28  Khi chọn qui trình xử lý enzyme giới hạn không những căn cứ vào hiệu quả của việc cắt mà còn căn cứ vào hiệu quả kinh tế của việc sử dụng enzyme và hoá chất Xác định sự hiện diện của gen PRLR  Tiến hành phản ứng PCR với các mẫu DNA đã đƣợc ly trích  Tiến hành điện di sản phẩm PCR với nồng độ gel 1,5 %, 100 V, 250 mA, trong 30 phút. o Qui trình điện di đƣợc tiến hành nhƣ sau : Cân 0,6 g agarose LMP (low melting agarose) cho vào bình chứa 40 ml dung dich TBE 0,5X Tiến hành đun agarose trong bồn nhiệt (70 o C) cho đến khi tan hết. Để nguội ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhiệt độ gel bằng với nhiệt độ phòng là đƣợc Đặt lƣợt vào khay đổ gel, tiến hành đổ gel sao cho tránh bọt khí Để nguội khoảng 2 giờ đến khi gel cứng hoàn toàn, rút lƣợt ra Cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TBE 0,5X sao cho dung dịch này ngập miếng gel khoảng 1 – 1,5 cm Cho DNA vào giếng : Trộn 8 l với loading dye trên giấy nhôm hoặc giấy parafin dùng pipet bơm vào các giếng. Điều chỉnh các thông của bồn điện di : 100 V, 250 mA, trong 30 phút. Nhuộm gel với ethium bromide trong 30 phút Đọc kết quả điện di sản phẩm PCR  Thống kê kết quả phản ứng PCR thành công và kết luận tỉ lệ phần trăm xuất hiện của gen PLRL Xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen PRLR  Tiến hành phân cắt enzyme giới hạn AluI các mẫu có phản ứng PCR thành công.  Tiến hành điện di sản phẩm phân cắt với loại gel LMP có nồng độ cao (3,5%) để phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc nhỏ (60 bp đến 130 bp) , do gen PRLR sau 29 khi phân cắt tạo thành các đoạn có kích thƣớc dƣới 60 bp. Các thông số của quá trình điện di: 50 V, 48 mA, 60 phút. Để đo kích thƣớc của các đoạn DNA sau khi xử lý enzyme khi điện di chúng ta cho thêm ladder 25 bp vào một giếng, dùng ladder này để đo kích thƣớc của các đoạn DNA.  Đọc kết quả trên gel trên máy chụp gel (máy Gel doc) nối với máy vi tính sử dụng phần mềm Quantity one Gen thụ thể prolactin có 2 alen là A, B. Enzyme AluI cắt sản phẩm PCR thành các băng có kích thƣớc khác nhau : 124 bp, 110 bp, 90 bp, 79 bp, 76 bp nhƣng có sự xuất hiện của băng DNA 90 bp là alen A, 110 bp là alen B. 30 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Hiệu quả ly trích DNA từ mẫu máu và mẫu da tai 4.1.1 Mẫu máu Việc thu thập mẫu máu bị hạn chế do các yếu tố khách quan nhƣ: Các heo lấy mẫu là các heo nái đang mang thai Muốn lấy mẫu máu phải dùng các dụng cụ để khớp mỏ heo lại Thời tiết vào thời gian lấy mẫu rất nóng nực Đây là các yếu tố rất dễ gây stress dẫn đến sảy thai, đẻ non, các heo con sinh ra không đƣợc khỏe mạnh Do đó chỉ thu đƣợc 10 mẫu máu của 10 heo nái, còn lại là các mẫu da tai. Việc lấy mẫu da tai tƣơng đối đơn giản. Tai heo đƣợc bôi cồn sát trùng sau đó dùng kiềm bấm một mẫu da tai nên không gây ảnh hƣởng nhiều lên heo. Nồng độ và độ tinh sạch của mẫu DNA thu đƣợc từ các mẫu máu. Bảng 4.1: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu máu Mẫu Tỉ số OD 260 nm / 280 nm OD 260 nm OD 280 nm Nồng độ (ng / µl) 1 1,41 0,17 0,12 6,37 2 1,45 0,16 0,11 6,1 3 1,16 0,12 0,06 5,39 4 1,45 0,21 0,12 8,89 5 1,52 0,09 0,06 3,5 6 1,33 0,13 0,1 4,58 7 1,5 0,15 0,10 5,84 8 1,33 0,20 0,15 7,18 9 1,45 0,12 0,06 5,39 10 1,6 0,09 0,056 3,65 Trung bình ( X ) 1,42 0,14 0,09 5,51 Độ lệch chuẩn ± 0,12 ± 0,04 ± 0,03 ± 1,75 Tỉ số OD của các mẫu máu thu đƣợc tƣơng đối thấp, OD 260 nm / 280 nm trung bình là 1,42. Mẫu DNA ly trích đƣợc xem là sạch, không tạp nhiễm protein nằm trong khoảng 1,8 – 2 (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). Theo nghiên cứu của Lê Thị Thu Phƣơng (2003) thì độ tinh sạch của mẫu máu cao hơn mẫu da tai. Kết quả này ngƣợc với kết 31 quả do chúng tôi tiến hành. Điều này có thể lý giải do việc ly trích DNA từ máu rất phức tạp, để thu đƣợc mẫu máu tinh sạch cần tốn rất nhiều thời gian ly tâm với dung dịch TE 1X để tách các phân tử hemolobin từ máu, các tế bào máu có thể theo dung dịch tẩy rửa ra ngoài qua quá trình hút rửa. Nồng độ DNA ly trích cao hay thấp phụ thuộc vào việc pha loãng DNA mẫu bằng dung dịch đệm. Để có mẫu DNA có độ tinh sạch cao, nồng độ cao trong quá trình ly trích chúng ta cho vào một thể tích dung dịch đệm tƣơng đối ít. Ví dụ ta có mẫu DNA có tỉ số OD 260 nm / 280 nm = 1,85 muốn mẫu này có nồng độ DNA trong mẫu cao thay vì cho vào 200 µl dung dịch đệm TE 1X chúng ta chỉ cho vào từ 50 – 100 µl dung dịch TE 1X thì nồng độ DNA trong mẫu tăng lên đáng kể phù hợp với các yêu cầu nghiên cứu. 4.1.1 Mẫu da tai Độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA của các mẫu da tai tƣơng đối cao, tỉ số OD 260 nm / 280 nm đạt mức trung bình là 1,82, nồng độ DNA trung bình trên một mẫu là 8,98 ng / µl tƣơng đối phù hợp với yêu cầu thực hiện phản ứng PCR. Mẫu da tai sau khi giã nhuyễn đƣợc xử lý proteinase K không cần phải qua các thao tác tẩy rửa phức tạp, proteinase K phân cắt các phân tử protein có cấu trúc phức tạp thành các đoạn acid amin ngắn. Các đoạn acid amin này dể dàng bị loại bỏ qua quá trình rửa phenol / chloroform / isoamyl alcohol. Sau khi ly tâm thì toàn bộ DNA nhân của các mô liên kết đƣợc giữ lại ở phần nƣớc nổi bên trên, protein và cặn chìm xuống phía dƣới, lấy nƣớc nổi này và tiến hành thu DNA Đây chính là lý do mà mẫu da tai sau khi ly trích có độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA cao. 32 Bảng 4.2: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu da tai Mẫu Tỉ số OD 260 nm / 280 nm OD 260 nm OD 280 nm Nồng độ DNA (ng / µl) 1 1,83 0,11 0,06 4,76 2 1,89 0,15 0,07 6,92 3 1,73 0,92 0,53 38,79 4 1,8 0,64 0,35 27,66 5 1,71 0,12 0,07 5,03 6 1,75 0,21 0,12 8,89 7 1,85 0,17 0,09 7,45 8 1,83 0,25 0,14 10,69 9 1,94 0,21 0,11 9,25 10 1,86 0,26 0,14 11,31 11 1,85 0,15 0,08 6,56 12 1,84 0,08 0,04 3,59 13 1,88 0,12 0,06 5,39 14 1,95 0,22 0,11 9,88 15 1,7 0,16 0,09 6,82 16 1,75 0,21 0,12 8,89 17 1,90 0,12 0,068 5,1 18 1,8 0,09 0,05 3,86 19 1,96 0,10 0,06 4,13 20 1,73 0,15 0,08 6,56 21 1,84 0,16 0,09 6,82 22 1,85 0,16 0,09 6,82 23 1,83 0,08 0,044 3,45 24 1,90 0,37 0,19 16,43 25 1,78 0,10 0,056 4,27 26 1,84 0,17 0,092 7,38 27 1,7 0,09 0,052 3,79 28 1,85 0,16 0,086 6,97 29 1,71 0,13 0,076 5,44 30 1,85 0,07 0,037 3,07 Trung bình ( X ) 1,82 0,198 0,12 8,47 Độ lệch chuẩn ± 0,074 ±0,174 ±0,11 ±7,46 33 4.2 Kết quả việc thực hiện phản ứng PCR 4.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo các qui trình khác nhau 4.2.1.1 Qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp khác nhau Để tiến hành xác định nhiệt độ bắt cặp nào là tối hảo cho cặp primer đang tiến hành thí nghiệm chúng tôi tiến hành thực hiện 15 phản ứng trên mẫu da tai cho mỗi qui trình. Mẫu da tai đƣợc chọn do hàm lƣợng DNA cao, độ tinh sạch tƣơng đối chuẩn, phù hợp với yêu cầu của phản ứng PCR. Kết quả của hai qui trình phản ứng đƣợc trình bày ở (Bảng 4.3) Bảng 4.3: So sánh tỉ lệ thành công giữa hai qui trình nhiệt độ khác nhau Qui trình PCR Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%) 1 15 10 66,7 2 15 10 66,7 Với kết quả này thì hai qui trình nhiệt độ đều phát hiện tốt sự hiện diện của