theo vùng địa lí (Duda Kohn, 2005; Cunha cs, 2008) theo hình thái vỏ lấy mơ hình quần đảo phân tách Cape Verde trung tâm Đại Tây Dương (Cunha cs, 2005) Các phân tích cho thấy tất lồi ốc cối hình thành nhánh tách biệt phân hóa từ nhóm toxoglossate loài Conacea (bao gồm lớp Tumidae Terebridae) Điều cung cấp liệu cho thấy ốc cối giống đồng dạng (Cunha cs, 2005) 54 Theo Duda Kohn (2005) loài ốc cối (138 lồi) vùng biển Ấn Độ Thái Bình Dương (IP), Đơng Thái Bình Dương (EP) Tây Đại Tây Dương (WA) cháu từ hai nhánh phân hóa nhât cách 33 triệu năm Dựa phân bố địa lí, nhóm bắt nguồn từ vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương (nhóm lớn) nhóm thuộc khu vực Đơng Thái Bình Dương Tây Đại Tây Dương (nhóm nhỏ) Các nhánh thức khác đáng kể kích thước thành phần lồi từ khu vực địa lí khác Trong nghiên cứu tại, thị 12S mtDNA phân chia lồi ốc cối thành nhóm riêng biệt (6 nhóm, hình 3.6) Một số nhóm lồi phù hợp với nghiên cứu trước đó, ví dụ loài ốc ăn nhuyễn thể C bandanus/C marmoreus; C textile/C ammiralis/C gloriamaris (thuộc nhóm Cylinder (Montfort, 1810)); C aulicus/C crocatus/C episcopatus/C omaria C furvus (thuộc nhóm Darioconus (Iredale, 1930) phân chia nhánh (Espiritu cs, 2001; Duda Kohn, 2005; Nam cs, 2009) Các lồi ốc ăn cá nhóm chung với (nhóm IV nhóm V, hình 3.6) Hai lồi C miles/C quercinus (V) thể mối quan hệ gần gũi (Espiritu cs,2001; Duda Kohn, 2005) Tuy nhiên, hai loài lại xếp chung vào nhánh với loài vừa ăn cá vừa ăn giun biển (C capitaneus, C striatus) Trong nhóm I.1 (Conus tessulatus, C betulinus, C carracteriscus, C arenatus) loài ăn giun biển, có C ebuneus ốc ăn cá, cho thấy hai phương thức dinh dưỡng có quan hệ tiến hóa Theo Duda Kohn (2005) chế độ ăn cá ốc cối có nguồn gốc từ lồi ăn giun biển (các loài ăn giun biển thường nằm gốc tiến hóa xem phương thức tổ tiên) phương thức dinh dưỡng hỗn hợp Lồi C californicus có phương thức dinh dưỡng đa dạng, ăn cá, nhuyễn thể, giun biển chí giáp xác (Stewward and Gilly, 2005) Ốc cối biết đến giống có phương thức dinh dưỡng riêng biệt liên quan chặt chẽ đến hình thành độc tố tiến hóa, phân tích dựa thị 12S mtDNA thể tương đối rõ mối quan hệ tiến hóa ốc cối mối liên hệ phát sinh loài phương thức dinh dưỡng 55 So sánh với phát sinh loài dựa gen 12S mtDNA Nam cs (2009), phân tích khơng thể làm sáng tỏ mối quan hệ loài ăn nhuyễn thể tách gần Nhưng phát sinh loài từ gen 12S nghiên cứu tại, nhóm ăn nhuyễn thể (nhóm II, hình 3.5) phân tách rõ ràng Tuy nhiên, hai phát sinh lồi có tương đồng thành phần lồi nhóm ăn cá ăn giun biển Ví dụ phân tích Nam cs (2009) nhóm ăn cá (P) (C aurisiacus, C stercusmuscarum) nhóm ăn giun biển (V) (C parius, C radiatus, C laterculatus) giống với nhóm V (P) nhóm I.2 (V) phân tích So sánh với phát sinh loài xây dựng dựa gen CO1 mtDNA Lê Thị Bích Hảo (2011), có tương đồng thành phần lồi chế độ dinh dưỡng nhóm Cụ thể, nhóm (V), nhóm (M), nhóm (P) phát sinh loài từ gen CO1 giốngvới nhóm III (V), nhóm II (M), nhóm IV (P) phát sinh loài từ 12S mtDNA Chỉ thị phân tử Calmodulin cho thấy mối quan hệ rõ ràng với nhánh phân tách