28 3.3.1.2. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2 Sau khi chọn lọc được môi trường nhân giống cấp 1 tốt nhất chúng tôi tiến hành xác định môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất. Cách bố trí thí nghiệm được thực hiện như sau: Môi trường sử dụng là môi trường bán rắn gồm 5 loại môi trường A, B, C, D và E có bổ sung CaCO 3 2% để ổn định pH môi trường. Tất cả các loại môi trường trước khi đem nuôi cấy đều được hấp khử trùng ở 121 o C trong 15 - 20 phút. Các thành phần môi trường này được trình bày chi tiết ở mục 1.11 phần phụ lục. Lượng giống sử dụng ở môi trường nhân giống cấp 2 là 10%, với độ ẩm 60 – 65%, pH = 7. Từng loại môi trường được đặt trong các khay bằng nhựa có kích cỡ 0,5 × 0,25 × 0,08 m, mỗi khay chứa 0,6 kg môi trường. Trong quá trình nuôi phải giữ ẩm cho môi trường bằng cách phủ vải ẩm. Sau thời gian 72 giờ nuôi bắt đầu thu hoạch sau đó đem sản phẩm này kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme amylase, protease. Sau khi kiểm tra trên tất cả các môi trường A, B, C, D và E chúng tôi tìm được môi trường nhân giống cấp 2 cho sinh khối và hoạt độ enzyme cao nhất để tiến hành sản xuất. Mỗi môi trường thí nghiệm được lập lại 3 lần. Số lượng tế bào vi khuẩn Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Môi trường Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần3 A B C D E 29 3.3.1.3. Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Sau khi tìm được môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất chúng tôi tiến hành sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis. Cách thực hiện tương tự như thí nghiệm 3.3.1.2. Sau thời gian nuôi 72 giờ bắt đầu thu hoạch và đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45 o C trong 2 ngày sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sau đó đem đóng gói, kiểm tra và bảo quản. Quy trình sản xuất được thực hiện theo sơ đồ 3.2. Nước 60 – 65 % so với nguyên liệu Môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu Khoáng hỗn hợp Hấp khử trùng 121 0 C trong 20 - 25 phút Đổ lên khay Làm nguội đến 37 o C Nuôi 72 giờ ở nhiệt độ phòng Giống Bacillus subtilis 10% Sấy khô 40 - 45 o C Đánh tơi Xay mịn Đóng gói, kiểm tra và b ảo q uản Sơ đồ 3.2. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Chế phẩm chứa Bacillus subtilis 30 3.3.1.4. Kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme Chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau khi sấy khô tiến hành kiểm tra số lượng và hoạt độ enzyme amylase, protease và sau thời gian bảo quản 10, 20, 30 ngày ở nhiệt độ phòng. Phương pháp kiểm tra tương tự như thí nghiệm 3.3.1.1. 31 3.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus Phân l ập Chế phẩm Antibio ( chứa L. acido p hilus ) MRSA MRSB tăng sinh (24 giờ /37 o C) Môi trường sữa đặc có đường Môi trường sữa đậu nành 24 giờ, nhiệt độ phòng Kiểm tra Số lượng vi khuẩn có trong 1ml Độ chua Therne Chọn khuẩn lạc điển hình Kiểm tra sinh hóa Xác định Lactobacillus acidophilus Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Lactobacillus acidophilus Kiểm tra, đóng gói và b ảo q uản Sản xuất chế phẩm chứa L. acidophilus trên môi trườn g tối ưu Chọn ra môi trường t ối ưu 32 3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Mẫu phân lậpMẫu phân lập: sử dụng chế phẩm Antibio chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus do Hàn Quốc sản xuất. 