26 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Nội dung nghiên cứu Nội dụng 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA trên môi trường nuôi cấy. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 29/1/2007 đến 13/08/2007 tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM. 3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro 3.3.1. Vật liệu 3.3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus). Nguồn mẫu để tiến hành thí nghiệm trong đề tài này được thu từ cây trồng trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học. Các cây Trường xuân hoa có độ tuổi từ 1 năm đến 1 năm rưỡi, cây khỏe và cho hoa đẹp. 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị phục vụ nuôi cấy mô như tủ cấy vô trùng, autoclave, bình tam giác, đĩa petri, bình nuôi cấy 500 ml, dao cấy, đèn cồn, máy đo pH, cân phân tích… 3.3.2. Điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS (Murashiga & Skoog, 1962) có bổ sung các hormone tăng trưởng BA, NAA, IAA tùy thí nghiệm. Điều kiện phòng nuôi in vitro: nhiệt độ: 24 ± 2 o C, ẩm độ: 55 % - 60 %, chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng là 1000 - 2000 lux. 27 3.3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro theo thời gian trên môi trƣờng MS có bổ sung NAA Thí nghiệm được tiến hành để xác định giai đoạn cây sinh trưởng tạo rễ tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA. Vì NAA thường được sử dụng ở nồng độ 0,5 mg/l cho nhiều loại cây nuôi cấy mô nên nồng độ này được chọn để thực hiện trong thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố. Mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, gồm 9 cây in vitro. Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro Nghiệm thức Hormone NAA 0,5 mg/l 1 2 - + (-) không có NAA trong môi trường nuôi cấy (+) có NAA trong môi trường nuôi cấy Số nghiệm thức: 2 Tổng số mẫu: 270 mẫu Để đánh giá tác động của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro, tiến hành đo chiều cao của cây - được tính từ chóp lá cao nhất đến gốc của cây, ghi nhận sự thay đổi về chiều dài rễ và số rễ được tạo thành trên cây. Đơn vị tính là mm. Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy. 3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA, IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Thí nghiệm được tiến hành với mục tiêu xác định nồng độ và loại chất kích thích sinh trưởng thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích cây tạo rễ. Thí nghiệm thực hiện trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (NAA, IAA) với các nồng độ 0,1 mg/l, 0,5 mg/l, 1 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l tùy từng nghiệm thức. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố, 6 nghiệm thức cho mỗi loại chất kích thích sinh trưởng với nghiệm thức 1 là đối chứng. Mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 9 cây in vitro. 28 Thí nghiệm 2a: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) 1(Đ/C) 0 2 0,1 3 0,5 4 1 5 5 6 10 Số nghiệm thức: 6 Tổng số mẫu: 162 mẫu Thí nghiệm 2b: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro Nghiệm thức Nồng độ IAA (mg/l) 1(Đ/C) 0 2 0,1 3 0,5 4 1 5 5 6 10 Số nghiệm thức: 6 Tổng số mẫu: 162 mẫu 29 Các chỉ tiêu theo dõi - Chiều cao cây (mm): được tính từ chóp lá cao nhất đến gốc của cây. - Chiều dài rễ (mm): được tính từ gốc cho đến phần tận cùng của rễ và tính theo chiều dài của rễ dài nhất. - Số rễ/cây: chỉ tính số rễ chính trên một cây. 3.3.4. Phƣơng pháp tiến hành Tạo nguyên liệu ban đầu Mẫu cấy: mẫu chồi nách được cắt từ cây Trường xuân hoa ngoài thiên nhiên và được khử trùng bề mặt với javel có nồng độ chlor là 38 g/lít được pha loãng với nước theo tỉ lệ 1/4 trong 20 phút, rửa sạch 3 – 5 lần với nước vô trùng, sau đó mẫu được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường MS. Nhân chồi từ đoạn thân mang chồi bên và chuẩn bị mẫu thí nghiệm Sau 2 tuần vô mẫu, tách chồi và cấy chuyền trong tủ cấy vô trùng. Chồi được tái nuôi cấy thường xuyên để tăng số lượng chồi cho mô cấy. Cắt mỗi đoạn thân dài khoảng 2 cm từ cây con in vitro, trên môi trường MS có mang một nách lá cắm vào môi trường có NAA, IAA để kích thích cho cây ra rễ. 3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA trên môi trƣờng nuôi cấy 3.4.1. Vật liệu 3.4.1.1. Mẫu kiểm tra Cây Trường xuân hoa in vitro đã qua nuôi cấy ở nội dung 1. 