ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TÓM TẮT Đặt vấn đề: Phần lớn các dị bội nhiễm sắc thể được chẩn đoán trước sinh liên quan đến các nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X và Y. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) giúp xác định nhanh các bất thường về số lượng của nhiễm sắc thể trên nhân tế bào ở gian kỳ. Mục tiêu: Xác định tính hiệu quả của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trong chẩn đoán trước sinh các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp Phương pháp: Đối tượng: 1302 sản phụ có chỉ định chọc ối khảo sát tình trạng lệch bội nhiễm sắc thể (13, 18, 21, X, Y) bằng kỹ thuật FISH. Thời gian: 01/2004 – 09/2006. Thực hiện kỹ thuật FISH theo qui trình chuẩn của hãng VYSIS. Kết quả: Trong thời gian từ 01 / 2004 đến 09 /2006 chúng tôi đã thực hiện kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trên 1302 trường hợp thai kỳ có nguy cơ dị bội nhiễm sắc thể. 136 (10,45%) trường hợp dị bội nhiễm sắc thể được phát hiện. 66 trường hợp tam nhiễm sắc thể 18, 60 trường hợp tam nhiễm sắc thể 21, 3 trường hợp tam nhiễm sắc thể 13, 3 trường hợp XO, 2 trường hợp XXY, 1 trường hợp XXX và 1 trường hợp tam bội đã được phát hiện thông qua kỹ thuật FISH. Không có trường hợp âm tính giả hay dương tính giả nào được ghi nhận. Kết luận: Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trên nhân tế bào ối ở gian kỳ là một phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác cho những thai kỳ có nguy cơ cao dị bội nhiễm sắc thể. ABSTRACT Introduction: Most of aneuploidies diagnosed prenatally involve the autosomes 13, 18, 21 and sex chromosomes X and Y. Fluorescence in situ hybridization (FISH) technique allows rapid analysis of chromosome copy number in interphase cells. Objective: Identify the effectiveness of applying the FISH tecnique in prenatally diagnosing the common aneuploidies. Method: Subjects: 1302 pregnant women were indicated to have an amniocentesis to detect aneuploidies of chromosome 13, 18, 21, X, Y by using FISH technique. Time of research: from January 2004 to September 2006. Applying FISH technique following the Vysis’s standard protocol. Results: From January 2004 to September 2006, we applied FISH technique on 1302 pregnancies having a risk of chromosome aneuploidy. Aneuploidies were detected in 136 (10,45%) samples. 66 cases of trisomy 18, 60 cases of trisomy 21, 03 cases of trisomy 13, 03 cases of monosomy X, 02 cases of XXY, a case of XXX and a case of triploidy were diagnosed by FISH. There were no false negative or false positive results. Conclusion: We conclude that FISH analysis of interphase, uncultured amniotic cells is an fast and accurate method for routine prenatal diagnosis of the most common aneuploidies in high-risk pregnancies. ĐẶT VẤN ĐỀ Bất thường nhiễm sắc thể được chẩn đoán trước sinh phần lớn là những dạng lệch bội của các nhiễm sắc thể thường (13, 18, 21) và của nhiễm sắc thể giới (X, Y). Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: Fluorescence in situ hybridization) với việc sử dụng những đoạn dò đặc hiệu cho từng nhiễm sắc thể đã được chứng minh là có hiệu quả cao cho việc xác định nhanh số lượng của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở giai đoạn gian kỳ [2,3,5,9,10] . Với đặc tính nhanh, nhạy và chính xác, việc sử dụng kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp đã trở nên phổ biến [4,8,12] . Ngoài ra kỹ thuật FISH còn được xem như là một lựa chọn giúp giảm sự lo âu cho các sản phụ có thai kỳ nguy cơ cao [7] . Tại thành phố Hồ Chí Minh, kỹ thuật FISH bước đầu đã được ứng dụng trên 33 mẫu dịch ối vào năm 2003 [1] . Tuy nhiên với một cỡ mẫu nhỏ nên chưa thể khẳng định được giá trị của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu “Xác định tính hiệu quả của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trong chẩn đoán trước sinh các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp”. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 1302 sản phụ có chỉ định chọc ối để khảo sát tình trạng lệch bội nhiễm sắc thể (13, 18, 21, X, Y) bằng kỹ thuật FISH tại phòng Di truyền tế bào bệnh viện Phụ sản Từ dũ và phòng khám thai bệnh viện Hùng vương trong thời gian từ 01 / 2004 đến 09/ 2006. Phương pháp nghiên cứu Tất cả các sản phụ đều được tham vấn về việc chọn lựa kỹ thuật nhanh FISH hay kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối, và được giải thích cặn kẽ về những giới hạn của kỹ thuật FISH. Thực hiện nuôi cấy tế bào ối đi kèm với kỹ thuật FISH trong các trường hợp: kiểm định kết quả FISH, tiền căn gia đình có người mang chuyển đoạn nhiễm sắc thể liên quan đến các nhiễm sắc thể 13, 18, 21, theo yêu cầu của sản phụ. Thu thập vào bảng câu hỏi các thông tin về họ tên, tuổi của sản phụ, kết quả siêu âm sản khoa (ghi nhận loại bất thường siêu âm: nhỏ, lớn hay cả hai) [11] , kết quả xét nghiệm sàng lọc sinh hóa (MAFP, bhCG, uE3), kết quả phân tích của kỹ thuật FISH, kết quả phân tích nhiễm sắc thể (nếu có). Thu thập 6 – 8 ml dịch ối cho các trường hợp thực hiện kỹ thuật FISH, tối thiểu là 10 ml cho trường hợp thực hiện cả hai kỹ thuật FISH và nuôi cấy tế bào ối. Làm phồng tế bào ối bằng dung dịch KCl 0.075M, định hình tế bào bằng hỗn hợp dung dịch methanol : acid acetic (3:1). Nhỏ cặn tế bào lên phiến kính sạch. Khử nước bằng ethanol 70% - 90% - 100%. Sử dụng các đoạn dò DNA đặc hiệu cho các nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y của hãng VYSIS (Mỹ). Thực hiện xử lý trước khi lai, tiến hành lai và rửa sau lai theo qui trình hướng dẫn của VYSIS. Thực hiện đếm tối thiểu trên 50 nhân tế bào đối với từng loại đoạn dò DNA. Đánh giá kết quả lai là bình thường khi có # 80% nhân tế bào có 2 tín hiệu lai đối với từng loại đoạn dò DNA. Đánh giá kết quả là bất thường khi có # 70% nhân tế bào có số tín hiệu lai bất thường đối với từng loại đoạn dò DNA. Kết quả FISH được bao gồm các thông tin: mô tả loại đoạn dò được sử dụng, số tín hiệu của từng loại nhiễm sắc thể được kiểm tra, tình trạng lệch bội của các nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y (nếu có). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 136 / 1302 (10,45%) trường hợp dị bội nhiễm sắc thể được phát hiện thông qua kỹ thuật FISH. Trong đó, 66 trường hợp tam nhiễm sắc thể 18, 60 trường hợp tam nhiễm sắc thể 21, 3 trường hợp tam nhiễm sắc thể 13, 3 trường hợp XO, 2 trường hợp XXY, 1 trường hợp XXX và 1 trường hợp tam bội. Bảng 1. Kết quả FISH Kết quả Số trường hợp T ỉ lệ (%) Bình thường 1166 89,55 Bất thường Tam nhi ễm sắc thể 18 Tam nhi ễm sắc thể 21 Tam nhi ễm sắc thể 13 XO XXY 136 66 60 03 03 02 01 01 10,45 XXX Tam bội Tổng 1302 100 Có 1 trường hợp cần thực hiện kỹ thuật FISH lần thứ hai vì tín hiệu lai huỳnh quang yếu không thể phân tích được. Có 2 trường hợp nghi ngờ tam nhiễm sắc thể 21 khi ghi nhận có 8 - 10 nhân tế bào trong tổng số 50 nhân tế bào được phân tích có 3 tín hiệu huỳnh quang. Cả 2 trường hợp này được thực hiện kỹ thuật lai huỳnh quang lần thứ hai và ghi nhận chỉ có 2 – 3 nhân tế bào có 3 tín hiệu huỳnh quang. Ghi nhận sau sinh, cả hai cháu bé đều bình