gen PRLR. Ở qui trình 1, nhiệt độ bắt cặp thấp hơn, các primer không hoàn toàn bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích, có một số lƣợng nhỏ primer bắt cặp không đặc hiệu, tạo thành các sản phẩm phụ chuỗi dài và ngắn hơn sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR sau khi chạy điện di xuất hiện những vệt dài sáng (giống nhƣ hiện tƣợng sao chổi) kèm theo đó là các băng phụ của các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ. Ở qui trình 2 nhiệt độ bắt cặp cao hơn 2 o C, các sản phẩm PCR thu đƣợc rất đặc hiệu, không xuất hiện vệt dài sáng nhƣ ở qui trình 1. Nhƣ vậy, qui trình của Vincent khi tiến hành tại điều kiện phòng thí nghiệm của chúng ta không phù hợp và phải điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp tăng lên khoảng 2 o C. 34 Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 1 với nồng độ gel 1,5 % 1, 3, 5, 7: Các giếng có hiện diện sản phẩm PCR, cả 4 giếng này đều xuất hiện các vệt sáng dài 2, 4, 6, 8: Các giếng không có sự hiện diện sản phẩm PCR Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % Giếng 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR thực hiện theo qui trình 2 1 2 3 4 5 6 7 8 Các vệt dài sáng Sản phẩm PCR 1’ 1 2’ 2 3’ 3 4’ 4 Sản phẩm PCR Các băng phụ kích thƣớc nhỏ (hiện tƣợng dimer – primer) 35 4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau Để tiến hành xác định nồng độ primer thích hợp nhất cho phản ứng PCR phát hiện gen thụ thể prolactin, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên mẫu da tai. Mỗi qui trình tiến hành 15 phản ứng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau (Bảng 4.4): Bảng 4.4: So sánh tỉ lệ thành công giữa ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau Qui trình PCR Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%) 1 15 0 0 2 15 9 60 3 15 9 60 Qua kết quả ở Bảng 4.4 thì qui trình 2, 3 phát hiện tốt sự hiện diện của gen PRLR. Qui trình 1 không phát hiện đƣợc sự hiện diện của gen PRLR. Sản phẩm PCR sau khi điện di và nhuộm gel thì không thấy xuất hiện các băng DNA. Ở qui trình 3 nồng độ primer cao, primer sau khi bắt cặp vào DNA khuôn còn thừa tạo ra các băng phụ kích thƣớc nhỏ (hiện tƣợng dimer – primer). Qui trình 2 cho kết quả hoàn toàn nhƣ mong muốn, các băng DNA xuất hiện rõ ràng, các băng DNA hiện diện rõ ràng. Sản phẩm PCR của qui trình này có thể dùng xử lý enzyme giới hạn. 36 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 1 với nồng độ gel LMP 1,5 % Các giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: Không có sự hiện diện sản phẩm PCR Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % Giếng 1’, 2’, 3’, 4’: sản phẩm PCR đƣợc thực hiện bởi cặp primer của Drogemuller đƣợc thực hiện bởi Bùi Thị Trà Mi lớp Chăn Nuôi – Thú Y 27 Giếng 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR thực hiện theo qui trình 2 1 2 3 4 5 6 7 8 1’ 1 2’ 2 3’ 3 4’ 4 Sản phẩm PCR theo qui trình 2 . hành xác định nồng độ primer thích hợp nhất cho phản ứng PCR phát hiện gen thụ thể prolactin, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên mẫu da tai. Mỗi qui trình tiến hành 15 phản ứng. . % Các giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: Không có sự hiện diện sản phẩm PCR Hình 4. 4: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % Giếng 1’, 2’, 3’, 4 : sản phẩm PCR. 34 Hình 4. 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 1 với nồng độ gel 1,5 % 1, 3, 5, 7: Các giếng có hiện diện sản phẩm PCR, cả 4 giếng này đều xuất hiện các vệt sáng dài 2, 4,