Dinh dưỡng của vi sinh vật – Phần 4 13.1.4. Khái niệm về sự sinh trưởng trong điều kiện hạn chế các chất dinh dưỡng Ở môi trường nuôi cấy lắc trong phòng thí nghiệm, khi tất cả các chất dinh dưỡng được cung cấp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật đã được thiết kế tối ưu thì sự dư thừa xảy ra vào lúc đầu và các tế bào sinh trưởng theo logarit với tốc độ sinh trưởng là lớn nhất. Tuy nhiên, trong mỗi hệ thống môi trường và kỹ thuật nuôi cấy, sự sinh trưởng của vi sinh vật không thể tiếp diễn mãi mà không bị giới hạn trong một khoảng thời gian dài. Một tính toán đơn giản để chứng minh nhận định này là: sau 2 ngày sinh trưởng theo logarit, một tế bào vi sinh vật cứ 20 phút lại nhân đôi một lần sẽ tạo ra xấp xỉ 2 x 10 43 tế bào. Giả sử khối lượng trung bình của mỗi tế bào là 10 -12 g thì toàn sinh khối tế bào trên sẽ có khối lượng gấp gần 400 lần khối lượng của quả đất. Vì vậy, trong mỗi một thể tích nuôi cấy, sự sinh trưởng luôn luôn sớm bị giới hạn do sự cạn kiệt của một hoặc vài chất dinh dưỡng. Thuật ngữ “các chất dinh dưỡng hạn chế” được sử dụng với rất nhiều ý nghĩa, và thường vẫn bị nhầm lẫn. Các chất dinh dưỡng hạn chế có khả năng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo hai cách riêng biệt: hóa học và và động học. Sự hạn chế hóa học được định nghĩa là khối lượng lớn nhất sinh khối có thể được tạo ra trong điều kiện giới hạn các chất dinh dưỡng. “Nguyên lý Liebig” bắt nguồn từ các nghiên cứu về sự màu mỡ trong nông nghiệp của Justus von Liebig vào năm 1840. Trong nghiên cứu này ông tìm ra rằng hàm lượng của một chất dinh dưỡng nào đó sẽ quyết định đến năng suất mùa màng, miễn là tất cả các chất dinh dưỡng khác đã có mặt một cách dư thừa (phương trình 1). Giới hạn động học xuất hiện khi nồng độ các chất dinh dưỡng là thấp (trong phạm vi từ miligram tới microgram trong mỗi lit), sự hạn chế các chất dinh dưỡng sẽ điều khiển tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (µ). Điều khiển động học về tốc độ sinh trưởng thường kéo theo các động lực bão hòa và phương trình Monod (phương trình 2) được sử dụng để mô tả mối quan hệ giữa nồng độ của các chất dinh dưỡng đối với tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (µ). X = X 0 + ( S 0 - S) x Y X/S (1) µ = µ max x x s / (K S + S) (2) Trong đó S 0 là nồng độ ban đầu và s là nồng độ cuối cùng của các chất dinh dưỡng bị hạn chế S; X(X 0 ) là nồng độ sinh khối (ban đầu); là sản lượng sinh khối thu được đối với chất dinh dưỡng S, µ max là tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất, và K S là hằng số ái lực cơ chất Monod. Điều này thể hiện rõ trong hình 13.2 đối với sự sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy kín. Các tế bào ban đầu sinh trưởng không giới hạn cho đến khi sự tiêu thụ các chất dinh dưỡng hạn chế bị hết dần, dẫn đến tốc độ sinh trưởng suy giảm dần, sau đó tốc độ sinh trưởng ngừng hẳn. Đó là lúc đạt đến nồng độ cuối cùng của sinh khối. Trong nuôi cấy liên tục, người bổ sung môi trường một cách liên tục và một lượng môi trường dư thừa được