BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC ________________________________ TRƯƠNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) Chuyên ngành : Hóa học hữu cơ Mã số: 62.44.27.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2014 Công trình được hoàn thành tại: Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam. Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam. Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Phan Văn Kiệm 2. GS. TS. Nguyễn Văn Tuyến Phản biện 1: GS.TSKH Trần Văn Sung Phản biện 2: GS. TS. Đinh Thị Ngọ Phản biện 3: PGS. TS. Lê Mai Hương Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại: Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Số 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào hồi giờ ngày tháng 8 năm 2014 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt nam Thư viện Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam Thư viện Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam. 1 I.GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh. Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng và phong phú. Việc sử dụng nguồn tài nguyên đó để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ cho con người đã có một quá trình lịch sử hàng nghìn năm và ngày càng trở nên quan trọng. Đến nay, đã có hàng trăm cây thuốc đã được chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) là một cây thuốc thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) thường được sử dụng trị một số bệnh như: trị tổn thương do ngã, gãy xương, thấp khớp, viêm thận, phù thũng, dùng ngoài chữa chấn thương, ngứa, eczema Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây dấu dầu lá nhẵn, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và góp phần giải thích được tác dụng chữa bệnh của vị thuốc này, chúng tôi lựa chọn đề tài: ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây dấu dầu lá nhẵn Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.”. 2. Đối tượng nghiên cứu của luận án Đối tượng nghiên cứu của luận án gồm: mẫu lá và mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) thuộc chi Tetradium, họ Cam quýt (Rutaceae). 3. Những đóng góp mới của luận án 3.1. Lần đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học mẫu lá và vỏ thân cây dấu dầu lá nhẵn thuộc chi Tetradium mọc ở 2 Việt nam. Từ lá và vỏ thân cây dấu dầu lá nhẵn, bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập được hai sáu hợp chất, trong đó có một hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên, là tetraglabrifolioside và mười năm hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Tetradium 3.2. Đã đánh giá hoạt tính kháng lao của các hợp chất được phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn. Kết quả cho thấy 3 amide là N-isobutyl-2E,4E- tetradecadienamide (TG18), N-isobutyl-2E,4E-decadienamide(TG19), N-isobutyl-2E,4E,8E-tetradecatrienamide (TG20) thể hiện hoạt tính kháng lao, trong đó: hợp chất TG18 ức chế chủng lao thử nghiệm M.bovis với giá trị MIC 22 µg/mL. 3.3. Lần đầu tiên phân lập được epimedoside C (TG12) với khối lượng lớn từ lá cây dấu dầu lá nhẵn (21,54g) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào: ung thư đại tràng (SW480), ung thư phổi (LU-1), ung thư tiền liệt tuyến (LNCaP) với giá trị IC 50 lần lượt là: 10,47; 7,73; 6,69 µg/mL và thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt (58,74 mL) . 4. Bố cục của luận án Luận án gồm: 155 trang với 37 bảng số liệu, 94 hình, 144 tài liệu tham khảo và 17 phụ lục. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (27 trang); Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (9 trang); Chương 3: Thực nghiệm và kết quả (11 trang); Chương 4: Kết quả và Thảo luận (87 trang); Kết luận (1 trang); Kiến nghị (1 trang); Các công trình đã công bố (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (52trang). II. NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Phần tổng quan tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: - Đặc điểm thực vật, phân bố và ứng dụng của chi Tetradium; - Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetradium; - Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ chi Tetradium; - Đặc điểm thực vật; phân bố; ứng dụng và các nghiên cứu về thành phần hóa học; hoạt tính sinh học của cây dấu dầu lá nhẵn. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Mẫu vỏ thân và mẫu lá của cây dấu dầu lá nhẵn được thu hái vào tháng 6 năm 2011 tại Tây Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phương pháp phân lập các chất Các phương pháp và thiết bị nghiên cứu chủ yếu gồm: Sắc ký lớp mỏng (TLC); Sắc ký lớp mỏng điều chế; Sắc ký cột (CC). 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học Phương pháp xác định cấu trúc hoá học được kết hợp giữa xác định các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại gồm: Điểm nóng chảy (MP); Độ quay cực [α] D ; Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) và phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D- NMR): 1 H-NMR, 13 C-NMR và hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC. 2.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học Hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên 6 dòng tế bào: SW480 (ung thư tuyến đại tràng ở người), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến), KB (ung thư tế bào biểu mô), F1 (ung thư màng tử cung) và RD (ung thư màng tim). 4 Hoạt tính kháng lao: M. bovis và M. smegmatis. Hoạt tính chống oxi hóa (theo phương pháp DPPH); Hoạt tính hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: 3 chủng vi khuẩn gram (+); 3 chủng gram (-); 2 chủng nấm mốc và 2 chủng nấm men. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Phân lập các hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn Phần này trình bầy cụ thể quá trình phân lập các hợp chất từ mẫu lá và mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn. Lần lượt mẫu lá (3,5kg) và mẫu vỏ thân (2,4 kg ) đã được phơi khô, nghiền bột và chiết bằng methanol sau đó chiết phân bố lần lượt với n-hexane và ethylacetate. Các dịch chiết n-hexane, ethylacetate và lớp nước được cất thu hồi dung môi và được phân lập trên cột chiết và các hệ dung môi thích hợp thu được 11 hợp chất từ mẫu lá và 15 hợp chất thu được từ mẫu vỏ. Các quy trình phân lập mẫu lá và mẫu vỏ thân cây dấu dầu lá nhẵn được trình bầy trong hình 2 và hình 3 dưới đây. 3.2. Hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ cây dấu dầu lá nhẵn CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương này trình bày về cách xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được và kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất này. 4.1. Phân lập các hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn 4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 26 hợp chất được phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn, Trong số đó, có một hợp chất mới lần đầu tiên phân lập được từ tự nhiên và 15 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Tetradium, 5 Phân lập các hợp chất từ mẫu lá của cây dấu dầu lá nhẵn Hình 2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu lá cây dấu dầu lá nhẵn. 6 Phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn Hình 3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ cây dấu dầu lá nhẵn. 7 Dưới đây trình bày phương pháp xác định cấu trúc của 3 hợp chất điển hình 4.2.1. Hợp chất TG1 (chất mới): Tetraglabrifolioside 1'' 3'' 5'' 6'' 1' O O 2' 5' 6' HO HO OH COOH O O OH HO TG1a 1'' 3 ' ' 5'' 6'' 2 4 1 1' O O 5' 6' HO HO OH COOH O O OH TG1 O O HO HO OH OH O O O OH Hình 1. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của hợp chất TG1 và cấu trúc của hợp chất tham khảo TG1a Hợp chất TG1 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử được xác định là C 16 H 28 O 10 . Dựa trên phổ khối lượng phân giải cao HR ESI MS (Error! Reference source not found.) xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 379,1609 ([M–H] – ) (tính toán lý thuyết cho công C 16 H 27 O 10 : 379,1604). Trên phổ 1 H-NMR của TG1 xuất hiện tín hiệu của một proton anome tại δ H 4,34 (d, J = 8,0 Hz), một nhóm methyl bậc 3 tại δ H 1,36 (s), một nhóm methyl bậc 2 tại δ H 1,21 (d, J = 6,5 Hz) và một nhóm methyl bậc một tại δ H 0,96 (t, J = 7,5 Hz). Phổ 13 C-NMR và DEPT của TG1 cho thấy sự xuất hiện của hai nhóm cacbonyl tại δ C 172,63 (C-1′′) và 178,50 (C-5′′), một cacbon bậc bốn tại 70,88 (C-3′′), 6 nhóm oxymethine tại δ C 71,74 (C-4′), 75,05 (C-5′), 75,26 ′ (C-2), 77,92 (C-3′), 79,07 (C-2) và 103,93 (C-1′); bốn nhóm methylen tại δ C 30,25 (C-3), 46,99 (C-2′′), 47,26 (C-4′′) và 64,73 (C-6′ ); ba nhóm methyl tại δ C 9,98 (C-4), 21,48 (C-1) và 27,81 (C-6′′). Các tín hiệu cacbon tại δ C 103,93 (C-1′), 75,26 (C-2′), 77,92 (C-3′), 71,74 (C-4′), 75,05 (C-5′) và 64,73 (C-6′) cùng với hằng số tương tác của proton J H-1′-H-2′ = 8,0 Hz lớn, gợi ý sự có mặt của một đơn vị đường β-D-glucopyranoside. Thủy phân hợp 8 chất TG1 trong môi trường acid để thu phần đường; sau đó thực hiện phản ứng với trimethylsilylimidazole. Cô quay sản phẩm phản ứng và rồi chiết phân bố trong n-hexane và H 2 O thu được phân lớp n-hexane. Lớp n-hexane này được phân tích trên máy GC với điều kiện: cột SPB-1 (0,25 mm × 30 m); detector FID, nhiệt độ cột 210 °C, nhiệt độ buồng bơm 270 °C, nhiệt độ buồng bơm 300 °C, khí mang heli (tốc độ dòng 2 mL/phút) đã thu được một pic tín hiệu tại thời gian lưu 14,11 phút. Tiến hành tương tự cho các mẫu chuẩn D-glucose và L-glucose thu được thời gian lưu của persilylated D-glucose và L-glucose lần lượt là 14,11 và 14,26 phút. Bằng các so sánh thời gian lưu đã xác định được chính xác phần đường trong hợp chất TG1 là D-glucose. Bảng 8. Dữ kiện phổ NMR của TG1 và hợp chất tham khảo TG1a TG1 C δ C # δ C DEPT δ H (J = Hz) HMBC 1 21,48 CH 3 1,21 (d, 6,5) 2, 3 2 79,07 CH 3,74 (m) 1′, 4, 3 3 30,25 CH 2 1,50 (m) 1,62 (m) 1, 2, 4 4 9,98 CH 3 0,96 (t, 7,5) 2, 3 1′ 103,0 103,93 CH 4,34 (d, 8,0) 2′, 3′ 2′ 75,9 75,26 CH 3,18 (t, 8,5) 1′, 3′, 4′ 3′ 78,6 77,92 CH 3,36* 2′, 4′, 5′ 4′ 72,4 71,74 CH 3,33* 2′, 3′, 5′, 6′ 5′ 75,9 75,05 CH 3,47 (m) 1′, 3′, 5′, 6′ 6′ 65,5 64,73 CH 2 4,21 (dd, 6,0, 11,5) 4,45 (dd, 1,5, 11,5) 1′′, 4′, 5′ 1′′, 4′, 5′ 1′′ 173,6 172,63 C - 2′′ 48,0 46,99 CH 2 2,64 (d, 15,0) 2,68 (d, 15,0) 1′′, 3′′, 4′′, 6′′ 3′′ 71,7 70,88 C 4′′ 48,7 47,26 CH 2 2,48 (d, 15,0) 2,59 (d, 15,0) 2′′, 3′′, 5′′, 6′′ 2′′, 3′′, 5′′, 6′′ 5′′ 180,9 178,50 C - 6′′ 28,7 27,81 CH 3 1,36 (s) 2′′, 3′′, 4′′ # δ C thu được từ hợp 1-[(2R)-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanol-2-O- β -D- glucopyranosyl]-3-hydroxyl-3-methylglutaric acid [119], * tín hiệu chập [...]... thử hoạt tính của các hợp chất phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn (HT: hoạt tính) Từ kết quả thực nghiệm hoạt tính nhận thấy: các hợp chất phân lập được từ cây dấu dầu lá nhẵn thể hiện các hoạt tính: gây độc tế bào, hoạt tính kháng lao, hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ở các mức độ khác nhau Trong đó đáng chú ý là hợp chất 6-acetonyl-N-methyldihydrodecarine (TG2) có hoạt tính. .. trong cây dấu dầu lá nhẵn đã mở ra hướng sử dụng cây này trong việc sử dụng tạo các sản phẩm chức năng chống lão hóa 4.3.4 Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Các hợp chất phân lập được từ cây dấu dầu lá nhẵn được kiểm tra hoạt tính kháng tám chủng vi sinh vật kiểm định Kết quả cho thấy, trong các hợp chất phân lập được từ cây dấu dầu lá nhẵn, hai flavonoid là phellamurin (TG11) và. .. µg/mL - Hợp