BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP N N G G H H I I Ê Ê N N C C Ứ Ứ U U Đ Đ Á Á P P Ứ Ứ N N G G M M I I Ễ Ễ N N D D Ị Ị C C H H Đ Đ Ố Ố I I V V Ớ Ớ I I P P R R O O T T E E I I N N T T Á Á I I T T Ổ Ổ H H Ợ Ợ P P M M B B P P - - V V T T 2 2 e e B B T T R R Ê Ê N N T T H H Ỏ Ỏ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện : PHAN LÊ MAI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8-2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP N N G G H H I I Ê Ê N N C C Ứ Ứ U U Đ Đ Á Á P P Ứ Ứ N N G G M M I I Ễ Ễ N N D D Ị Ị C C H H Đ Đ Ố Ố I I V V Ớ Ớ I I P P R R O O T T E E I I N N T T Á Á I I T T Ổ Ổ H H Ợ Ợ P P M M B B P P - - V V T T 2 2 e e B B T T R R Ê Ê N N T T H H Ỏ Ỏ Giáo Viên Hướng Dẫn: Sinh Viên Thực Hiện: TSKH NGUYỂN NGỌC HẢI PHAN LÊ MAI PGS.TSKH NGUYỄN LÊ TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8-2005 iii LỜI CẢM ƠN Con luôn nhớ ơn ba mẹ sinh thành, dưỡng dục và tạo mọi điều kiện cho con tự hoàn thiện mình, cảm ơn sự quan tâm, động vịên của mọi người trong gia đình. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, người Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận. Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang, người Thầy, người bác đã dạy bảo con rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp con hoàn thành khoá luận. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thạc sỹ Nguyễn Kim Dung, người Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, chị Đỗ Thị Châm, chị Lạc Ngọc Thêm, chị Võ Thị Mỹ Duyên, chị Dương Ngọc Diễm, chị Doãn Thị Sim, Thầy Lưu Đức Lợi, anh Nguyễn Văn Thương đã tận tình giúp đỡ chỉ bảo em trong suốt thời gian thực tập khoá luận tốt nghiệp. Cảm ơn các bạn bè thân yêu của lớp DH01SH đã san sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT PHAN LÊ MAI, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP- VT2eB TRÊN THỎ”. Hội đồng hướng dẫn: TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang Độc tố verotoxin VT2eB do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta. Do vậy các nghiên cứu nhằm tạo ra vaccin phòng bệnh phù đầu trên heo đang nhận được sự quan tâm rất lớn, mở ra nhiều triển vọng cho ngành chăn nuôi heo nước ta. Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra được chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được protein này. Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ” nhằm xác định khả năng ứng dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù đầu do E. coli gây ra trên heo . Chúng tôi sử dụng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) để đánh giá sự xuất hiện của kháng thể và phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố verotoxin. Những kết quả đạt được sau 7 tháng nghiên cứu: - Cả hai quy trình gây miễn dịch dài ngày và ngắn ngày đều tạo kháng thể kháng MBP-VT2eB có hiệu quả. - Protein MBP-VT2eB có khả năng kích ứng đáp ứng miễn dịch trên thỏ tạo kháng thể trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero. - Kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có khả năng trung hoà độc tố VT2e (gây bệnh phù đầu trên heo). v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC HÌNH xi DANH MỤC CÁC BẢNG xii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ xiii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ xiv PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Mở đầu 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1 1.2.1. Mục tiêu 1 1.2.2. Yêu cầu 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Kháng nguyên 3 2.2. Kháng thể 3 2.2.1. Chuỗi nhẹ (L) 4 2.2.2. Chuỗi nặng (H) 4 2.3. Đáp ứng miễn dịch 5 2.3.1. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu 6 2.3.2. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo 6 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch 7 2.4. Cơ chế miễn dịch dịch thể 10 2.5. Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB 15 2.6. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) 15 2.6.1. Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể 15 2.6.2. Phản ứng kết tủa theo kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) 17 vi 2.7. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 18 2.7.1. Sơ lược về tế bào vero 18 2.7.2. Độc tố VT2e 19 2.7.3. Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero 20 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 21 3.1. Thời gian và địa điểm 21 3.2. Nội dung nghiên cứu 21 3.3. Vật liệu và hoá chất 21 3.3.1. Thú thí nghiệm 21 3.3.2. Vật liệu và hoá chất 21 3.3.3. Môi trường 22 3.3.4. Thiết bị và dụng cụ 22 3.4. Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1. Bố trí thí nghiệm 22 3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm 24 3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh 24 3.4.4. Xử lý kháng huyết thanh 24 3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S 24 3.4.4.2. Hòa tan kháng thể 25 3.5. Đánh giá 27 3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) 27 3.5.2. Định lượng: phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 28 3.5.2.1. Xác định liều TCID 50 (Tissue Culture Infectious Dose 50) 28 3.5.2.2. Thử phản ứng trung hoà độc tố 31 vii 3.6. Chỉ tiêu theo dõi 33 3.7. Đánh giá kết quả và xử lý số liệu 33 PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1. Xác định kháng thể đặc hiệu với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB bằng kỹ thuật Ouchterlony 34 4.1.1. Xác định quy trình thực hiện phản ứng 34 4.1.2. Đánh giá kết quả gây miễn dịch theo các quy trình ngắn ngày và dài ngày 35 4.1.2.1. Quy trình ngắn ngày 35 4.1.2.2. Quy trình dài ngày 36 4.1.3. Nhận xét 38 4.2. Xác định liều TCID 50 41 4.3. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 42 4.3.1. Kiểm tra độ an toàn của kháng huyết thanh đối với tế bào vero 42 4.3.1.1. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN 3 và tế bào vero 43 4.3.1.2. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN 3 và có bất hoạt 43 4.3.1.3. Thí nghiệm đánh giá tác động của NaN 3 44 4.3.1.4. Kháng huyết thanh không bổ sung NaN 3 và có bất hoạt 44 4.3.2. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 46 4.3.2.1. Quy trình dài ngày 47 4.3.2.2. Quy trình ngắn ngày 50 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 56 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ag ATCC DAG DMEM TCID 50 EDTA FBS Gb4 Ig IL2 IL4 IL5 IL6 IP 3 LB MAF MBP MHC class II antigens MIF MWCBs PCR Antigen American Type Culture Collection Diacylglycerol Dulbeccos Minimal Essential Medium Tissue culture infectious dose 50 Ethyllene diamine tetra acetic acid Fetal Bovine Serum Globotetraosyl ceramide Immunoglobulin Interleukin 2 Interleukin 4 Interleukin 5 Interleukin 6 Inositol triphosphate Lubria – Bertani Macrophage activating factor Maltose binding protein Major histocompatibility complex class II antigens Macrophage inhibitation factor Manufacturer's working cells bank Polymerase chain reaction Kháng nguyên Tổ chức sưu tầm nhân giống Mỹ Huyết thanh bào thai bê Globulin miễn dịch Yếu tố có tác dụng hoạt hoá đại thực bào Các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II Ngân hàng tế bào đang làm việc ix PBS SLT T C T DTH T I T H Vero VT VT2e (SLT-IIv) VT2eB Phosphate buffer stalin Shiga-like toxin Cytotoxic T cell Delayed type hypersensitivity T cell Inducer T cell Helper T cell Vervet Monkey Origin Verotoxin SLT-II variant VT2e subunit B Tế bào lympho T gây độc Tế bào lympho T gây quá mẫn muộn Tế bào lympho T cảm ứng Tế bào lympho T giúp Độc tố Shiga-like toxin IIv Tiểu đơn vị B của VT2e x DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1: Hình 2.2: Hình 2.3: Hình 2.4: Hình 2.5: Hình 2.6: Hình 2.7: Hình 2.8: Hình 3.1: Hình 3.2: Hình 4.1: Hình 4.2: Hình 4.3: Hình 4.4: Hình 4.5: Hình 4.6: Cấu trúc kháng thể 5 Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được phản ảnh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh 7 Quá trình biệt hoá và phân chia của tế bào lympho B 11 Các quá trình diễn ra khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể trên bề mặt tế bào lympho B 12 Sự kết hợp giữa tế bào lympho T H và tế bào lympho B 13 Tế bào lympho B xử lý và trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho T H 13 Tác động của các interleukin ở các giai đoạn khác nhau trong tiến trình đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B đối với kháng nguyên 14 Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B), đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch 18 Bao thẩm tích 26 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) 27 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 1) 34 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (mũi nhắc lại 1) 35 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (mũi nhắc lại 2) 36 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (đối chứng + kháng huyết thanh) 36 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (đối chứng + kháng huyết thanh) 36 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc . hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được protein này. Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ nhằm. 2. 4: Hình 2. 5: Hình 2. 6: Hình 2. 7: Hình 2. 8: Hình 3. 1: Hình 3. 2: Hình 4. 1: Hình 4. 2: Hình 4. 3: Hình 4. 4: Hình 4. 5: Hình 4. 6: Cấu trúc kháng thể 5 Đáp ứng miễn. 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch 7 2.4. Cơ chế miễn dịch dịch thể 10 2.5. Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB 15 2.6. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in