loại bỏ. Tốc độ bổ sung thêm vào của các chất dinh dưỡng bị hạn chế sẽ điều khiển đồng thời cả µ và nồng độ sinh khối trong môi trường nuôi cấy (Pirt, 1975; Kovarova và Egli, 1998). Hình 13.2: Động học của sự giới hạn sinh trưởng của vi sinh vật trong nuôi cấy đóng do giới hạn nồng độ của chất dinh dưỡng (cơ chất) S. S 0 là nồng độ cơ chất ban đầu, s là nồng độ thực của cơ chất, X là nồng độ sinh khối; X 0 : nồng độ sinh khối ban đầu; Y: sản lượng sinh khối thu được đối với cơ chất S. Trong thực nghiệm, người ta có thể nuôi cấy các tế bào trong các điều kiện đã được biết rõ, nhờ đó các chất dinh dưỡng hạn chế sẽ được xác định. Đối với việc nuôi cấy các vi sinh vật dị dưỡng để nghiên cứu và tạo ra các sản phẩm sinh khối, môi trường được thiết kế phổ biến với nguồn carbon và năng lượng giới hạn, tất cả các chất dinh dưỡng khác được cung cấp dư thừa. Tuy nhiên, trong quá trình công nghệ sinh học, sự giới hạn bởi các chất dinh dưỡng chứ không phải nguồn carbon giữ chức năng điều khiển các trạng thái sinh lý và quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Sự hạn chế các chất dinh dưỡng nào đó thường kích thích hoặc tăng cường sự tạo thành rất nhiều các sản phẩm trao đổi chất và các enzyme của vi sinh vật. Ví dụ, năng suất sẽ được tăng lên trong quá trình lên men tạo chất kháng sinh do sinh trưởng trong môi trường hạn chế photphat, sự sản xuất acid citric trong môi trường có sự hạn chế Fe-, Mn-, hoặc Zn. Còn sự sinh tổng hợp của NAD là được thực hiện trong điều kiện hạn chế Zn-Mn. Việc tích lũy các nguyên liệu dự trữ nội bào PHB hoặc PHA (chất dẻo sinh học-bioplastic) sẽ bị giới hạn bởi nguồn cung cấp hợp chất giàu nitrogen. Rõ ràng là sự sinh trưởng của vi sinh vật được điều khiển thường xuyên không phải chỉ bởi một chất dinh dưỡng mà bởi sự kết hợp của hai hay nhiều chất dinh dưỡng đồng thời (Kovarova và Egli, 1998). 13.1.5. Thiết kế và phân tích môi trường sinh trưởng tối thiểu Để sinh trưởng và tổng hợp các nguyên liệu tế bào cho bản thân mình, vi sinh vật phải thu nhận các thành phần cấu trúc (hay các tiền chất của chúng) và năng lượng cần thiết từ môi trường sống. Do đó, để nuôi cấy vi sinh vật trong phòng thí nghiệm thì các chất dinh dưỡng phải được cung cấp đầy đủ vào môi trường và các chất dinh dưỡng phải ở dạng mà các vi sinh vật này có thể sử dụng được. Do có sự đa dạng sinh lý của thế giới vi sinh vật mà có vô số các môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau đã được đưa ra, với mục đích hoặc là làm giàu một cách chọn lọc hoặc là để nuôi cấy một nhóm ví sinh vật đặc thù nào đó (LaPage và cs, 1970; Balows và cs 1992; Atlas, 1997). Tất cả các môi trường này đều chứa các thành phần với các chức năng dinh dưỡng rõ ràng, đặc biệt là cân nhắc về chức năng cấu trúc hoặc sinh năng lượng. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu về chất dinh dưỡng được tiến hành định tính chứ không phải định lượng và các chất dinh dưỡng khác nhau được thêm vào nhiều hơn hay ít hơn một cách tùy ý. Ngoài ra, rất nhiều các môi trường nuôi cấy có chứa các thành phần không được biết rõ ràng bởi vì sử dụng các nguyên liệu hữu cơ như ngô, khoai tây,… Trong cùng những điều kiện như: nhiệt độ hoặc pH, tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất của vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi sự đa dạng của các chất dinh dưỡng trong môi trường. Điều này được minh họa một cách cụ thể đối với sự sinh trưởng của Salmonella typhimurium (thí nghiệm bởi Schaechter và cs, 1958). Họ đã sử dụng 22 môi trường có thành phần khác nhau và nhận thấy các tốc độ sinh trưởng khác nhau ở các môi trường trong các điều kiện dư thừa các chất dinh dưỡng. Kết quả cho thấy chất lượng các tiền chất đưa vào môi trường khoáng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng một cách rõ ràng nhất. A. Thiết kế môi trường và kiểm tra các chất dinh dưỡng giới hạn 1. Thiết kế môi trường sinh trưởng Trong thiết kế môi trường sinh trưởng, quyết định đầu tiên được đưa ra là chọn lựa nồng độ cao nhất cho phép tạo ra sinh khối (X max ), và xác định các chất dinh dưỡng giới hạn (theo nguyên lý Liebig). Điển hình, môi trường sinh trưởng cho các vi sinh vật dị dưỡng được thiết kế với nguồn năng lượng - carbon riêng biệt sẽ giới hạn lượng sinh khối được tạo ra, nhưng ngược lại tất cả các chất dinh dưỡng khác (được thêm vào dưới dạng các hợp chất đơn) được cung cấp dư thừa. Dựa vào giá trị X max , có thể tính toán được nồng độ tối thiểu của các nguyên tố khác nhau cần thiết trong môi trường nuôi cấy. Để đảm bảo sự dư thừa của tất cả chất dinh dưỡng không giới hạn trong môi trường thì nồng độ của chúng được nhân với nhân tố dư (F E ). Bằng cách này, nồng độ của chất dinh dưỡng đòi hỏi trong môi trường tăng trưởng (E req ) gấp x lần theo lý thuyết đối với nguồn carbon. E req = X max / Y X/E x F E (3) Y X/E (the individual average elemental growth yield) là sản lượng tăng trưởng trung bình dựa trên từng nguyên tố. Một ví dụ cho việc thiết kế môi trường khi giới hạn nguồn carbon, cho phép tạo sản lượng sinh khối khô đạt 10g/l sinh (bảng 13.13). Cần chú ý rằng, trong môi trường này các thành phần được lựa chọn sao cho có thể thay đổi nồng độ của mỗi nguyên tố (ví dụ có thể thay thể MgCl 2 và NaHSO 4 bằng MgSO 4 ). Hơn nữa, môi trường này chỉ có tính chất đệm yếu (weakly buffered), do đó cần thiết phải khống chế pH trong suốt quá trình sinh trưởng. Cách thức này được sử dụng cho việc thiết kế môi trường nuôi cấy các vi sinh vật hiếu khí với mật độ sinh khối thấp và trung bình. Phức tạp hơn là thiết kế của môi trường cho nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí, trong đó rất nhiều thành phần của môi trường dễ dàng kết tủa tại thế oxy hóa khử cần thiết, hoặc mật độ tế bào cao trong đó có chứa các chất hòa tan hoặc vấn đề độc tính của một số môi trường. Bảng 13.13: Thiết kế môi trường tối thiểu bị giới hạn bời nguồn C cho phép sản lưởng sinh khối khô đạt 10g/l a,b Thành ph ần môi trường Nguồn Năng su ất sinh trưởng (g sinh kh ối khô/g nguyên tố) Các nhân t ố d ự thừa với nguồn carbon tương ứng Khối lư ợng các nguyên t ố (g/l) Khối lượn g các thành ph ần cấu tạo (g/l) Glucose C, năng lượng 1 1 10 25.0 NH 4 Cl N 8 3 3.75 14.33 NaH 2 PO 4 P 33 5 1.52 5.88 KCl K 100 5 0.5 0.95 NaH 2 SO4 Na 100 5 0.5 1.87 MgCl 2 Mg 200 5 0.25 0.98 CaCl 2 Ca 100 10 1.0 2.77 FeCl 2 Fe 200 10 0.5 1.13 MnCl 2 Mn 10 4 20 0.02 0.046 ZnCl 2 Zn 10 4 20 0.02 0.042 CuCl 2 Cu 10 5 20 0.002 0.0042 CoCl 2 Co 10 5 20 0.002 0.0044 a. Dựa vào sản lượng tăng trưởng của các nguyên tố trong sinh khối khô. b. Theo Pirt (1975), Egli và Fiechter (1981). Sản lượng tăng trưởng của C và các nguyên tố vết Zn, Cu, Mo, Mn Nhân tố Y X/E được phân tích từ sinh khối khô khi nuôi cấy trong điều kiện không giới hạn tăng trưởng của hệ thống đóng. Đối với carbon, oxy, và hydro, Y X/E không thể được tính toán chính xác trực tiếp từ các thành phần cơ bản của tế bào do những thành phần này không chỉ tạo nên sinh khối, mà còn có các chức năng trao đổi chất khác.Ngoài ra, trong bảng không nói đến một số lượng lớn các chất nhận điện tử cần thiết phải được đảm bảo cho quá trình sinh trưởng. Tính chất hóa học của các thành phần trong môi trường sinh trưởng phải được tính đến khi chọn F E . Ví dụ, phần lớn các nguyên tố vi lượng dễ dàng kết tủa trong môi trường sinh trưởng ở pH trung tính hoặc kiềm và do đó giảm bớt khả năng hấp thụ sinh học (khó khăn để xác định). Do đó, chúng được thêm vào nhiều gấp 10 tới 20 lần (Bridson và Brecker, 1970). Trong công nghệ sinh học, quá trình nuôi cấy theo mẻ (batch) và nuôi cấy theo mẻ có bổ sung (fed-batch) được nghiên cứu từ lâu vì rất có lợi khi thiết kế các môi trường chứa tất cả nguyên tố với lượng chính xác lượng cần thiết, sao cho tất cả các nguyên tố phải được tiêu thụ hết tại cuối kì tăng trưởng. Tuy nhiên, rất khó khăn có thể đạt được điều này do tính đa dạng của các nguyên tố và sự phụ thuộc của chúng vào điều kiện nuôi cấy.Tất nhiên, trong công nghệ sinh học, việc tối ưu hóa môi trường là rất quan trọng để tính toán sự tiêu thụ chất dinh dưỡng và để hạn chế tối đa sự hao phí nguyên liệu, hóa chất. Bảng 13.14: Các nhân tố tăng trưởng sản lượng của các chất cho và nhận điện tử Các chất cho điện tử H 2 Y X/H2 = 12g/mol S 2 O 3 Y X/S2O3 = 4g/mol Fe 2+ Y X/Fe2+ = 0.35g/mol [...]...NH4+ - NO3- YX/NH4 = 1.3-2.6/mol NO2_ - NO3 YX/NO2 = 0.9-1.8g/mol Chất nhận điện tử O2 YX/O2 = 10a -42 bg/mol NO3- - N2 YX/NO3 = 27g/molc NO2- - N2 YX/NO2 = 17g/molc N2O- - N2 YX/N2O = 9g/molc a Đối với các cơ chất khử là methane hoặc n-alkanes b Đối với . Dinh dưỡng của vi sinh vật – Phần 4 13.1 .4. Khái niệm về sự sinh trưởng trong điều kiện hạn chế các chất dinh dưỡng Ở môi trường nuôi cấy lắc trong. chất dinh dưỡng phải được cung cấp đầy đủ vào môi trường và các chất dinh dưỡng phải ở dạng mà các vi sinh vật này có thể sử dụng được. Do có sự đa dạng sinh lý của thế giới vi sinh vật mà. tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất của vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi sự đa dạng của các chất dinh dưỡng trong môi trường. Điều này được minh họa một cách cụ thể đối với sự sinh trưởng của Salmonella