chất TG11 và TG16 thể hiện hoạt tính tiêu diệt gốc tự do DPPH với giá trị EC50 lần lượt là 19,41 và 11,56 µg/mL - Hợp chất TG11 thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus với giá trị IC50 là 32,0 µg/mL KIẾN NGHỊ Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây dấu dấu lá nhẵn, chúng tôi nhận thấy loài này có sự tương đồng về các thành phần hóa học với loài T ruticarpum,... phần hóa học với loài T ruticarpum, một vị thuốc đông y được sử dụng từ lâu đời ở Trung Quốc Tuy nhiên hiện nay cây dấu dầu lá nhẵn vẫn chưa được ứng dụng và khai thác nhiều Vì vậy, cần thêm các nghiên cứu sinh học và dược học để khẳng định thêm giá trị khoa học của cây dấu dầu lá nhẵn, góp phần trong việc tạo ra các sản phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN... hiện hoạt tính; ellipticine: chất đối chứng dương tính Kết quả nghiên cứu cho thấy, alkaloid TG2 thể hiện hoạt tính mạnh trên các dòng tế bào KB, F1 và RD với IC50 lần lượt là 3,55; 4,42 và 4,52 µg/mL Hợp chất TG12, một flavonoid phân lập được khối lượng lớn từ cây dấu dầu lá nhẵn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với ba dòng tế bào SW480, LU-1, LNCaP với IC50 lần lượt là 10,47; 7,73 và 6,69... hoạt tính chống oxi hóa mạnh chủ yếu thuộc về lớp chất flavonoid Phellamurin TG11 và quercetin TG16 thể hiện hoạt tính chống oxi hóa DPPH với giá trị EC50 lần lượt là 19,41 và 11,56 µg/mL Các hợp chất TG12, TG13, TG14 và TG15 và α-tocopherol TG17 thể hiện hoạt tính chống oxi hóa DPPH ở mức độ trung bình với giá trị EC50 trong khoảng 45,37÷63,87 µg/mL Trong nghiên cứu này, các hợp chất phân lập từ cây. .. (TG20) đều thể hiện hoạt tính kháng lao yếu KẾT LUẬN 1 Từ vỏ thân và lá cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học 1 hợp chất mới glycoside ester: tetraglabrifolioside (TG1) cùng 25 hợp chất đã biết bao gồm: năm alkaloid: 6-acetonyl-N-methyldihydrodecarine 22 (TG2), 6-acetonyldihydrochelerythrine (TG3), decarine (TG4), iwamide (TG5) và rutaecarpine (TG6);... saikolignannisode A (TG22) và picraquassioside D (TG23); 2 sterol: stigmatsterol (TG24) và daucosterol (TG25); một fufural: 5-hydroxymethylfurfural (TG26) Trong đó, có 15 hợp chất lần đầu phân lập chi Tetradium 2 Đã thử các hoạt tính: gây độc tế bào ung thư in vitro, kháng lao, chống oxi hóa và kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập được từ cây dấu dầu lá nhẵn, kết quả thử hoạt tính cho thấy: -... glycosit phân lâp từ cây Tetradium glabrifolium, Tạp chí Hóa học, 2011, 49(6), 733738 Trương Thị Thu Hiền, Hoàng Lê Tuấn Anh, Phạm Hải Yến, Đan Thị Thúy Hằng, Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Dương Thị Dung, Nguyễn Xuân Nhiệm, Nguyễn Anh Hưng, Nguyễn Văn Tuyến, Phan Văn Kiệm, Các hợp chất limonoid và triterpenoit phân lập từ lá cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium) , Tạp chí Hóa học, 2013, 51(1),... bào KB, F1 và RD với IC50 lần lượt là 3,55; 4,42 và 4,52 µg/mL Hợp chất TG12, 1 flavonoid phân lập được lượng lớn từ cây dấu dầu lá nhẵn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với 3 dòng tế bào SW480, LU-1, LNCaP với IC50 lần lượt là 10,47; 7,73 và 6,69 µg/mL Hợp chất TG11, TG16 thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh giá trị ức chế có hiệu quả các gốc tự do DPPH đạt EC50 lần lượt là 19,41 và 11,56 µg/mL . dụng và các nghiên cứu về thành phần hóa học; hoạt tính sinh học của cây dấu dầu lá nhẵn. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Mẫu vỏ thân và mẫu lá của cây dấu dầu. đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây dấu dầu lá nhẵn, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và. glabrifolium (Benth. ) Hartl.”. 2. Đối tượng nghiên cứu của luận án Đối tượng nghiên cứu của luận án gồm: mẫu lá và mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium (Benth. ) Hartl .) thuộc chi