tiến hóa có tương quan với phương thức dinh dưỡng (8 nhóm lồi, với nhóm ăn cá (I, III); nhóm ăn giun biển (II, V, VI, VIII); nhóm ăn nhuyễn thể (IV); nhóm VII gồm C furvus loài ăn nhuyễn thể C litteratus loài ăn giun biển Tuy nhiên, phân tích Duda cs (2001) C furvus loài ăn giun biển Có thể nói C furvus lồi có chế độ dinh dưỡng kết hợp, vừa ăn nhuyễn thể vừa ăn giun biển Và hai lồi vị trí không xác định C imperialis (ăn giun biển), C terabra (ăn nhuyễn thể) Duda cs (2001) sử dụng gen camodulin để xây dựng phát sinh lồi Kết cho thấy có nhiều điểm tương đồng với phân tích Cụ thể, từ tiến hóa Duda cs (2001), nhiều nhóm ăn cá, ăn nhuyễn thể ăn giun biển có thành phần lồi tương tự với nhóm nghiên cứu Nhóm ăn cá F1, F2 (hình 2) giống với nhóm III (P) nhóm I (P) (hình 3.6) Nhóm ăn nhuyễn thể M1(hình 2) có C aureus, C textile, C legatus, C omaria, C 56 bandanus giống với nhóm IV (M) (hình 3.6) Nhóm ăn giun biển H1, S3, E6 có thành phần lồi giống với nhóm VI, VII, V (hình 3.6) Đặc biệt, phân tích gen 12S, hai nhóm ăn cá (nhóm V, IV, hình 3.5) (trong nhóm IV có lồi C striatus vừa ăn cá vừa ăn giun biển, C tulipa vừa ăn cá vừa ăn nhuyễn thể) nhóm gần gốc tiến hóa, phía đầu tiến hóa có hai lồi C tessulatus C eburneus loài vừa ăn cá vừa ăn giun biển Cịn phân tích gen calmodulin, nhóm ăn cá lại nằm phía tiến hóa (nhóm I nhóm III, hình 3.6), nhóm phân hóa (điều giống với phân tích gen calmodulin Duda cs, 2001) Ở nhóm V (V) có lồi C capitaneus lồi vừa ăn cá vừa ăn giun biển Các loài ốc ăn cá có đa dạng hóa chế độ dinh dưỡng q trình tiến hóa Những nghiên cứu sau cho thấy lồi kết hợp săn mồi cá, nhuyễn thể giun biển giai đoạn sống chúng Trong phát sinh lồi từ gen CO1 Đặng Thúy Bình cs (2011), nhóm lồi ốc ăn cá phát nhóm (nằm đầu tiến hóa) nhóm (nằm gốc tiến hóa) Sự xuất hai nhánh loài ăn cá cho thấy phân tách chuyên biệt hóa chế độ dinh dưỡng xảy lần trình tiến hóa chúng 3.2.3 Mối quan hệ lồi chế độ dinh dưỡng Ốc cối (Conus spp.) giống có thành phần lồi phong phú thuộc lớp chân bụng với 500 lồi có số lồi bị tuyệt chủng (Rưckel cs, 1995) Mặc dù hình thái vỏ có thay đổi, loài Conus khác lịch sử sống tiến hóa hay thuộc tính sinh thái đặc biệt chế độ dinh dưỡng khu vực sinh sống (Duda cs, 2001) Chế độ dinh dưỡng biết đến lồi hầu hết thuộc nhóm cá, động vật thân mềm giun biển Ở khu vực Tây Ấn Độ - Thái Bình Dương, nơi giống nghiên cứu nhiều nhất, chế độ dinh dưỡng phân hóa rõ rệt Phần lớn (70%) lồi ốc cối thuộc nhóm ăn giun biển (polychaete) giảm dần nhóm ăn động vật thân mềm cá Chế độ ăn chúng đa dạng, cụ thể nhóm ăn giun biển lại gồm có nhóm ăn giun biển vận động nhiều (errant polychate) (gồm Eunicidae, Nereidae, Amphinomidae 57 Glyceridae) nhóm ăn giun biển vận động (gồm Terebellidae, Capitellidae, Maldanidae Cirratulidae) Một vài loài ăn hemichordates loài ăn echiurans Mặc dù chế độ dinh dưỡng đa dạng mức độ giống lồi lại có xu hướng chun biệt hóa chế độ dinh dưỡng khác nhau, nhiên ốc cối hầu hết săn loại mồi thuộc nhóm liệt kê Bên cạnh chế độ ăn vài lồi mở rộng nhiều đối tượng tùy theo giai đoạn sống Conus calofornicus