i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được đề tài này, em đã nhận được sự giúp đỡ từ nhiều phía. Trước hết, em xin ghi công ơn của cha mẹ em và người thân đã luôn luôn bên cạnh em, giúp đỡ em vượt qua khó khăn trong suốt thời gian học đại học. Em sẽ mãi ghi nhớ công lao của thầy cô trong trường Đại học Nha Trang, đặc biệt các thầy cô trong khoa chế biến đã giúp em những kiến thức chuyen ngành cơ bản nhưng rất cần thiết sau khi ra trường. Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy T.S Nguyễn Minh Trí, Th.S Ngô Hoài Dương người đã trực tiếp hướng dẫn, thôi thúc và tận tình chỉ bảo, cho em những lời khuyên hữu ích trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy Cô quản lí phòng thí nghiệm cũng như viện công nghệ sinh học đã nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi cho cho em trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng em xin cảm ơn các bạn bè của em, những người không những động viên mà còn cùng sát cánh với em trong quá trình thực hiện đề tài cho đến khi chỉnh sửa bài cuối cùng. Sinh viên Nguyễn Hoàng Bảo Trung. ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v Chương I. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương II. TỔNG QUAN 3 2.1. TỔNG QUAN VỀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG: [35] 3 2.1.1. Cấu tạo chung của tôm: 3 2.1.2. Thành phần hóa học của tôm 4 2.1.2.1. Protein 4 2.1.2.2. Nước 5 2.1.2.3. Vitamin và các chất khoáng 5 2.1.2.4. Các sắc tố 5 2.1.2.5. Các chất ngấm ra 6 2.2. TÌNH HÌNH KHAI THÁC, NUÔI TRỒNG, CHẾ BIẾN TÔM 6 2.3. TỔNG QAN VỀ ENZYME PROTEASE 7 2.3.1. Giới thiệu chung [3] 7 2.3.2. Phân loại protease 9 2.3.3. Nguồn thu nhận protease [32] 11 2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme [3] 11 2.4. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC: 14 2.5. ỨNG DỤNG PROTEASE 16 Chương ΙII. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát: 19 3.2.1.1. Xử lí đầu tôm: 21 iii 3.2.1.2. Thủy phân dịch chiết từ đầu tôm: 22 3.2.2. Bố trí thí nghiệm: 24 Chương IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 28 4.1.Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở các nhiệt độ khác nhau 28 4.1.1.Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 40°C 28 4.1.2 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 50°C 29 4.1.3 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 60°C 30 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở các pH khác nhau 32 4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=3 33 4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=6 34 4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=8 35 4.3 Đánh giá mức ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ và pH đến khả năng thủy phân của hệ protease có trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng bằng kiểm định thống kê ANOVA 37 KẾT LUẬN VÀ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của tôm thẻ (%) 3 Bảng 2.2: Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm [23] 4 Bảng 2.3: Thành phần khoáng trong thịt tôm (mg %) 5 Bảng 3.1: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 40 0 C 26 Bảng 3.2: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 50 0 C 26 Bảng 3.3: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 60 0 C 27 Bảng 3.4: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 70 0 C 27 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 20 Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lí đầu tôm 21 Hình 3.3: Sơ đồ quy trình thủy phân dịch chiết đầu tôm. 23 Hình 3.4: Bố trí thí nghiệm xác định khả năng thủy phân của hệ protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng. 