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 Đồng nhất và pha loãng mẫu Quy trình phân lập: 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1 gam mẫu + 9ml dd NaCl 9 0 / 00 10 -2 10 -3 10 -1 Môi trường phân lập MRSA Chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa Môi trường giữ giống MRSA Cấy giữ giống Cách tiến hành Sơ đồ 3.4. Quy trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Cho 1 gam chế phẩm Antibio hòa vào 9 ml nước muối sinh lý (nồng độ 9 o / oo ) sau đó lắc đều sao cho dung dịch trở nên đồng nhất ta được dung dịch có nồng độ pha loãng 10 -1 . Tiếp theo lấy 1ml dung dịch 10 -1 cho vào 9 ml dung dịch NaCl 9 o / oo ta được dung dịch có nồng độ 10 -2 . Tiếp tục như thế cho đến khi được các dung dịch có nồng độ 10 -6 , 10 -7 . Dùng micropipet hút 0,2 ml dịch khuẩn ở nồng độ 10 -6 , 10 -7 (mỗi nồng độ cho vào 2 đĩa) trang đều trên mặt thạch chứa môi trường MRSA sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ và chọn khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc tròn đều, nhô lên và bên ngoài có 33 vòng trong) đem nhuộm Gram và cấy giữ giống. Những khuẩn lạc nghi ngờ này được tăng sinh trong môi trường MRSB trong 24 giờ ở nhiệt độ 37 o C để tiến hành thử các phản ứng sinh hóa. Xác định vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus xác định dựa trên các phương pháp truyền thống như: o Quan sát hình dạng tế bào khuẩn lạc và sự bắt màu khi nhuộm Gram. o Thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa. Phản ứng Kết quả Lên men đường Kết quả Indol VP MR Citrat Nitrat Di động Catalase Khả năng đông vón sữa Lactose Sucrose Glucose Manitol Rabinose 3.3.2.2. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa đặc có đường Giống L. acidophilus sau khi phân lập được tăng sinh trên môi trường MRSB trong thời gian 24 giờ ở 37 o C. Sau đó cho lượng giống 5 % vừa tăng sinh này vào môi trường sữa đặc có đường với từng nồng độ là:15%, 20% và 25% sữa. Sau thời gian nuôi 24 giờ với pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne của từng loại môi trường. Độ chua Therne (g) Số lượng tế bào vi khuẩn Nồng độ sữa (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 15 20 25 34 3.3.2.3. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa đậu nành Tương tự như ở thí nghiệm 3.3.2.2 sử dụng 5% giống cho vào môi trường sữa đậu nành với nồng độ đậu nành là 10%, 15% và 20%. Ứng với mỗi nồng độ đậu chúng tôi khảo sát từng nồng độ đường cho vào là 0%, 10%, 15% và 20%. Những nồng độ này được ký hiệu như sau: o Ở nồng độ 10% đậu có bổ sung từng hàm lượng đường là 0%,10%,15% và 20% được ký hiệu lần lượt là NA 0 , NA 10 , NA 15 , NA 20 . o Tương tự ở nồng độ 15% đậu có: NB 0 , NB 10 , NB 15 và NB 20 . o Ở nồng độ 20% đậu có: NC 0 , NC 10 , NC 15 và NC 20 . Sau thời gian nuôi cấy là 24 giờ, pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra độ chua Therne và số lượng tế bào vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.3.2.2. Độ chua Therne Số lượng tế bào vi khuẩn Nồng độ đậu nành Kí hiệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 NA 0 NA 10 NA 15 10% NA 20 NB 0 NB 10 NB 15 15% NB 20 NC 0 NC 10 NC 15 20% NC 20 3.3.2.4. Tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus Từ kết quả khảo sát độ chua và số lượng tế bào vi khuẩn ở hai loại môi trường sữa đặc có đường và sữa đậu nành chúng tôi chọn được môi trường tối ưu nhất để tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. Sau 24 giờ nuôi trên môi trường tối ưu ở nhiệt độ phòng với lượng giống cho vào là 5%. Chúng tôi bắt đầu thu hoạch và đem phối trộn với bột đậu nành khô đã qua khử 35 trùng (sấy 100 o C trong 2giờ). Tỷ lệ phối trộn là 1:1 sau đó đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45 o C trong 2 ngày sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sản phẩm này được xây mịn, đóng gói sau đó đem kiểm tra và bảo quản ở nhiệt độ phòng. 3.3.2.5. Kiểm tra sản phẩm sau thời gian bảo quản Sản phẩm sau khi sấy khô chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1 gam sản phẩm và sau thời gian bảo quản 10 và 20 ngày bằng phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch (được trình bày chi tiết ở mục 3.5 phần phụ lục). 3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 3.4.1. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab release 13.20 để so sánh sự khác biệt giữa các môi trường. Đối với thí nghiệm trên Bacillus subtilis Môi trường nhân giống cấp 1 và môi trường nhân giống cấp 2 chúng tôi dùng dùng trắc nghiệm 1 yếu tố để xem tác động của:  Môi trường lên số lượng tế bào vi khuẩn  Môi trường lên hoạt độ enzyme amylase  Môi trường lên hoạt độ enzyme protease Đối với thí nghiệm trên Lactobacillus acidophilus Môi trường sữa đặc có đường dùng trắc nghiệm một yếu tố để xem ảnh hưởng của nồng độ sữa lên số lượng và độ chua của L. acidophilus. Môi trường sữa đậu nành dùng trắc nghiệm hai yếu tố là nồng độ đậu nành và hàm lượng đường trong sữa đậu nành để:  So sánh sự khác biệt giữa từng nồng độ đậu và từng hàm lượng đường lên số lượng và độ chua Therne của sữa.  Ảnh hưởng của nồng độ đậu và hàm lượng đường lên số lượng và độ chua của sữa. 3.4.2. Biểu đồ Biểu đồ được vẽ bằng phần mềm Excel phiên bản 2003. 36 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. ĐỐI VỚI BACILLUS SUBTILIS 4.1.1. Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1 Sau khi nuôi cấy trên 5 loại môi trường Edward, Fragie, pepton-gelatin, Nomura và rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột trong thời gian 48 giờ ở nhiệt độ phòng, pH = 7 chúng tôi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu về số lượng, khả năng sinh enzyme amylase, protease với kết quả như sau. 4.1.1.1. Khả năng tăng sinh khối Bảng 4.1. Số lượng tế bào Bacillus subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 1 Ghi chú : Chữ a, b, c, d chỉ sự khác biệt về mặt thống kê giữa từng loại môi trường Qua bảng 4.1 chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào trung bình ở môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là cao nhất ở mức 1,92 ×10 10 cfu/ml. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa các loại môi trường là có ý nghĩa (P < 0,01). 4.1.1.2. Khả năng sinh enzyme amylase và protease Sau 48 giờ nuôi ở nhiệt phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth và enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fuld. Kết quả ghi nhận được môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột có khả năng cho hoạt độ enzyme amylase cao nhất là 256 W 0 /ml và protease là 128 Hđp/ml. Qua xử lý thống kê chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt giữa các môi trường là rất có ý nghĩa (P < 0,001). Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 4.2. Môi Trường Edward Fragie Nomura pepton- gelatin Rỉ đường + 2% tinh bột Lặp lại (n) X (×10 10 cfu/g) SD 3 C V % 3 1,5667 a 0,21455 13,69 3 1,3600 b 0,391 28,78 3 1,4267 b 0,411 28,83 3 0,4537 c 0,0773 17,05 1,9200 d 0,2455 12,78 37 Bảng 4.2. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân giống cấp1 Môi trường Enzyme Đối chứng (+) có enzyme: dung dịch không có màu xanh Đối chứng (-) không có enzyme: dung dịch có màu xanh Edward Fragie Nomura pepton- gelatin Rỉ đường + 2% tinh bột Amylase Lặp lại (n) X (W 0 /ml) SD Cv% 3 8 a 0 0 3 16 b 0 0 3 26,67 c 9,2376 34,63 3 10,67 a 4,6188 3 256 d 0 0 43,28 Protease Lặp lại (n) X (Hđp/ml) SD Cv% 3 8 a 0 0 3 13,33 b 4,6188 34,64 3 16 b 0 0 3 32 c 0 3 128 d 0 0 0 Hình 4.1. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Wolhegemuth 2 1 4 1 8 1 16 1 32 1 64 1 128 1 256 1 512 1 1024 1 . loại môi trường sữa đặc có đường và sữa đậu nành chúng tôi chọn được môi trường tối ưu nhất để tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. Sau 24 giờ nuôi trên môi trường tối. ra môi trường t ối ưu 32 3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Mẫu phân lậpMẫu phân lập: sử dụng chế phẩm Antibio chứa vi. cấp 2 tối ưu nhất. Cách bố trí thí nghiệm được thực hiện như sau: Môi trường sử dụng là môi trường bán rắn gồm 5 loại môi trường A, B, C, D và E có bổ sung CaCO 3 2% để ổn định pH môi trường.