ngoại lệ đáng ý với chế độ dinh dưỡng đa dạng biết đến loài ốc cối Chế độ ăn C californicus bao gồm cá, động vật thân mềm (bao gồm hai mảnh vỏ chân bụng), giun biển động vật giáp xác (Kohn, 1966) Hơn nữa, C bullatus quan sát thấy ăn cá động vật thân mềm hai mảnh vỏ (Mcdowall, 1974 trích dẫn Rưckel cs, 1995) Ngoài ra, số loài ăn giun biển bao gồm C arenatus, C.miliaris, C lividus C sponsalis ghi nhận săn mồi giun biển di chuyển vận động hemichordates vị trí địa lí khác C eburneus C tesulatus (vốn lồi ăn giun biển) đơi săn mồi loài cá (Duda cs, 2001) Duda cs (2001) tiến hành nghiên cứu nguồn gốc chế độ ăn ốc cối dựa marker phân tử 16S, Calmodulin kết hợp hai gen Kết từ tiến hóa cho thấy nhóm lồi ốc cối ăn nhuyễn thể ăn cá nhóm thành nhóm dựa liệu Calmodulin liệu kết hợp calmodilin 16S (nhánh M1 F1- F3, hình 3), đó, mối quan hệ khơng thể rõ ràng phân tích 16S (nhánh M1.1 F1.1, hình 1) Nhóm lồi ăn giun biển di chuyển phân bố hầu hết tiến hóa (nhánh A1, E1-E6), nhóm tác giả đến kết luận chế độ ăn giun biển di chuyển (errant polychaetes) phương thức dinh dưỡng cổ xưa Sự chuyển hóa chế độ ăn dựa loài nhuyễn thể khác chuyển chế độ ăn họ giun biển khác Terebellidae, Nereidae, Amphinomidae tiến hóa riêng biệt có lẽ lần, chuyển hóa chế độ ăn lồi cá có 58 thể xuất đến lần Sự khác biệt trình tự gen cho thấy phân hóa chế độ ăn ốc cối xuất kỷ Miocene tồn ngày Nam cs (2009) sử dụng kết hợp thị phân tử DNA ti thể DNA riborome (16S, 12S, COI mtDNA ITS rDNA) để xem xét mối quan hệ tiến hóa lồi ốc ăn nhuyễn thể Có nhánh xác định nhóm 12 lồi ốc ăn nhuyễn thể Conus (marmoreus bandanus) có quan hệ gần gũi với nhánh Cylinder (Montfort, 1810; textile, ammiralis, dalli gloriamaris) nhánh Darioconus (Iredale, 1930), clades (aulicus, croatus, episcopatus, omaria furvus) Trong phân tích 12S mtDNA gồm lồi ăn polychaete (giun biển, kí hiệu vermivorous (V)), lồi thuộc nhóm ăn nhuyễn thể (molluscivorous (M)) Conus bandanus, Conus marmoreus, Conus textile; loài ăn cá (piscivorous (P)) Conus achatinus loài vừa ăn cá vừa ăn giun biển (P+V) Conus capitaneus, Conus magus, Conus striatus, Conus tessulatus Cây phát sinh loài từ thị 12S thể tương đối rõ mối quan hệ tiến hóa ốc cối mối liên hệ phát sinh loài phương thức dinh dưỡng Trong nghiên cứu tại, Conus (marmoreus bandanus) có quan hệ gần gũi với nhánh Cylinder (Montfort, 1810; C textile/C ammiralis/C gloriamaris), nhánh Darioconus (Iredale, 1930; C aulicus/C crocatus/C episcopatus/C omaria C furvus) nhóm vào nhóm (nhóm II) Điều phù hợp với nghiên cứu Nam cs (2009) Các loài ăn giun biển thuộc nhóm I, III, VI; nhóm IV, V gồm loài ăn cá Một số loài C magus, C consor, C achatinus, C bullatus có vị trí khơng xác định phân lồi chúng nhóm gần có chế độ dinh dưỡng ăn cá Không giống phát sinh loài từ gen 12S (nghiên cứu tại), phát sinh loài từ thị CO1 mtDNA Lê Thị Bích Hảo (2011), lồi ăn nhuyễn thể lại phân thành nhóm Nhánh Cylinder (Montfort, 1810; C.textile, C ammiralis), nhánh Darioconus (Iredale, 1930; C aulicus/C crocatus/C omaria C furvus) nhóm chung vào nhóm 3, nhóm Conus (marmoreus 