25 Hình 4.1: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 40°C 28 Hình 4.2 : Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 50°C 30 Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 60°C 31 Hình 4.4: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 70°C 31 Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=3 33 Hình 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=6 34 Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=8 35 1 Chương I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, chế biến thủy sản được coi là hướng phát triển mũi nhọn của nền kinh tế biển. Trong đó, tôm là một mặt hàng có giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị kinh tế cao. Kim ngạch xuất khẩu từ các mặt hàng tôm ngày càng tăng. Do đó, đây là mặt hàng đã, đang và sẽ mang lại lợi ích vô cùng lớn cho nền kinh tế quốc dân. Sản lượng tôm xuất khẩu của năm 2010 đạt 241.000 tấn, tăng 13,4% so với năm 2009 và mang về hơn 2 tỷ USD [35]. Chúng ta tăng sản lượng sản phẩm chế biến từ tôm cũng đồng nghĩa với việc một lượng lớn phế liệu tôm được thải ra môi trường bên ngoài. Nếu không có hướng giải quyết thích hợp thì đây sẽ là một thảm họa nghiêm trọng đối với môi trường, đồng thời chính các doanh nghiệp cũng phải bỏ ra chi phí không nhỏ cho việc xử lí thải bỏ, thậm chí còn dẫn đến việc đóng cửa do không đủ năng lực giải quyết vấn đề ô nhiểm, gây ra nhiều hệ lụy về mặt kinh tế, xã hội tiếp sau đó. Đứng trước tình hình bức thiết của các doanh nghiệp chế biến tôm, hiện nay đã có nhiều nghiên cứu tận dụng nguồn phế liệu tôm đã được ứng dụng trong thực tế sản xuất: sản xuất chitin, chitosan, glucosamin, sản xuất xác chất khoáng, tận thu protein… Hàm lượng proteine chứa trong phế liệu tôm rất lớn gần 50% [23], tuy nhiên người ta chỉ mới thực hiện việc tận thu proteine đơn thuần (xay, nghiền phế liệu rồi phơi khô hay ép láy dịch rồi đi sấy khô làm thức ăn cho gia súc) hay thực hiện tận thu kết hợp với quy trình sản xuất khác… chính những điều này làm cho chất lượng proteine thu được không cao, chúng thường bị mất các đặc tính sinh học. Nhằm hướng đến việc tận thu nguồn các chất có giá trị sinh học từ đầu tôm: - Protein, các peptone, peptid có hoạt tính sinh học có lợi. - Tận thu dịch đạm acid amin. 2 - Ứng dụng sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa sinh, nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm thu hồi. - Nghiên cứu hiệu quả tương tác với các enzyme bổ sung từ bên ngoài vào trong các quá trình tận thu. Trên cơ sở hướng nghiên cứu nêu trên, trong giới hạn của đề tài, em tiến hành nghiên cứu ‘Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng thủy phân protein của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng’ 3 Chương II. TỔNG QUAN 2.1. TỔNG QUAN VỀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG: [35] Tôm thẻ chân trắng (Tên tiếng Anh: White Leg shrimp) được phân loại như sau: Ngành: Arthropoda Lớp: Crustacea Bộ: Decapoda Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeus Fabricius Giống: Penaeus Loài: Penaeus vannamei. 2.1.1. Cấu tạo chung của tôm: Tôm gồm hai phần, phần trước là đầu và ngực, phần sau là thân. Đầu tôm có cấu tạo nguyên thủy, mắt có cuống, chân có đốt, có hai đôi râu xúc giác, phần ngực được bao bọc bằng giáp đầu ngực, ba đôi chân đầu tiên được biến hóa thành chân hàm dung để đón thức ăn, năm đôi chân ngực còn lại dung để làm chân bò. Phần thân gồm có bảy đốt, có bảy đôi chân phân thành hai nhánh. Đốt cuối cùng hợp với chân bơi tạo thành đuôi để tạo nên bánh lái trong quá trình di chuyển. Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của tôm thẻ (%) Thành phần khối lượng (%) Thịt tôm Đầu Vỏ Tôm thẻ 60.00 31.00 9.00 4 2.1.2. Thành phần hóa học của tôm Thành phần hóa học của tôm bao gồm protein, lipid, tro, nước, vitamin, enzyme, muối vô cơ, glucid. Nhũng thành phần tương đối nhiều là nước, protein và một số muối vô cơ. Thành phần hóa học khác nhau tùy theo giống loài, trong những hoàn cảnh sinh sống khác nhau thì thành phần cũng khác nhau, ngoài ra chúng còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lí, đực cái, mùa vụ, thời tiết… Sự khác nhau về thành phần hóa học của tôm và sự biến đổi của chúng làm ảnh hưởng đến mùi vị, đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, đến việc bảo quản tươi nguyên liệu trong quá trình chế biến. Bảng 2.2: Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm [23] Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm (%) Protein Khoáng Lipid Đầu tôm thẻ 47,4±1,8 24,6±0,8 4,7±0,3 2.1.2.1. Protein Protein là thành phần chủ yếu trong thịt tôm, nó chiếm khoảng 70-80% tỉ lệ thịt theo chất khô. Proten trong tôm còn liên quan đến các chất hữu cơ, vô cơ khác tạo thành các chất có đặc tính sinh học đặc trưng khác nhau. Tùy theo loại tôm, mùa vụ, trạng thái sinh lí mà hàm lượng protein thay đổi trong khoảng 18-23%. Protein trong tôm có thể chia thành hai nhóm sau: - Chất cơ hòa tan (tương cơ): Bao gồm các chất sau: Actin, myozyn, troponyozyn, actonyozyn, chúng chiếm 70-80% hàm lượng protein và chúng có thể tan trong các dung dịch muối trung tính và nồng độ ion khá cao. 5 Ngoài ra còn có myoabumin, globumin và các enzyme, chúng chiếm từ 20-25% hàm lượng protein, chúng hòa tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion thấp. - Chất cơ bản: Colagen và elastin: chiếm khoảng hơn 3% hàm lượng protein liên kết, trong đó có khoảng 2,5% không hoàn thiện. 2.1.2.2. Nước Trong tôm hàm lượng nước chiếm tương đối cao từ 70-85%. Vì vậy thân tôm trở nên bóng và mềm mại tăng tính cảm quan, tuy nhiên cũng chính vì thế mà tôm dễ bị dập nát trong quá trình vận chuyển cũng như là môi trường thuận lợi cho enzyme và vi sinh vật phát triển. 2.1.2.3. Vitamin và các chất khoáng Lượng vitamin và các chất khoáng của tôm đặc trưng theo loại và sự biến đổi của mùa vụ, nhưng nhìn chung thì giàu vitamin A, B… Về mặt chất khoáng thì tôm được xem là nguồn quí về calcium, phospho, đồng và sắt. Bảng 2.3: Thành phần khoáng trong thịt tôm (mg %) Thành phần khoáng (mg %). Ca Phosphor Fe Ne K Mg Cu 29-50 53-67,6 1,2-5.1 11-127 127-565 0,0412 332 2.1.2.4. Các sắc tố Tôm chứa nhiều sắc tố khác nhau nhưng chủ yếu là astaxanthin, là dẫn xuất của canden. Trong thành phần vỏ tôm, astaxanthin tham gia vào thành phần của lipoprotein gọi là cianin. Ngoài ra trong tôm người ta còn phân li được sắc tố tím và đen là tiền astaxanthin và tetraxanthin. [...]... với chế độ 7000 vòng, 900 giây, 40C Sau khi li tâm, thu dịch và bỏ ph n cặn 3.2.1.2 Thủy ph n dịch chiết từ đầu tôm: 23 Dịch chiết đầu tôm Quan sát nhiệt độ Thủy ph n Quan sát thời gian Dịch thủy ph n Xác định hoạt độ Hình 3.3: Sơ đồ quy trình thủy ph n dịch chiết đầu tôm Thuyết minh: • Thủy ph n: Dịch chiết sau khi được li tâm sẽ được cho vào các ống nghiệm và tiến hành thủy ph n ở nhiệt độ và thời... CỨU VÀ BIỆN LUẬN 4.1 .Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở các nhiệt độ khác nhau 4.1.1 .Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 40°C Protease từ đầu tôm thẻ được tách chiết theo quy trình trên bằng cách hòa tan mẫu đã được làm nhỏ vào đệm phosphate... giá khả năng thủy ph n của protease có trong đầu tôm trước hết cần tách dịch chứa enzyme ra khỏi ph n bã Enzyme Protease có trong dịch chiết là hệ của nhiều enzyme Do vậy để tránh không bị mất enzyme do quá trình tinh chế, trong đề tài không có bước tách chiết và tinh chế enzyme Sử dụng cơ chất thủy ph n là protein có trong dịch enzyme để đánh giá khả năng thủy ph n của hệ các enzyme protease Khả năng. .. ở nhiệt độ 50°C 31 Ở pH 5, kết quả thu được cho thấy tác dụng thủy ph n protein tốt ở 2 giờ đầu, sau 2 giờ enzyme bị mất hoạt tính rõ Kết quả thủy ph n thấp hơn nhiều so với pH 7 Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 60°C 4.1.4 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch. .. kiện thủy ph n thích hợp (pH môi trường, nhiệt độ và thời gian thủy ph n) của hệ các enzyme này pH của dung môi chiết có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Tiến hành thu dịch chiết chứa các enzyme protease từ mẫu đầu tôm thẻ chân trắng bằng đệm phosphate với các pH từ 4 đến pH= 8 cùng với các tỷ lệ khối lượng mẫu/ dung dịch (w/v) là 1: 2, được giữ trong ngăn bảo quản lạnh 40C trong 40 ph t Sau đó lọc và. .. lạnh ở chế độ: 6000 vòng /ph t, thời gian 15 ph t, nhiệt độ 40C, thu được dịch chiết Hoạt tính của enzyme còn chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ trong quá trình thủy ph n vì nó liên quan đến độ bền protein dưới tác động của nhiệt độ trong thời gian nhất định Tiến hành thủy ph n dịch chiết ở các nhiệt độ: 40, 50, 60, 700C trong các bể ổn nhiệt, đồng thời với việc quan sát thời gian trong 6 giờ... 30 ph t để xác định hoạt độ của hệ protease 25 Mặt khác mục đích của đề tài là đánh giá khả năng thủy ph n của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng, cho nên trong dịch chiết mà chúng ta tiến hành khảo sát là một hệ gồm rất nhiều enzyme khác nhau với những điều kiện hoạt động thích hợp khác nhau Do đó tiến hành thực nghiệm theo các sơ đồ bố trí như sau: Dịch chiết đầu tôm pH 3... tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex H-75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp là 600C và 500C với pH tương ứng là 7,5 và 8,5 Tác giả còn cho thấy có thể sử dụng protease đầu tôm bộp để thủy ph n thu bột đạm từ ph liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy ph n cá [11] Nguyễn Việt Dũng đã thực hiện việc tách chiết protease từ thịt tôm sú và xác định hoạt động của chúng ở các nhiệt độ, pH khác... ph n ứng enzyme, tốc độ ph n ứng thủy ph n tỉ lệ với nồng enzyme Khi nồng độ enzyme quá cao nếu tiếp tục thêm enzyme, sự biến đổi của tốc độ thủy ph n là không đáng kể Vì vậy, tốt hơn là sử dụng nồng độ enzyme thích hợp để đạt hiệu quả thủy ph n cực đại và giảm giá thành ● Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Trong các ph n ứng do enzyme và cơ chất, trước hết ph i tạo thành ph c trung gian giữa enzyme và cơ... đổi 4.1.3 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 60°C Kết quả được trình bày ở ph n ph lục, Bảng 3 và được thể hiện trên đồ thị Hình 4.3 Qua lượng tyrosine hình thành được trình bày ở Hình 4.3 cho thấy khi ta tăng nhiệt độ thủy ph n lên 600C, ảnh hưởng của pH khá rõ Ở pH 8, kết quả tăng rõ ở 3,5 giờ đầu, sau đó enzyme bị . Khảo sát khả năng thủy ph n của hệ enzyme protease ở 50 0 C 26 Bảng 3.3: Khảo sát khả năng thủy ph n của hệ enzyme protease ở 60 0 C 27 Bảng 3.4: Khảo sát khả năng thủy ph n của hệ enzyme protease. ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH= 8 35 4.3 Đánh giá mức ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ và pH đến khả năng thủy ph n của hệ protease có trong. trên, trong giới hạn của đề tài, em tiến hành nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng thủy ph n protein của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng