2 1.2 Mục đích - Phát hiện các loại virus (PVX, PVY, PLRV) trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA. - Phát hiện virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. - Giải trình tự đoạn gen có đƣợc sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR để xác định nguồn gốc của đoạn gen này. 1.3 Yêu cầu - Thực hiện phản ứng ELISA để kiểm tra các mẫu thu thập từ năm phƣờng trên địa bàn thành phố Đà Lạt. - Thực hiện phản ứng RT-PCR với mẫu có kết quả dƣơng tính với virus PLRV. - Lấy sản phẩm RT-PCR của virus PLRV đi giải trình tự và so sánh với ngân hàng gen. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về khoai tây và bệnh trên khoai tây Khoai tây vừa là lƣơng thực vừa là thực phẩm có giá trị. Ở nhiều nƣớc Âu, Mỹ, khoai tây đƣợc sử dụng nhƣ là một lƣơng thực chính sau lúa mì: 23 - 30% sản lƣợng khoai tây đƣợc dùng để ăn; còn ở những nƣớc khác nhƣ châu Á thì khoai tây đƣợc sử dụng nhƣ là một loại thực phẩm hoặc là lƣơng thực phụ. Khoai tây có nguồn gốc ở Nam Mỹ thuộc các nƣớc Chi Lê, Pêru, Braxin, Bôlivia, trên các miền núi có khí hậu mát và ẩm. Hiện nay, ở những nƣớc này vẫn còn tìm thấy những loài khoai tây hoang dại. Tuy nhiên khoai tây đƣợc trồng đầu tiên ở các nƣớc thuộc Châu Âu. Năm 1561, khoai tây đƣợc trồng sớm nhất tại Tây Ban Nha, giống lấy từ Pêru. Ở Việt Nam, khoai tây đƣợc trồng khoảng 100 năm nay (cùng với bắp cải, cà chua, cải bông). Những nơi trồng khoai tây sớm nhất là Thƣờng Tín (Hà Đông), Từ Sơn (Hà Bắc), Tú Sơn (Hải Phòng), ngoại thành Hà Nội với sản lƣợng chiếm 85% sản lƣợng khoai tây của Việt Nam. Ở Đà Lạt khoai tây đƣợc trồng quanh năm và chiếm 15% sản lƣợng. Vấn đề quan trọng cần lƣu ý trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại, đặc biệt là những bệnh do virus gây ra. Khoai tây có thể bị đơn nhiễm hoặc tạp nhiễm khoảng 30 loại virus, chủ yếu là Luteoviruses (PLRV), Potyviruses (PVY, PVA, PVV), Potexviruses (PVX) và Carlaviruses (PVM, PVS). Khoảng 50% số virus này sống kí sinh bắt buộc trên khoai tây, số còn lại thì có thể sống trên các loại cây khác. Các virus này có tính thích nghi cao và lây nhiễm dễ dàng thông qua củ bị nhiễm cũng nhƣ các yếu tố lan truyền khác. Virus và bệnh virus là một trong những nguyên nhân ức chế sự phát triển của khoai tây dẫn đến sự giảm sút về năng suất và chất lƣợng. Những bệnh do virus thƣờng khó phát hiện hơn các bệnh do vi khuẩn và nấm. Khi cây bị bệnh sẽ có các triệu chứng khác nhau nhƣ dạng khảm, đốm, xoắn lá, lá nhăn nheo và hoại tử. Bệnh thƣờng gây thiệt hại nặng khi bị nhiễm nhiều loại virus cùng lúc (ví dụ năng suất có thể giảm 80% khi nhiễm cùng lúc virus PVX và PLRV (Salaza, 1982) và chịu ảnh hƣởng của môi trƣờng canh tác. Một nghiên cứu tại Nigeria cho biết có khoảng 50% số mẫu nghiên cứu bị nhiễm cùng lúc PVX, PVY, PLRV và PVS. 4 Khi nhiễm nhiều virus thì bên cạnh việc các virus tác động tổng hợp còn ảnh hƣởng đến khả năng đề kháng với mầm bệnh khác. Ví dụ: Khi đã bị nhiễm PVX và PVY trƣớc đó thì tính kháng với PLRV giảm (Jayasinghe và ctv, 1989), tăng tính mẫn cảm với bệnh thối (Karla và ctv, 1989). Các kết quả nghiên cứu cho thấy có khoảng trên 20 loài rệp và côn trùng có thể là vectơ truyền bệnh virus trên khoai tây, trong đó chủ yếu là loại rệp Myzus persicae (Watson, 1956). 