59 bandanus) nhóm chung với loài C eburneus, C betulinus (ăn giun biển), C ebraeus C miliaris nhóm Nhưng có tương đồng thành phần lồi chế độ dinh dưỡng nhómăn cá ăn giun biển Cụ thể, nhóm (V), nhóm (P) phát sinh loài từ gen CO1 giống với nhóm III (V), nhóm IV (P) phát sinh loài từ 12S mtDNA Chỉ thị Calmodulin cho kết rõ ràng phát sinh chủng loại Các nhóm lồi ốc cối với chế độ dinh dưỡng tương đồng nhóm vào nhóm riêng biệt (hình 3.7) Các lồi ốc ăn nhuyễn thể C textile, C legatus, C omaria, C bandanus, C miliaris, C sponsalis nhóm lại thành nhóm (nhóm IV), nhóm lại có Conus ebraeus ăn giun biển Nhóm I nhóm III nhóm lồi ăn cá Cũng giống với phân tích Duda cs (2001), loài ốc cối ăn giun biển phân bố tiến hóa (nhóm II, V, VI, VIII) chứng tỏ phương thức săn mồi phương thức săn mồi tổ tiên So sánh với kết nghiên cứu Phạm Thu Thủy cs (2010), Duda cs (2001), Đặng Thúy Bình cs (2011) có tương đồng lồi thuộc nhóm ăn giun biển phân bố nằm gốc tiến hóa (ở phân lồi dựa gen 12S Calmodulin) Điều cho thấy, nhóm ăn giun biển nhóm tiến hóa cổ xưa nhất, phù hợp với nghiên cứu trước Trong nghiên cứu tại, phân loài dựa gen 12S ta thấy nhóm lồi ăn cá (nhóm V, IV) nhóm gần gốc tiến hóa (hình 3.6) cịn phân lồi dựa gen calmodulin, nhóm ăn cá lại nằm phía tiến hóa (nhóm I nhóm III, hình 3.7), thấy lồi ốc ăn cá phân hóa hai lần q trình tiến hóa Điều có tương đồng với phân tích Duda cs (2001), Duda Palumbi (2004), Đặng Thúy Bình cs (2011) 60 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết đưa số kết luận sau: Các loài ốc cối thu vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam đa dạng Quan sát đặc điểm mặc hình thái cho thấy hình dạng vỏ lồi khơng khác biệt so với loài giới vân vỏ thể đa dạng với nhiều màu sắc hình dạng khác Trong phân tích 12S mtDNA, từ kết nghiên cứu thu loài ăn giun biển, (vermivorous (V)); loài thuộc nhóm ăn nhuyễn thể (molluscivorous (M)), lồi ăn cá (piscivorous (P)) loài vừa ăn cá vừa ăn giun biển (P+V) Đối với phân tích từ gen Calmodulin, chúng tơi thu 12 lồi ăn giun biển (vermivorous (V)); lồi thuộc nhóm ăn nhuyễn thể (molluscivorous (M)), loài vừa ăn cá vừa ăn giun biển (P+V) Khuếch đại gen 12S mtDNA gen Calmodulin loài ốc cối thu thập vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam kỹ thuật PCR Giải trình tự gen 12S mtDNA Calmodulin lập bảng so sánh trình tự gen tương đồng loài ốc cối Kết cho thấy khác biệt trình tự lớn loài ăn giun biển, loài ăn nhuyễn thể thấp loài ăn cá Điều cho thấy đa dạng mức độ di truyền loài ăn giun biển lớn hẳn so với loài khác Xây dựng phát sinh chủng loại dựa thị phân tử 12S mtDNA gen Calmodulin loài ốc cối thu Việt Nam khảo sát mối quan hệ tiến hóa với lồi giới Cây phát sinh loài dựa thị phân tử 12S mtDNA cho thấy loài ốc cối xếp thành nhóm (I – VI) Trong đó, có nhóm ăn giun biển I, III, VI; nhóm ăn cá nhómIV, V; nhóm nhóm ăn nhuyễn thể (nhóm II) Một số lồi C magus, C consor, C achatinus, C bullatus có vị trí khơng xác định phân lồi chúng nhóm gần có chế độ dinh dưỡng ăn cá Cây 61 phát sinh loài dựa thị phân tử Calmodilin phân chia lồi ốc cối