ỨNG DỤNG RT-PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN SỚM VIRUS DENGUE TÓM TẮT Đặt vấn đề: Vấn đề chẩn đoán sốt xuất huyết trong thời kỳ đầu của bệnh là khó, lâm sàng chưa rõ ràng, đòi hỏi cận lâm sàng như Mac-ELISA, kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription–polymerase chain reaction) sẽ chẩn đoán nhanh, nhạy và đặc hiệu SXH-D, phân loại vi-rút dengue. Mục tiêu nghiên cứu: Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện sớm và chính xác vi-rút dengue trong máu bệnh nhi sốt xuất huyết giúp bác sĩ lâm sàng xác định sớm SXH-D. Phương pháp nghiên cứu: Đây là một nghiên cứu áp dụng kỷ thuật RT-PCR để xác định virus Dengue trong máu bệnh nhi đang bị bệnh sốt xuất huyết dengue trong vòng 3 ngày đầu tiên mắc bệnh. 30 ca trẻ bệnh Sốt xuất huyết Dengue đang nằm theo dõi điều trị trong bệnh viện Nhi đồng Cần thơ đã được chọn v ào nghiên cứu, năm 2006. Số liệu được phân tích bởi chương trình SPSS để đo lường xác xuất các biến số. Kết quả nghiên cứu: đã chỉ rõ Kỷ thuật RT-PCR có khả năng xác định 80% virus sốt xuất huyết trong vòng 3 ngày đầu mắc bệnh sốt xuất huyết. - RT-PCR có thể định rõ các typ virus DenI, DenII, DenIII tại Cần Thơ trong năm 2006. - RT-PCR có giá trị chẩn đoán nhanh và chính xác Virus Dengue trong sốt xuất huyết. Kết luận: Kỷ thuật RT-PCR có khả năng xác định 80% virus sốt xuất huyết trong vòng 3 ngày đầu mắc bệnh sốt xuất huyết.Do đó có thể dùng phổ cập trên lâm sàng. ABSTRACT USING RT-PCR TEST TO IDENTIFY DENGUE VIRUS IN CHILDREN OF CASES DENGUE HEMORRHAGIC FEVER DURING EARLY DAYS IN CANTHO Pham Hung Luc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 12 - Supplement of No 4 - 2008: 263 - 267 Background: The diagnosis of Dengue fever during early days is dificulty, clinical symtoms are not clear, It is required doing some specicial tests to confirm virus Dengue. As Elisa test,RT-PCR test are necessary. Objective: To use RT-PCR test to identify Dengue virus in the blood of patients. Method: This study is applied RT-PCR technic to identify virus Dengue in blood of the cases Dengue hemorrhagic fever durring the first 3 day of disease. 30 children of cases Dengue hemorrhagic fever in the Children hospital of Cantho to be selected in research, in the year 2006. Data was analized by SPSS pragramme to measure the frequency of variables. Rresult: This study was showed that RT-PCR technic is capable to determine 80% of cases Dengue Fever Virus durring the first 3 day of disease. - RT-PCR can identify Dengue type I, type II, Type III at Cantho in the year 2006. - RT-PCR is a value test to diagnosis Virus Dengue in case of hemorrhagic fever dengue. ĐẶT VẤN ĐỀ *Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Sốt xuất huyết Dengue (SXH-D) do vi-rút dengue thuộc 4 týp (DEN-1, DEN- 