Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 2010 THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ThS Lê Thùy Linh Lưu hành nội Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM NỘI DUNG Bài 1: Định lượng Coliforms E coli Trang 1.1 Tóm tắt kiến thức 1.2 Quy trình định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN 1.3 Cách tiến hành thí nghiệm 1.4 Cách tính kết 10 Bài Định lượng Staphylococcus aureus 10 2.1 Tóm tắt kiến thức 2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus phương pháp MPN 2.3 Cách tiến hành cách tính kết Bài Định tính Salmonella 10 10 11 14 3.1 Tóm tắt kiến thức 3.2 Qui trình định tính Salmonella thực phẩm Bài Định lượng Bacillus cereus 14 14 20 4.1 Tóm tắt kiến thức 4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus phương pháp đếm khuẩn lạc Bài Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí tổng nấm men-nấm mốc 20 20 24 5.1 Tóm tắt kiến thức 5.2 Quy trình phân tích 24 26 Tài liệu tham khảo Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, NXB Giáo dục, 2006 http://www.microbelibrary.org http://www.chromagar.com http://www.rapidmicrobiology.com http://www.marietta.edu Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bài 1: Định lượng Coliforms E coli 1.1 Tóm tắt kiến thức 1.1.1 Định nghĩa Hình 1: phát Coliforms E coli thực phẩm hay nước môi trường CHROMagar ECC Coliforms trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí kỵ khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh acid sinh 370C 24 – 48 Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay loại mẫu môi trường dùng để thị khả diện loại vi sinh vật khác Nhóm Coliforms gồm giống là: E coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter Tính chất sinh hóa đặc trưng nhóm thể qua thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) Citrate (iC) thường gọi IMViC Coliforms chịu nhiệt Coliforms có khả lên men lactose sinh khoảng 24h ủ 440C môi trường canh EC Coliforms phân (Faecal Coliforms) Coliforms chịu nhiệt có khả sinh indole ủ khoảng 24h 440C canh Trypton E coli Coliforms phân cho kết thử nghiệm IMViC ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -) 1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN) Đây phương pháp định lượng dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha lỗng khác Thơng thường, việc định lượng thực lặp lại lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng x = ống nghiệm Quy trình thực sau: Pha lỗng mẫu phân tích nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Kết biểu kiến chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm định Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính độ pha loãng Tra bảng Mac Crady Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Chú ý: Đa số bảng MPN cung cấp số liệu dạng số MPN 100ml dung dịch sử dụng để phân tích liều lượng 10ml, 1ml, 0.1 ml Trên thực tế phân tích, người ta thường dùng 1ml cho mẫu pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Lượng mẫu với độ pha loãng tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu Vậy số liệu bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha lỗng 1ml dung dịch có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3 dùng để phân tích Trường hợp mật độ vi sinh vật cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu với hệ số pha lỗng Ví dụ: sử dụng 1ml cho độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức sử dụng 1/10 lượng mẫu nồng độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Do vậy, trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng 10 1.2 Quy trình định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng mẫu để có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3… Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, nồng độ có ống lặp lại, ủ 370C, 48 Ghi nhận ống LSB (+) (sinh hơi) nồng độ pha loãng Cấy vào ống canh BGBL, ủ 370C ± 10C, 48 Số ống (+)(sinh )ở độ pha loãng Cấy vào ống canh EC, ủ 44.50C ± 0.20C, 24 Số ống (+) độ pha loãng Cấy lên thạch EMB, ủ 370C, 24 Coliforms Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Xem trang