thành nhóm (I – VIII) Trong đó, có nhóm ăn giun biển nhóm II, V, VI, VIII; nhóm ăn cá nhóm I, III; nhóm IV ăn nhuyễn thể Conus terabra vị trí khơng xác định Cả hai phát sinh loài cho thấy tương quan rõ rệt hình thức dinh dưỡng mối quan hệ tiến hóa 4.2 Kiến nghị  Khảo sát chi tiết đặc điểm hình thái, phân bố đa dạng sinh học  Mở rộng hướng khảo sát mối tương quan đặc điểm tiến hóa phương thức dinh dưỡng  Mở rộng thêm hướng nghiên cứu độc tố ốc cối ý nghĩa ứng dụng to lớn chúng phân loại y, dược học 62 Tài liệu tham khảo A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đặng Thúy Bình cs, 2011 Báo cáo bảo tồn lưu giữ nguồn gen loài ốc cối (Conus spp.) cá ngựa thân trắng (Hippocampus kelloggi) ven biển Nam Ttrung Bộ (Khánh Hòa Phú Yên) Đặng Thúy Bình cs, 2011 Đặc điểm phân bố ốc cối (Conus spp.) vịnh Vân Phong - Khánh Hịa Tạp chí Khoa học – Cơng nghệ Thủy sản, số 3/2011 Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2003 Sinh học phân tử 190-204 Lê Thị Thu Hà, Đặng Thúy Bình, 2010 Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa loài ốc cối (Conus spp.) vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam Lê Thị Bích Hảo, 2011 Đồ án tốt nghiệp “Nghiên cứu mối quan hệ loài ốc cối (Conus spp.) vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa thị phân tử gen CO1 DNA ty thể (CO1 mtDNA)” Trường đại học Nha Trang Hoàng Thị Lý, 2011.Đồ án tốt nghiệp“Nghiên cứu mối quan hệ loài ốc cối (Conus spp.) vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa thị phân tử 16S DNA ty thể (mtDNA)” Trường đại học Nha Trang Ngô Đăng Nghĩa cs, 2010 Báo cáo bảo tồn gen loài động vật thân mềm Việt Nam Phạm Thu Thủy cs, 2011 Xây dựng phát sinh chủng loại phân tử ốc cối Conus spp vùng biển Nam Ttrung Bộ Việt Nam Tạp chí khoa học – Công nghệ Thủy sản Số 3/2011 63 B TÀI LIỆU TIẾNG ANH Bandyopadhyay, P K., Bradford, J.S John-Paul, O., Matthew, T.C., Maren, W., Baldomero M O 2008 The mitochondrial genome of Conus textile, coxI– coxII intergenic sequences and Conoidean evolution Molecular Phylogenetics and Evolution 46: 215-223 10 Bingham J.P., Jones A, Alewood P.F., Andrews, P.R., Lewis R.J.1996.Conus venom peptides (conopeptides): inter-species, intra-species and within individual variation revealed by ionspray mass spectrometry, In: Lazarovici P, Spiro M, Zlotkin E (Eds.), Biochemical Aspects of Marine Pharmacology, Alaken Inc , Fort Collins, Co pp 13–27 11 Blaxter, M., Elsworth, B., Daub, J 2004 DNA taxonomy of a neglected animal phylum: an unexpected diversity of tardigrades Proc R Soc Lond B (Suppl.) 271: S189-S192 12 Cunha R.L., Tenorio M.J., Afonso, C., Castilho R., Zardoya, R.2008 Replaying the tape: recurring biogeographical patterns in Cape Verde Conus after 12 million years Molecular Ecology.17: 885-901 13 Cunha, R.L., Castilho,R., Ruber, L., Zardoya, R.2005 Patterns of Cladogenesis in the Venomous Marine Gastropod Genus Conus from the Cape Verde Islands Systematic Biology 54: 634-650 14 Duda T.F., Rolan, E 2005 Explosive radiation of Cape Verde Conus, a marine species flock Molecular Ecology.14, 