2, DEN-3 và DEN-4) và lây truyền qua muỗi Aedes aegypti (6,16,26) . Theo báo cáo năm 1999 của Bộ Y tế, SXH-D ở nước ta có tỷ lệ chết/mắc trung bình là 0,23%. Bệnh có nhiều thể lâm sàng, thể nhẹ có sốt phát ban đến thể nặng có xuất huyết dễ dẫn đến tử vong nếu không được xử trí tích cực kịp thời. Về điều trị, chủ yếu là bồi hoàn dịch một cách thận trọng, đủ và đúng. Vì vậy, việc chẩn đoán sớm và nhanh có ý nghĩa rất lớn với kết quả điều trị và diễn tiến của bệnh. Vấn đề là những ngày đầu của bệnh khó chẩn đoán là do sốt xuất huyết, lâm sàng chưa rõ ràng, đòi hỏi cận lâm sàng như Mac-ELISA, sắc ký miễn dịch, kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription–polymerase chain reaction) sẽ chẩn đoán nhanh, nhạy và đặc hiệu SXH-D, có khả năng phân loại vi-rút dengue. Nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện sớm và chính xác vi-rút dengue trong máu bệnh nhi sốt xuất huyết giúp bác sĩ lâm sàng xác định sớm SXH-D. Mục tiêu nghiên cứu 1. Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện sớm vi-rút dengue ở bệnh nhi sốt xuất. 2. Xác định týp vi-rút dengue bằng kỹ thuật RT-PCR. Bệnh nhi theo dõi SXH-D Rút máu Trích huyết thanh Kỹ thuật RT-PCR (ngay sau nhập viện) Test nhanh (ngày 5 của bệnh) Phân loại vi-rút Dengue Công thức máu: - Hematocrite - Tiểu cầu - Bạch cầu - Công thức bạch cầu Chẩn đoán SXH-D Thu thập số liệu Xử lý số liệu 3. Xác định giá trị của RT-PCR với xét nghiệm chẩn đoán nhanh và chẩn đoán dựa theo tiêu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới trong việc chẩn đoán sớm bệnh sốt xuất huyết. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các bệnh nhi theo dõi SXH-D vào điều trị tại khoa Sốt xuất huyết Bệnh viện Nhi đồng Cần Thơ từ 01/10/2006 đến 31/12/2006. * Tiêu chuẩn chọn bệnh: Tuổi 15h, Sốt cao ( 39 0 C) từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 3 của bệnh không có tiêu điểm nhiễm trùng. Có dấu dây thắt dương tính hoặc biểu hiện những dấu xuất huyết. * Tiêu chuẩn loại trừ: + Những bệnh nhi mắc các bệnh khác như xuất huyết giảm tiểu cầu, thiếu máu tán, huyết tự miễn, viêm đa khớp dạng thấp, lupus, suy tủy, leucemie, hemophilie, + Sốt 4 ngày kèm hay không kèm dấu xuất huyết. Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Tuy nhiên do kinh phí có hạn không cho phép nghiên cứu mẫu lớn cho nên chúng tôi chọn cỡ mẫu 30 là cỡ mẫu nhỏ nhất nhưng vẫn đáp ứng được độ tin cậy trong thống kê số liệu. Sơ đồ nghiên cứu: Phương pháp thu thập số liệu Tất cả bệnh nhi đúng với tiêu chuẩn chọn bệnh được đưa vào nhóm nghiên cứu, sẽ được khám và làm các xét nghiệm, theo dõi diễn tiến bệnh cho đến khi ra viện hay tử vong và được thu thập số liệu theo bộ thu thập số liệu soạn sẵn ở phần phụ lục. Các xét nghiệm được thực hiện trên mỗi bệnh nhi: + Công thức máu: Hematocrite, tiểu cầu, bạch cầu, công thức bạch cầu. + Xét nghiệm chẩn đoán nhanh sốt xuất huyết. + Kỹ thuật RT-PCR. Phân tích số liệu Nhập và phân tích số liệu theo phần mềm SPSS 12.0. Từ đó tính tỷ lệ các bảng phân phối tần suất hay vẽ biểu đồ. Dùng phép kiểm định hoặc phép kiểm định Fisher’s Exact Test ở bảng 2×2. Phân tích, so sánh, diễn giải kết quả. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Từ ngày 01 tháng 10 năm 2006 đến ngày 31 tháng 12 năm 2006, chọn được 30 bệnh nhi đạt điều kiện chọn mẫu, qua theo dõi không có trường hợp nào tử vong. Bảng 1: Phân bố mẫu nghiên cứu theo tuổi và giới Nhóm tuổi Nam % Nữ % n (%) < 7 tuổi 3(10) 1(3,3) 4(13,3) 7-11 tuổi 4(13,3) 8(26,7) 12(40) 12-15 tuổi 8(26,7) 6(20) 14(46,7) Tổng số 15 15 30 Nhận xét: Trong 30 mẫu nghiên cứu có 15 nam (50%) và 15 nữ (50%). Nhóm tuổi 12 - 15 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (46,7%). [...]... (16,7%) - Chẩn đoán giữa RT-PCR với WHO là phù hợp - Sự khác biệt giữa RT-PCR với test nhanh trong chẩn đoán SXH-D là RTPCR cho kết quả chẩn đoán bệnh chính xác, còn test nhanh chẩn đoán sốt xuất chỉ giúp gợi ý chẩn đoán - Kỹ thuật RT-PCR có giá trị tốt để chẩn đoán, định týp vi-rút, mở rộng nghiên cứu về gen và phả hệ của vi-rút dengue trong tương lai ... huyết là 18/29 (62%) Trong nghiên cứu này, chúng tôi dựa vào RT-PCR và test nhanh, nhằm để so sánh mức độ phù hợp giữa hai xét nghiệm này trong chẩn đoán SXH Kết quả khác biệt giữa hai xét nghiệm là có ý nghĩa (p = 0,01) Điều này có nghĩa là RT-PCR cho kết quả chẩn đoán bệnh chính xác, còn test nhanh chẩn đoán sốt xuất huyết chỉ giúp gợi ý chẩn đoán, phải kết hợp thêm với lâm sàng thì không bỏ sót những... Tổng số 70, bệnh Tổng 30 100 số Nhận xét: Có 24/30 (80%) chẩn đoán SXH-D theo WHO Bảng 11: Số ngày chẩn đoán SXH-D theo WHO Chẩn đoán SXH-D (WHO) (%) Ngày 13 54,1 Ngày 9 37,5 Ngày 1 4,2 3 4 5 Ngày 1 4,2 Tổng 24 100 6 số Nhận xét: Có 13 trường hợp (54,1%) được chẩn đoán vào ngày 3 và 1 trường hợp (4,2%) được chẩn đoán vào ngày 5, ngày 6 BÀN LUẬN Test RT-PCR khảo sát 30 mẫu huyết thanh của những bệnh nhi... bệnh - Kỹ thuật RT-PCR định týp vi-rút dengue trong quý IV năm 2006 cho kết quả sau: týp vi-rút dengue 2 là týp chủ yếu (70,8%), týp vi-rút dengue 1 chiếm 12,5%, týp vi-rút dengue 3 chiếm 16,7%, không có xuất hiện týp vi-rút dengue 4 ở thời điểm lấy mẫu, tập trung ở 3 tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long, bốn trường hợp SXH-D độ III đều rơi vào týp vi-rút dengue 2 (16,7%) - Chẩn đoán giữa RT-PCR với WHO... tính giả, âm tính giả RT-PCR định týp vi-rút Dengue Kết quả cho thấy týp vi-rút dengueI là 70,8%, týp vi-rút dengueII (12,5%) và týp vi-rút dengue III (16,7%) Tuy nhiên, không phát hiện týp vi-rút dengue 4 trong thời điểm này (Bảng 7) Cần Thơ (8DEN-2, 2DEN-1), Hậu