thường. Có 3 trường hợp nghi ngờ tam nhiễm sắc thể 18 thuộc loại bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể (isochromosome: nhiễm sắc thể đều) khi ghi nhận 45 – 48 nhân tế bào có 1 tín hiệu lớn và 1 tín hiệu nhỏ của nhiễm sắc thể 18, 2 – 5 nhân tế bào có 3 tín hiệu của nhiễm sắc thể 18. Cả 3 trường hợp được yêu cầu làm thêm kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối để phân tích bộ nhiễm sắc thể thai nhi đồng thời thực hiện kỹ thuật FISH lần hai trên mẫu dịch ối đã thu thập lần đầu. Kết quả cả 3 bộ nhiễm sắc thể đều bình thường về số lượng và cấu trúc của nhiễm sắc thể 18, không ghi nhận nhân tế bào có 3 tín hiệu nhiễm sắc thể 18. 219 trường hợp được thực hiện nuôi cấy tế bào ối đi kèm với thực hiện kỹ thuật FISH. Các bất thường lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y đều tương đồng giữa hai kỹ thuật. Có 2 trường hợp bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể không được phát hiện bởi kỹ thuật FISH là chuyển đoạn tương hỗ nhiễm sắc thể t(13;14) và t(14;21). Bảng 2. Kết quả nuôi cấy tế bào ối Bộ NST Số trường hợp 46,XX 78 46,XY 87 47,XX/XY,+18 30 47,XX/XY,+21 17 47,XX,+13 01 45,X 01 47,XXX 01 46,XY/47,XXY 01 69,XXX 01 45,XX,t(13;14) 01 45,XY,t(14;21) 01 Tổng 219 Chỉ định chính để chọc ối làm kỹ thuật FISH là có hình ảnh bất thường trên siêu âm (41,32%) và kết quả xét nghiệm sàng lọc sinh hóa máu mẹ bất thường (35,87%). Phần lớn số trường hợp lệch bội 5 nhiễm sắc thể (13, 18, 21, X, Y) cũng được phát hiện qua hai chỉ định này. Có một trường hợp XO được phát hiện tình cờ thông qua chỉ định chọc ối là tiền căn sẩy thai liên tiếp. Bảng 3. Chỉ định chọc ối và khả năng phát hiện lệch bội của kỹ thuật FISH Chỉ đ ịnh chọc ối Số trường hợp T ỉ lệ (%) Số trường h ợp lệch bội Bất thường si êu âm 538 41,32 74 Chỉ đ ịnh chọc ối Số trường hợp T ỉ lệ (%) Số trường h ợp lệch bội Bất thư ờng xét nghiệm sinh hóa 467 35,87 16 Mẹ lớn tuổi 139 10,68 02 Bất thường si êu âm + sinh hóa 135 10,37 41 Tiền că n sinh con Down 09 0,69 0 Tiền căn sinh 08 0,61 0 [...]... “mẫu cấy này không đạt, cần thực hiện chọc ối lần hai” Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) thực hiện trên nhân tế bào ở gian kỳ nên có thể giúp chẩn đoán nhanh vì không phải tốn thời gian nuôi cấy tế bào Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã thực hiện việc so sánh giữa hai kỹ thuật nuôi cấy tế bào và kỹ thuật FISH đã chứng minh khả năng sử dụng kỹ thuật FISH như một công cụ chẩn đoán độc lập trong chẩn... thường, nếu có một tỉ lệ nhỏ nhân tế bào có ba tín hiệu lai thì nên kiểm định lại bằng kỹ thuật FISH lần hai Trong 219 trường hợp được thực hiện kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối đi kèm với kỹ thuật FISH, chúng tôi chưa ghi nhận có sự bất tương hợp giữa hai kỹ thuật FISH và nuôi cấy tế bào ối Điều này chứng tỏ với những điều chỉnh thích hợp thì kỹ thuật FISH thật sự hiệu quả trong việc phát hiện các lệch... có thể dẫn đến hình thành thai nhi hội chứng Down / hội chứng Patau – thì kỹ thuật FISH vẫn là lựa chọn hàng đầu để loại trừ khả năng thai nhi hội chứng Down hoặc hội chứng Patau, có thể thực hiện đồng thời thêm kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối để xác định sự hiện diện của bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể của bố / mẹ truyền cho con Với những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực siêu âm và các xét nghiệm... sắc thể 21 Với việc sử dụng phần mềm tính toán nguy cơ lệch bội nhiễm sắc thể dựa trên kết quả các thông số sinh hóa đã làm tăng khả năng phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể Trong nghiên cứu của chúng tôi, trên 80% (42 / 52) trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 18, 21 đã được phát hiện khi có sử dụng phần mềm tính nguy cơ KẾT LUẬN Hơn hai năm thực hiện kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trên 1302 trường... nào được ghi nhận Chúng tôi cũng rút ra một số nhận xét sau: - Kỹ thuật FISH là một kỹ thuật tương đối đơn giản, giúp chẩn đoán nhanh, chính xác các lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y - Hiệu quả của kỹ thuật FISH phụ thuộc vào việc tuân thủ chặt chẽ các qui định trong các bước thu thập, xử lý mẫu và phân tích kết quả - Có thể sử dụng kỹ thuật FISH như là một công cụ chẩn đoán cho các lệch bội nhiễm... hiện lại kỹ thuật FISH trên mẫu dịch ối đã thu thập lần trước với việc điều chỉnh thời gian xử lý pepsin Kết quả đạt được tín hiệu lai rõ ràng Có 2 trường hợp nghi ngờ tam nhiễm sắc thể 21 được loại trừ sau khi thực hiện lại kỹ thuật FISH lần thứ hai Có 3 trường hợp nghi ngờ tam nhiễm sắc thể 18 do sự không đồng bộ về kích thước của tín hiệu lai và có một tỉ lệ nhỏ nhân tế bào có ba tín hiệu lai đều... hỏi phải có tính chính xác cao vì kết luận đó sẽ đưa đến hành động can thiệp chấm dứt thai kỳ hoặc sẽ không cần can thiệp gì thêm Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối để phân tích bộ nhiễm sắc thể thai nhi đã được xem là một kỹ thuật chẩn đoán mang tính chính xác cao và đã được ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh suốt một thời gian dài Tuy nhiên việc phân tích bộ nhiễm sắc thể đòi hỏi phải thực hiện trên các... không đồng bộ về kích thước của tín hiệu lai và có một tỉ lệ nhỏ nhân tế bào có ba tín hiệu lai đều được loại trừ sau khi thực hiện kỹ thuật FISH lần hai và kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối Như vậy đối với các trường hợp nghi ngờ tam nhiễm sắc thể chúng ta nên thực hiện kỹ thuật FISH lần thứ hai, nếu tỉ lệ nhân tế bào có 3 tín hiệu giảm nhiều so với lần đầu thì có thể kết luận bình thường Đối với trường... trong mẫu nghiên cứu này không có trường hợp thất bại kỹ thuật FISH do lẫn máu mẹ Chúng tôi thực hiện xử lý pepsin các nhân tế bào ối với thời gian thích hợp cho từng nhóm tuổi thai, đảm bảo đủ thể tích đoạn dò DNA cần thiết và đảm bảo điều kiện lai tối ưu nhằm mục đích giảm trường hợp tín hiệu lai yếu Trong mẫu nghiên cứu này có 1 trường hợp tín hiệu lai yếu do người gởi mẫu xét nghiệm không nhớ chính... chúng tôi năm 2003[1] cũng đã cho thấy khi chỉ thu thập 2 – 3 ml dịch ối thì chắc chắn sẽ có một số trường hợp không thực hiện kỹ thuật FISH được vì không đủ tế bào để phân tích Các nghiên cứu xác định tính đặc hiệu của đoạn dò DNA được sử dụng đều cho thấy phần lớn những trường hợp lai không đặc hiệu, độ sáng của tín hiệu không ổn định đều liên quan đến những đoạn dò DNA tự tổng hợp hoặc những đoạn dò . ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TÓM TẮT Đặt vấn đề: Phần lớn các dị bội nhiễm sắc thể được chẩn đoán trước sinh liên quan đến các nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X và Y. Kỹ thuật lai. lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) giúp xác định nhanh các bất thường về số lượng của nhiễm sắc thể trên nhân tế bào ở gian kỳ. Mục tiêu: Xác định tính hiệu quả của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ. bội đã được phát hiện thông qua kỹ thuật FISH. Không có trường hợp âm tính giả hay dương tính giả nào được ghi nhận. Kết luận: Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trên nhân tế bào ối ở gian kỳ