sau Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Tiếp theo Chọn khuẩn lạc (trịn, dẹt hình đĩa có ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ 44.50C ± 0.20C, 24 Thử nghiệm IMViC Đếm số ống canh EC (+) IMViC ++ , tra bảng MPN E coli 1.3 Cách tiến hành thí nghiệm Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho tổ) 1.3.1 Pha môi trường khử trùng dụng cụ Bước 1: pha môi trường Tên môi trường SPW (Saline Water) Thành phần NaCl : 42.5g Pepton Pepton: 5g Tryptose: 20g LSB (Lauryl Sulphate Lactose: 5g Broth) Sodium chloride: 5g KH2PO4: 2.75g K2HPO4: 2.75g Lauryl sulphate: 0.1g BGBL Peptone: 10g Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Tổng thể tích Ghi 500 ml nước Phân phối cho tổ 27ml cất SPW (9ml/ống nghiệm) trước khử trùng (buổi 1) 1000 ml nước Phân phối 90ml LSB cho cất tổ (10ml/ống nghiệm) pH 6.8 ± 0.2 trước khử trùng (buổi 1) 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM (Brilliant Bile Green Lactose: 10g Lactose Mật bò: 20g cất pH 7.4 tổ (10ml/ ống nghiệm có chứa ống Durham) trước Broth) Brilliant green: 0.0133g khử trùng (buổi 1) EC (E.coli medium) Trypticase or tryptose: 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho 20g cất tổ (10ml/ ống nghiệm có Muối mật No.3: 1.5g pH 6.9 chứa ống Durham) trước Lactose: 5g khử trùng (buổi 1) KH2PO4: 1.5g K2HPO4: 4g NaCl: 5g Pancreatic digest of 1000 ml nước Phân phối 100ml EMB cho EMB (Eosin Methylene gelatin: 10g cất tổ (20ml/petri) (buổi 2) Blue Agar) Lactose: 10g pH 7.1 ± 0.2 K2HPO4: 2g Eosin Y: 0.4g Methylene blue: 65mg Agar: 15g Tryptone water Tryptone trypticase:10g 1000ml nước Mỗi tổ dùng 20ml, phân cất phối 10ml/ống nghiệm pH 7.2 ± 0.2 (buổi 3) 1000ml nước MR-VP Both Môi trường 1: (Glucose Buffered peptone-water cất Phosphate) powder: 7g pH 6.9 ± 0.2 Glucose: 5g K2HPO4: 5g Mỗi tổ dùng 30ml, phân phối 10ml/ống nghiệm Kiểm tra lại môi trường cung cấp để pha môi trường (buổi 3) Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 Sodium citrate: 2g SCA (Simmons Citrate NaCl: 5g K2HPO4: 1g NH4H2PO4: 1g thoảng MgSO4: 0.2g Bromothymol 0.08g Agar: 15g Agar) 1000ml nước Mỗi tổ dùng 50ml, phân cất Đun nóng phối 10ml/ống nghiệm nhẹ thỉnh (buổi 3) Đun sôi 1-2 blue: phút hòa tan hết pH 6.8 ± 0.2 lắc Bước 2: khử trùng dụng cụ môi trường pha Bao gói dụng cụ phân phối mơi trường vào dụng cụ, gắn nút bao gói Hấp tiệt trùng 1210C 15 phút 1.3.2 Cách tiến hành: Bước 3: pha loãng mẫu 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml ống mẫu 9ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Độ pha lỗng Hình 2: quy trình pha lỗng mẫu Pha lỗng mẫu thành nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, nồng độ có ống lặp lại, ủ 370C, 48 Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 Bước 5: Định lượng Coliform E coli Định lượng Coliform Định lượng E coli Ghi nhận số ống có sinh (+) Ghi nhận số ống có sinh (+) Dùng que cấy vịng cấy chuyển dịch mẫu Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) sang ống có chứa từ ống LSB (+) sang môi trường canh canh BGBL ủ 370C ± 10C, 48 EC, ủ 44.50C ± 0.20C, 24 Ghi nhận số ống có sinh (+) ứng với Ghi nhận số ống có sinh (+) ứng với độ pha lỗng độ pha lỗng Tính kết (xem 1.4) Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ ống (+) canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Ủ 370C, 24 Chọn khuẩn lạc đường kính lớn 1mm (trịn, dẹt hình đĩa có ánh kim xanh) (xem hình 4), cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ 44.50C ± 0.20C, 24 Page | Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm TP.HCM Hình 4: E.coli nuôi môi trường thạch EMB cho khuẩn lạc màu kim xanh (theo Naowarat Cheeptham, Thompson Rivers University, Kamloops, BC, Canada) Bước 6: thử nghiệm IMViC Hình 5: Kết IMViC Escherichia coli sau 24giờ ủ 37°C (Anne Hanson, University of Maine, Orono) Ống A: dương tính thử nghiệm indole môi trường tryptone Xuất lớp màu đỏ bề mặt môi trường sau nhỏ thuốc thử Kovács Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất màu đỏ methyl red Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu qua khơng thay đổi màu sau cho thuốc