3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg Bình lóng 100 ml Bình tam giác Dụng cụ thủy tinh Máy đông khô Tủ âm 20 o C, tủ mát 4 o C Pipet, máy xay sinh tố 30 3.4.1.3. Hóa chất Hoá chất chiết alkaloid HCl 1 N Chloroform CH 3 Cl NH 4 OH 25% Methanol Cyclohexan Isopropyl alcohol Acid acetic 0,01 M Hóa chất định tính alkaloid Thuốc thử Wagner: Hòa tan 1,27 g I 2 và 2 g KI trong 100 ml nước cất. Hoá chất sử dụng cho máy CE Amonium acetate 0,2 M NaOH 0,1 M Nước khử ion Các chất chuẩn để chạy máy CE Vinblastine sulfate, vincristine sulfate, catharanthine, vindoline 3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner Thí nghiệm 1a: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có NAA bằng thuốc thử Wagner Mục tiêu của thí nghiệm là kiểm tra sự hiện diện của alkaloid trong cây nuôi cấy mô sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có và không có bổ sung NAA và xác định giai đoạn cây Trường xuân hoa in vitro sản xuất nhiều alkaloid nhất. Chỉ tiêu theo dõi: quan sát phản ứng của dịch chiết alkaloid khi có mặt của thuốc thử. Phản ứng dương tính khi có vòng nhẫn màu nâu đỏ, nếu alkaloid nhiều có thể quan sát thấy kết tủa. 31 Thí nghiệm 1b: Định tính alkaloid trong thân lá và rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có chứa IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner Thí nghiệm được tiến hành để xác định chất kích thích sinh trưởng với nồng độ thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích cây sản xuất nhiều alkaloid nhất. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát phản ứng của dịch chiết alkaloid trong từng bộ phận cây nuôi cấy mô trên môi trường MS có bổ sung IAA, NAA ở nồng độ khác nhau khi có mặt của thuốc thử. 3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định quy trình ly trích tốt nhất các alkaloid trong cây Trường xuân hoa. Các mẫu ly trích thu thập từ cây Trường xuân hoa trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học. Dịch chiết alkaloid sẽ được xác định hàm lượng bằng CE. Quy trình ly trích được chọn sẽ sử dụng cho các thí nghiệm sau. Chỉ tiêu theo dõi Để đánh giá hiệu quả của hai quy trình ly trích, so sánh hàm lượng alkaloid thu được từ dịch chiết cây Trường xuân hoa in vivo sau khi phân tích bằng CE, dựa vào alkaloid chuẩn. Công thức tính hàm lượng alkaloid dựa vào chất chuẩn C alkaloid (mg/l) = x* C c * S alkaloid /S c x: độ pha loãng của mẫu C c : nồng độ của chất chuẩn (ppm) S c : diện tích của píc chuẩn 3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và cây Trƣờng xuân hoa in vivo Thí nghiệm được thực hiện để so sánh hàm lượng alkaloid có trong mẫu thu được từ cây nuôi cấy mô - in vitro và cây ngoài tự nhiên - in vivo. Từ đó đánh giá hiệu quả của việc sử dụng cây Trường xuân hoa nuôi cấy mô sản xuất các hợp chất 32 mong muốn. Mẫu cây Trường xuân hoa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS và mẫu cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi kể từ khi hạt nảy mầm trong vườn ươm được dùng làm vật liệu cho thí nghiệm này. Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo và cây in vitro được xác định bằng CE sau quá trình ly trích. 3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE Mục tiêu của thí nghiệm là xác định được hàm lượng catharanthine, vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng ở nồng độ thích hợp (đã xác định ở thí nghiệm 1b) qua các giai đoạn. Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng alkaloid thu được từ cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trưởng (7, 14, 21, 28, 35 ngày). 3.4.3. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trƣờng xuân hoa Phương pháp định tính qua 2 bước sau: - Chiết alkaloid ra khỏi tế bào thực vật bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm: mẫu vật liệu khô được xay nhuyễn và cân khoảng 2 gram bột tẩm kỹ với dung dịch NH 4 OH, để khô ngoài không khí, dùng 15 ml chloroform cho vào nguyên liệu, đậy nút ngâm trong 24 giờ. Sau đó mang đi lọc, dịch lọc được cô đặc và trích lại bằng dung dịch H 2 SO 4 loãng (Nguyễn Ngọc Hồng, 2004). - Định tính bằng thuốc thử: nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dịch chiết alkaloid, sẽ xuất hiện lượng kết tủa khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng alkalod trong mẫu phân tích. 3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trƣờng xuân hoa  Quy trình 1: Ly trích alkaloid từ vật liệu tƣơi Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu cây Trường xuân hoa Thu mẫu cây Trường xuân hoa, rửa sạch, để ráo nước. 33 Bƣớc 2: Ly trích alkaloid (xem sơ đồ 3.1) Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi [11].  Quy trình 2: Ly trích alkaloid từ vật liệu khô Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu cây Trường xuân hoa Mẫu cây được rửa sạch, để ráo nước và mẫu được trữ trong tủ âm 20 o C ít nhất 30 phút trước khi đem đông khô. Sau khi đông khô mẫu được bảo quản trong tủ hút ẩm để tránh làm ảnh hưởng đến quá trình phân tích mẫu sau này. Bƣớc 2: Ly trích alkaloid (xem sơ đồ 3.2) Dịch chiết isopropanol Nguyên liệu tươi (0,6 g) Dịch chiết nước acid Dịch chiết nước acid Nghiền với 4 ml isopropanol Lắc 15 phút, lọc bỏ bã Thổi khô bằng khí nitơ Thêm 1 ml acid acetic 0,01M Thêm 1 ml cyclohexan, votex Loại lớp cyclohexan ( lặp lại 2 lần) Thổi khô bằng khí Nitơ Thêm 0,2 ml acid acetic 0,01M 34 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô [19]. 3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lƣợng alkaloid bằng CE Dịch chiết alkaloid sau quá trình ly trích được sử dụng trong phân tích bằng CE với các thông số sau [11]: - Cột mao quản silica 72 cm với đường kính 50 µm. - Dung dịch đệm ammonium acetat 0,2 M, pH 6,2. - Điện thế sử dụng để phân tích mẫu là 10 Kv. - Thời gian bơm mẫu là 3 giây ở 25 mbar, 25 o C. Bột nguyên liệu (100 mg) Dịch chiết HCl Dịch chiết CHCl 3 Cắn alkaloid Dịch chiết alkaloid 1 ml chloroform + 80 µl NH 4 OH đậm đặc  pH = 9 Lắc trên máy lắc 30 phút (250 vòng/phút) Votex 3 lần Ly tâm 13.000 vòng, 10 phút ở 5 o C 2 ml methanol Bốc hơi tới khô Chiết bằng 1,5 ml HCl 0,1N Votex 30s Lắc trên máy lắc 30 phút (250 vòng/phút) Ly tâm 6000 vòng, 10 phút ở 5 o C 35 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát khả năng sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro theo thời gian trên môi trƣờng MS có bổ sung NAA Mẫu được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường MS có và không có bổ sung NAA (0,5 mg/l). Sau mỗi thời gian nuôi cấy, cây được đo chiều cao, chiều dài rễ và đếm số rễ. Kết quả được trình bày trong bảng 4.1, 4.2 và 4.3. Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Chiều cao cây trung bình (mm) 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 1 (Đ/C) 0 27,4 a 40,0 a 45,2 a 47,1 a 49,7 a 2 0,5 26,3 a 37,0 a 44,7 a 47,1 a 51,1 a P 0,36 0,09 0,72 0,98 0,40 CV (%) 16,1 16,9 11,9 14,2 12,7 * Đ/C: đối chứng, môi trường MS không có NAA * Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05) Kết quả phân tích thống kê cho thấy chiều cao trung bình của các nghiệm thức trên môi trường có và không có bổ sung NAA không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). Chiều cao trung bình của cây Trường xuân hoa sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy lần lượt là 26,9; 38,5; 44,9; 47,1; 50,4 mm (phụ lục 2). Như vậy khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy không ảnh hưởng lên chiều cao cây. . ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro Nghiệm. 9 cây in vitro. 28 Thí nghiệm 2a: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh. trong môi trường nuôi cấy (+) có NAA trong môi trường nuôi cấy Số nghiệm thức: 2 Tổng số mẫu: 270 mẫu Để đánh giá tác động của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro, tiến