Giang (7DEN-2, 2DEN3) và Vĩnh Long (1DEN-1, 2DEN-2, 2DEN-3) KẾT LUẬN - Kỹ thuật RT-PCR có thể chẩn đoán xác định sớm SXH-D trong 3 ngày... hợp RT-PCR dương tính, (6 nam, 5 nữ) và ở nhóm < 7 tuổi có 3 trường hợp RT-PCR dương tính chỉ gặp ở nam Bảng 6: Kết quả RT-PCR và xét nghiệm chẩn đoán nhanh sốt xuất huyết RT-PCR Tổng số Âm Dương tính tính P và Test n n% % Dương 18 2 19 tính 94,7 5,3 Test nhanh Âm 4 6 60 tính 10 40 Tổng số 24 6 p = 0,019 29 Nhận xét: Có 94,7% ca RT-PCR dương tính và test nhanh dương tính, nhưng chỉ có 60% trường hợp RT-PCR. .. tính Sự khác biệt về RT-PCR so với test nhanh có ý nghĩa thống kê ( Kết quả RT-PCR định týp vi-rút Dengue Bảng 7: Kết quả RT-PCR định týp vi-rút dengue Týp vi-rút dengue n % , p = 0,019) DEN-1 3 12 DEN-2 17 70,8 DEN-3 4 16,7 Nhận xét: Kết quả định týp vi-rút dengue chỉ thu được ba týp (DEN-1, DEN-2 và DEN-3), trong đó DEN-2 chiếm tỷ lệ cao nhất 70,8% Bảng 8: Kết quả định týp vi-rút dengue theo giới tính... số Nhận xét: Ca bệnh ở Cần Thơ chiếm tỷ lệ cao nhất 43,3%, nam 23,3%, nữ 20% Kết quả RT-PCR Bảng 3: Kết quả RT-PCR RT-PCR (%) Dương tính 24 (80) Âm tính 06(20) Tổng số 30(100) Nhận xét: Kết quả RT-PCR có 24/30 mẫu huyết thanh dương tính (80%) Bảng 4: Kết quả RT-PCR phát hiện vi-rút dengue theo số ngày sốt Số Dengue Dengue n (%) ngày sốt (+) (%) (-) (%) Ngày 1(3,3) 0 1(3,3) 8(26,7) 0 8(26,7) 1 Ngày 2... được 24 trường hợp RT-PCR cho kết quả dương tính, 80% (Bảng 3) Kết quả này tương đối phù hợp với một số tác giả khác như: Hồ Minh Châu 80%, Đỗ Quang Hà 77%, Nguyễn Trung Lập 63% Kết quả dương tính trong 3 ngày đầu của bệnh (Bảng 3.4), và ngày đầu tiên của bệnh.cho thấy được thế mạnh của RT-PCR trong việc chẩn đoán sớm bệnh.Trong các ca RT-PCR cho kết quả dương tính thì test nhanh chẩn đoán sốt xuất huyết... Hậu Giang Bảng 9: Mối liên quan giữa týp vi-rút dengue và phân độ lâm sàng Phân độ lâm sàng n Đ Đ % ộ I+II p vi-rút 12, 3 -1 % ộ III DEN Tý % 12, 0 5 0 3 5 dengue DEN 54, 13 -2 16, 1 4 1 7 DEN 7 -3 16, 0 0 4 7 7 83, 20 16, 2 4 3 100 7 4 Nhận xét: Có 4 trường hợp SXH-D độ III (16,7%) đều là DEN-2 Chẩn đoán SXH-D theo tổ chức y tế thế giới Bảng 10: Chẩn đoán SXH-D (WHO) SXH-D (WHO) (%) Có 24 80 06 20 . ỨNG DỤNG RT-PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN SỚM VIRUS DENGUE TÓM TẮT Đặt vấn đề: Vấn đề chẩn đoán sốt xuất huyết trong thời kỳ đầu của bệnh là khó,. Chẩn đoán SXH-D Thu thập số liệu Xử lý số liệu 3. Xác định giá trị của RT-PCR với xét nghiệm chẩn đoán nhanh và chẩn đoán dựa theo tiêu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới trong việc chẩn đoán sớm. RT-PCR (reverse transcription–polymerase chain reaction) sẽ chẩn đoán nhanh, nhạy và đặc hiệu SXH-D, có khả năng phân loại vi-rút dengue. Nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện sớm