267-272 15 Duda T.F Jr., Chang, D., Lewis, B.D., Lee, T 2009 Geographic variation in venom allelic composition and diets of the widespread predatory marine Gastropod Conus ebraeus PLoS ONE 4(7): e6245 16 Duda T.F Jr., Lessios, H A 2009 Connectivity of populations within and between major biogeographic regions of the tropical Pacific in Conus ebraeus, a widespread marine gastropod Coral Reefs 28: 651–659 17 Duda T.F Jr., Palumbi, S.R 1999 Molecular genetics of ecological diversification: Duplication and rapid evolution of toxin genes of the 64 venomous gastropod Conus The Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96: 6820–6823 18 Duda T.F Jr., Palumbi S R 2004 Gene expression and feeding ecology: evolution of piscivory in the venomous gastropod genus Conus Proceedings of the Royal Society of London Series B, Biological sciences 1544: 11651674 19 Duda, T.F Jr., Kohn, A J 2005 Species-level phylogeography and evolutionary history of the hyperdiverse marine gastropod genus Conus Molecular Phylogenetics and Evolution.34: 257-272 20 Duda, T.F Jr., Kohn, A.J., Palumbi, S.R., 2001 Origins of diverse feeding ecologies within Conus, a genus of venomous marine gastropods Biol J Linnean Soc 73: 391- 409 21 Espiritu, D J D., Cruz, L.J., Cartier, G.E., Olivera, B.M., 2002 Venomous gastropods: Conus, conoideans and other neogastropod families Bolletino Malacologico Supplement 4: 147–160 22 Espiritu, D J D., Maren, W., Virginia, D-M., Cartier, G.E., Lourdes, J.C., Baldomero, M 2001 Venomous cone snails: molecular phylogeny and the generation of toxin diversity Toxicon 39: 1899-1916 81 23 Franklin J B., Fernando S A., Chalke, B A.,Krishnan, K S 2007 Radular morphology of Conus (Gastropoda: Caenagastropoda: Conidae) from India Molluscan Research.27(3): 111–122 24 Grande, C., Templado, J., Zardoya, R 2008 Evolution of gastropod mitochondrial genome arrangements BMC Evolutionary Biology 8: 61 15p 25 Hall, T.A 1999 BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nucleic Acid Symposium Series 41: 95–98 26 Hebert, P.D.N., Cywinska, A., Ball, S.L., deWaard, J.R 2003 Biological identifications through DNA barcodes Proceedings of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences 270: 313-321 65 27 Hong S.B., Cho H.S., Shin H.D, Frisvad J.C., Samson RA 2006 Novel Neosartorya species isolated from soil in Korea International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2006) 56: 477–486 28 Huelsenbeck, J., Ronquist, P F (2001) MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees Bioinformatics 17: 754–755 29 Hylleberg, J and Kilburm, R.N 2003 Marine Molluscs of Vietnam, Proceeding of 16th International Congress and Workshop, Tropical Marine Molluscs Program (TMMP) 30 Kohn A.J., Omori, M., Yamakawa, H., Koike, Y.2001 Maximal species richness in Conus: diversity, diet and habitat on reefs of northeast Papua New Guinea Coral Reefs.20: 25–38 31 Kohn A.J, PR Saunders and S Weiner 1960 Preliminary studies on the venom of the marine snail, Conus Ann NY Acad Sci 90:706–725 32 Kohn, A.J., Nishi, M and Pernet, B.1999 Snail spears and scimitars: A character analysis of Conus radular teeth J Moll Stud.65: 461-481 33 Lewis R.J.2009 Conotoxins, molecular and therapeutic targets Prog Mol Subcell Biol 46: 45-65 34 McIntosh J.M., Jone R.M., 2001 Cone venom – from accidental stings to deliberate injection Toxicon 39: 1447 – 51 35 Mueller, R.L 2006 Evolutionary rates, divergence dates, and the performance of mitochondrial genes in Bayesian phylogenetic analysis, Systematic Biology 55: 289-300 36 Nam, H.H., Corneli, P.S., Watkins, M., Olivera, B., Bandyopadhyay, P 2009 Multiple genes elucidate the evolution of venomous snail-hunting Conus species Molecular Phylogenetics and Evolution xxx xxx–xxx 37 Nguyen, N.T 2007 Recently collected shells of Vietnam L ‘Informator Piceno & N.N.T Italy 38 Olivera B.M 2002 Conus venom peptides: relections from the biology of clades and species Annual Review of Ecology and Systematics 33: 25-47 66 39 Olivera, B.M., Rivier, J., Clark, C., Ramilio, C.A., Corpuz, G.P., Abogadie, F.C., Mena, E.E., Woodward, S.R., Hillyard, D.R., Cruz, L.J., 1990 Diversity of Conus neuropeptides Science 249: 257–263 40 Page, R.D 1996 TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers Computer Application Bioscience 12: 357–358 41 Puillandre, N., Watkins, M., Olivera, B.M 2010 Evolution of Conus Peptide genes: Duplication and positive selection in the A-superfamily Journal of Molecular Evolution [in press] 42 Röckel, D., Korn, W., Kohn, A.J., 1995 Manual of the Living Conidae (Vol I: Indo- Pacific Region) Verlag Christa Hemmen, Wiesbaden, Germany 43 Stewart J and Gilly W F 2005 "Piscivorous Behavior of a Temperate Cone Snail, Conus californicus" Biological Bulletin 209: 146-153 44 Stoeckle , M 2003 Taxonomy, DNA, and the bar code of life BioScience 53: 796-797 45 Swofford, D.L 2001 PAUP: Phylogenetic analysis using parsimony (and other methods) Sinauer Associates, Sunderland MA 46 Terlau, H., Olivera, B.M 2004: Conus venoms: a rich source of novel ion channel-targeted peptides Physiological Reviews.84:41-68 47 Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D.G 1997 The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic Acids Research 24: 4876–4882 48 Yaguchi T, Horie Y, Tanaka R, Matsuzawa T, Ito J Nishimura (2007) Molecular Phylogenetics of Multiple Genes on AspergillusSection Furmigati Isolated from clinical specimens in Japan JPn J Med Mycol Vol 48.37-46 ... truyền mối quan hệ tiến hóa lồi ốc cối (Conus spp.) vùng ven biển Nam Trung Bộ, Việt Nam Trong đề tài ? ?Nghiên cứu mối quan hệ loài ốc cối vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam dựa vào thị phân tử 12S mtDNA. .. biệt trình tự gen nhóm lồi ốc cối phân loại 51 3.2.2 Mối quan hệ loài ốc cối dựa thị phân tử 12S mtDNA Calmodulin nDNA .52 3.2.3 Mối quan hệ loài chế độ dinh dưỡng ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ ÚT VI NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ PHÁT SINH LOÀI CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.) TẠI VÙNG BIỂN NAM TRUNG BỘ VIỆT NAM DỰA