thử Barritt’s A Barritt’s B Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu qua thay đổi màu sắc khơng có khuẩn lạc ống nghiệm a Thử nghiệm Indol (I): Nguyên tắc: Tryptophan acid amin bị oxi hóa số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm chứa gốc indol Việc phát indol thực phản ứng phân tử với thuốc thử chứa pDimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm nước tryptone Sinh khối chủng cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ nhiệt độ 370C 24-48 Bổ sung 1ml ether xylene vào ống nghiệm, lắc để chiết Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM tách indol lên lớp dung môi hữu Nhỏ giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi tạo màu đỏ lớp dung môi hữu Đọc kết quả: (+) xuất lớp màu đỏ bề mặt môi trường (-) lớp màu vàng thuốc thử Đơi có xuất màu cam skatol, tiền chất methyl hóa indol, tạo Hình 6: thử nghiệm Indol b Thử nghiệm Methyl Red (MR): Nguyên tắc: thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ diện môi trường sau vi sinh vật lên men glucose Chỉ thị thay đổi màu sau: pH6.0 màu vàng Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm mơi trường lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth) Dùng que vịng cấy lượng nhỏ khuẩn lạc môi trường MR-VP, ủ 370C khoảng 2-5 ngày Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0.02% hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản 40C) vào ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết Đọc kết quả: (+) mơi trường có màu đỏ sau bổ sung thuốc thử (-) có màu vàng Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống mơi trường có giống ngày thực lại Hình 7: thử nghiệm MR thử nghiệm c Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, 3) d Thử nghiệm Citrate (iC) Nguyên tắc: biến dưỡng citrate vi sinh vật tạo CO2 làm kềm hóa mơi trường Mặt khác VSV có khả sử dụng citrate làm nguồn carbon có khả dùng muối ammonium làm nguồn đạm Sự phân giải muối ammonium dùng làm nguồn đạm mơi trường sinh NH3 làm kiềm hóa mơi trường Sự gia tăng giá trị pH thị đổi màu thị pH môi trường Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm mơi trường lỏng SCA Dùng que vịng cấy ria lượng nhỏ khuẩn lạc lên môi trường SCA rắn ống nghiệm thạch nghiêng, ủ 350C khoảng 24-48 Đọc kết quả: (+) xuất khuẩn lạc môi trường chuyển sang màu xanh dương (-) khơng có khuẩn lạc mơi trường giữ ngun màu xanh lục 1.4 Cách tính kết Hình 8: thử nghiệm Citrate Từ số lượng ống nghiệm có E coli (+) độ pha lỗng mẫu, dùng bảng MPN loạt ống nghiệm nồng độ pha lỗng liên tiếp để tính mật độ vi sinh vật mẫu biểu diễn dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng Bài Định lượng Staphylococcus aureus 2.1 Tóm tắt kiến thức Staphylococcus aureus vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+) có khả lên men sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose Tất dòng S aureus mẫn cảm với novobiocine, có khả tăng trưởng mơi trường chứa đến 15% NaCl Một số dịng có khả tăng trưởng làm Hình 9: S aureus BPA tan máu mơi trường thạch máu S aureus nhiễm vào thực phẩm qua đường tiếp xúc với người thao tác trình chế biến thực phẩm Sự diện với mật độ cao S aureus thực phẩm thị điều kiện vệ sinh kiểm sốt nhiệt độ q trình chế biến 2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus phương pháp MPN Phương pháp dùng để định lượng S aureus mẫu có mật độ S aureus thấp mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 10 ... cụ phân phối mơi trường vào dụng cụ, gắn nút bao gói Hấp tiệt trùng 12 10C 15 phút 1. 3.2 Cách tiến hành: Bước 3: pha loãng mẫu 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml ống mẫu 9ml 1 0 -1 1 0-2 1 0-3 1 0-4 1 0-5 1 0-6 ... pha lỗng 10 1. 2 Quy trình định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng mẫu để có độ pha loãng 1 0 -1 , 1 0-2 , 1 0-3 … Chuyển 1ml dung dịch 1 0 -1 , 1 0-2 , 1 0-3 vào ống 10 ml canh... hệ số pha lỗng Ví dụ: sử dụng 1ml cho độ pha loãng 1 0-2 , 1 0-3 , 1 0-4 tức sử dụng 1/ 10 lượng mẫu nồng độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu độ pha loãng 1 0 -1 , 1 0-2 , 1 0-3 Do vậy, trị số tra bảng MPN