2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây 2.2.1 Sơ lƣợc về virus PVX (Potato virus X) - Virus PVX thuộc họ Flexiviridae, giống Potexvirus, là loại virus không có vỏ bọc, có cấu trúc xoắn đối xứng, sợi virus ngoằn ngoèo, dài 515 nm, đƣờng kính 13 nm (Brandes, 1964). Virus này có acid nucleic là một phân tử RNA ( + ssRNA: +single strand RNA) trọng lƣợng phân tử là 2,1*10 6 , chiếm 6% trọng lƣợng virus (Huisman và ctv, 1988), chứa khoảng 6435 base, có đuôi 3’ là poly A (Huisman và ctv, 1988), phần trăm về số mole tƣơng ứng giữa các nucleotide G, A, C và U là 22%, 32%, 24% và 22% (Knight, 1963). - PVX có vỏ protein có trọng lƣợng 30.000 dalton, chiếm gần 94% trọng lƣợng virus (Shaw và Larson, 1962). Trọng lƣợng phân tử của virus là 35*10 6 Da (Reichmann, 1959), thể tích của hạt virus là 0,73 cm 3 /g, hệ số lắng 117,7 S, điểm đẳng điện PI = 4,4, thời gian sống: 40 - 60 ngày, nhiệt độ bất hoạt trong khoảng 68 - 76 o C tùy từng dòng virus. PVX duy trì hoạt lực ở 20 o C trong vài tuần và trong glycerol hơn một năm, bị tiêu diệt khi xử lý bằng protease, phenol hay thuốc tẩy, hiệu giá virus: 10 -5 - 10 -6 . - Với những đặc điểm trên, virus PVX có ký chủ giới hạn trong những cây thuộc họ cà (Solanaceae) và một số loại cây có quan hệ thân thuộc nhƣ Amaranthaceae và Chenopodiaceae. - Khi bị nhiễm virus PVX thì thƣờng biểu hiện triệu chứng nhẹ, ngầm, không thấy biểu hiện trên lá hoặc không tác động rõ ràng trên cây khỏe, tạo ra những đƣờng vằn hoặc là vết hoại tử nhăn nheo ở giữa các gân lá, có thể làm thiệt hại năng suất từ 10 – 20% tùy theo giống và phƣơng thức lây nhiễm (chỉ nhiễm PVX hoặc tạp nhiễm các loại virus khác). Bệnh chủ yếu lây nhiễm qua tiếp xúc với cây bệnh hoặc qua củ giống chứ không do rệp. Đây là điểm khác biệt giữa virus PVX với PVY và PLRV. 5 - Các biện pháp phòng trừ nhƣ dùng củ giống sạch bệnh, đốt cây bị nhiễm, giới hạn di chuyển trong phạm vi ruộng bị nhiễm thƣờng đƣợc sử dụng để hạn chế sự lây nhiễm của virus PVX. 2.2.2 Sơ lƣợc về virus PVY (Potato virus Y) - Virus PVY thuộc họ Potyviridae, giống Potyvirus, gồm có ba dòng chính là PVY O (phổ biến nhất), PVY N (gây hoại tử gân lá thuốc lá) và PVY C (gồm cả potato virus C, gây vết sần sùi trên lá), là nhóm virus hại thực vật lớn nhất, dạng sợi, xoắn ngoằn ngoèo, không có vỏ bọc, dài 730 nm, rộng 11 nm, đƣờng kính 3,3 nm (Varma và ctv. 1968). - Cấu trúc acid nucleic của virus PVY là sợi đơn RNA ( + ssRNA : + single strand RNA) có trọng lƣợng phân tử là 3,1*10 6 chiếm 5,4 - 6,4% trọng lƣợng virus (Stace- Smith và Tremaine, 1970), có đuôi 3’ là poly A, đầu 5’ có một VPg (protein liên kết với genome). Kích thƣớc genome là 10,4 kb (Makkouk và Gumpf, 1974). - Vỏ protein của virus PVY có trọng lƣợng 34.000 dalton chiếm 93,6 - 94% trọng lƣợng virus, hệ số lắng của virus là 145 S (Huttinga, 1975), nhiệt độ bất hoạt: 50 - 62 o C, thời gian tồn tại trong ống nghiệm là 7 - 50 ngày ở nhiệt độ 18 - 22 o C, hiệu giá virus từ 10 -2 - 10 -6 . - Với các đặc điểm trên PVY có thể gây nhiễm khoảng 120 loài. Trong đó có thuốc lá, cà độc dƣợc (Datura stramonium) và Tinantia erecta với các triệu chứng từ nhẹ đến hoại tử lá nặng. Thông thƣờng PVY O , PVY C gây bệnh nặng hơn PVY N - Dòng PVY N phân bố chủ yếu ở Châu Âu, Châu Phi, và Nam Mỹ. gây ra các triệu chứng chủ yếu nhƣ hoại tử dạng điểm hay lan rộng ở mức độ nhẹ có thể không phát hiện đƣợc, thƣờng xuất hiện ở giai đoạn muộn của giai đoạn phát triển (ở vụ đầu). Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX Hình 2.1 Hình thái của virus PVX 6 Những triệu chứng thứ cấp có thể xuất hiện ở vụ sau khi đó triệu chứng chấm lốm đốm có thể quan sát đƣợc và thƣờng xuất hiện sớm trong mùa. - Dòng PVY O phân bố rộng khắp trên thế giới. Tùy từng loại khoai tây có thể gây ra hoại tử, chấm lốm đốm hoặc làm vàng lá non, rụng lá và chết trƣớc khi trƣởng thành. Khởi đầu, hoại tử là điểm hoặc lan tỏa trên lá non, có thể làm cong lá hoặc rụng lá. Triệu chứng thứ phát là cây lùn, giòn, lá nhăn nheo, nhàu nát. Đôi khi hoại tử xuất hiện ở tán lá hoặc đỉnh.Virus PVY O kết hợp với PVX gây ra hiện tƣợng khảm và nhăn. - Dòng PVY C gây triệu chứng sơ cấp nhƣ hoại tử, lốm đốm, nhăn nheo (hoại tử thƣờng ở cuống lá, lá, đỉnh), biểu hiện thứ cấp thƣờng xuất hiện vệt chấm, nhăn nheo hoặc lốm đốm. Hoại tử có thể xảy ra ở củ. - Để hạn chế sự thiệt hại do virus PVY gây ra, ngƣời ta đƣa ra các biện pháp quản lý nhƣ sử dụng giống sạch bệnh, sử dụng giống kháng, trồng sớm và loại bỏ cây bệnh. 2.2.3 Sơ lƣợc về virus PLRV (Potato leafroll virus) - Virus PLRV thuộc họ Luteoviridae, giống luteovirus, có dạng cầu, đƣờng kính 24 nm, phân tử protein vỏ có trọng lƣợng 26 kDa (Smith và Harris, 1990). PLRV là virus RNA có mang một sợi RNA dƣơng (+) (+ssRNA: + single strand RNA), trọng lƣợng 6 kDa (Rowhani và Stace Smith, 1979), có mang 1 VPg (protein liên kết với genome), không có đuôi poly A và chứa sáu khung đọc mở (ORF – Open Reading Frame) (Van Der Wilk và ctv, 1997). Những khung đọc nằm ở đầu 5’ thì mã hóa cho các protein trực tiếp từ RNA genome (Matthews, 1991). Protein VPg và một protein 70 kDa (Van Der Wilk và ctv, 1997) đƣợc mã hóa bởi khung đọc đầu tiên (ORF1) (Gorbalenya và ctv, 1989). Khung đọc thứ hai (ORF0) mã hóa cho một protein 28 kDa chƣa rõ chức năng nhƣng khung đọc thứ ba (ORF1/2) đƣợc cho là mã hóa cho protein 108 kDa liên quan đến sự sao chép của virus (Koonin, 1991; Mayo và Ziegler – Graff, Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY Hình 2.3 Hình thái virus PVY 7 1996). Ba trong số sáu khung đọc này nằm ở đuôi 3’ và mã hóa cho phân tử protein vỏ (CP: coat protein) 23 kDa (ORF3), protein di chuyển 17 kDa (MP (P4) - Movement protein) (ORF4 nằm trong gen mã hóa protein vỏ nhƣng có khung đọc khác) (Sokolova và ctv, 1997) và một protein 56 kDa liên quan đến sự tƣơng tác giữa virus và vectơ rệp (ORF5) (Chay và ctv, 1996). Còn hai khung đọc khác ở đuôi 3’ là ORF6 và ORF7 đã đƣợc phát hiện nhƣng chƣa hiểu đƣợc chức năng của chúng (Ashoub và ctv, 1998). - Virus PLRV bị bất hoạt ở 70 o C trong 10 phút, hiệu giá virus: 10 -4 , thời gian tồn tại trong nhựa cây khoảng 4 ngày ở 2 o C và trong dịch trích từ rệp là 12 đến 24 giờ ở 25 o C (Murayama), là loại virus chỉ giới hạn ở mô libe của cây (Peter và ctv, 1981; Bagnall, 1988; Lobenstein và ctv, 1997; Singh và Sing, 1997). Virus PLRV có phổ ký chủ hẹp, không lây nhiễm qua nhựa cây nhƣng có thể lây nhiễm thông qua khoảng 10 loài rệp nhờ phƣơng thức liên kết bền vững giữa virus và rệp, tồn tại trong nhựa cây khoảng 4 ngày ở 2 o C, trong rệp 12 - 24 giờ ở 25 o C. - Virus PLRV là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất của khoai tây, có ở hầu hết các nƣớc trên thế giới làm giảm năng suất tới 90%. Những biểu hiện triệu chứng sơ cấp gây nên bởi sự lây nhiễm ở vụ đầu trên lá nhƣ lá bị cuốn lại ở đỉnh lá đặc biệt những lá ở gốc có xu hƣớng ở thế thẳng đứng và chuyển màu vàng nhạt, với các giống khác lá có màu hồng, đỏ hoặc tía. Sự lây nhiễm muộn có thể không rõ triệu chứng, những giống có độ nhạy cao củ bị thối ở hệ thống mạch. Triệu chứng thứ cấp ở cây trồng từ củ bị nhiễm bệnh làm lá gốc cuốn tròn, thẳng đứng, cây không phát triển và lá cuốn tròn trở nên cứng. Ngoài ra các biểu hiện nhƣ xoắn lá, còi cọc, hoại tử mạch libe và ảnh hƣởng đến sự tích lũy carbonhydrate trong lá cũng hiện diện trên khoai tây bị nhiễm virus PLRV. Virus PLRV có thể ảnh hƣởng đến chất lƣợng thực phẩm (khẩu vị), đây là một trƣờng hợp ngoại lệ vì rất ít virus ảnh hƣởng đến chất lƣợng thức ăn. - Để hạn chế những thiệt hại do nhiễm virus PLRV cần chọn cây khỏe, giống không bị nhiễm virus PLRV, nhổ bỏ cây nhiễm bệnh, phun thuốc trừ rệp, dùng giống kháng với virus PLRV. Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh cuốn lá Hình 2.5 Hình thái virus PLRV 8 2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây Với đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn và đòi hỏi những dụng cụ máy móc hiện đại mới thực hiện đƣợc. Những phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus hiện nay thƣờng dùng là: 2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bên ngoài * Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh Phƣơng pháp này đơn giản và nhanh chóng nhƣng không phải lúc nào cũng chính xác, vì vết bệnh dễ biến đổi, nhiều khi cây bị bệnh mà vết bệnh không phát ra ngoài, hoặc thời kỳ tiềm phục của bệnh quá dài nên khó phát hiện ngay đƣợc. Một số trƣờng hợp vết bệnh không rõ ràng. *Ngoài ra cũng có thể xem tế bào bị bệnh dƣới kính hiển vi để chẩn đoán một số bệnh virus nhƣ hoa lá thuốc lá có thể nhìn dƣới kính hiển vi thấy trong tế bào lông tơ lá có những tinh thể virus kết tinh hình lục giác. 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học * Gieo hạt để chờ khi cây mọc có phát bệnh hay không. Phƣơng pháp này thƣờng dùng trong kiểm dịch thực vật và để kiểm tra bệnh ở hạt giống. Là một phƣơng pháp tuy đơn giản, dễ làm nhƣng mất thời gian. * Dùng cây chỉ thị và lây bệnh nhân tạo Những cây chỉ thị là những cây cùng loại hay khác loại với cây ký chủ nhƣng rất nhạy cảm đối với bệnh virus và khi lây bệnh nhân tạo virus, trên cây chỉ thị tạo ra vết bệnh điển hình nhất. Có thể lây bệnh nhân tạo bằng dịch cây muốn chẩn đoán lên cây chỉ thị, hoặc ghép cành, ghép mắt cây chỉ thị lên cây bệnh. Để chẩn đoán bệnh virus X và virus Y hại khoai tây ngƣời ta dùng cây chỉ thị Nicotiana glutinosa, Nicotiana tabacum, Datura tatula, Gomphrena globosa hoặc dùng cà độc dƣợc (Datura stramomium) làm cây chỉ thị để chẩn đoán bệnh virus hoa lá thuốc lá. 2.3.3 Phƣơng pháp quang phổ Chủ yếu dựa vào đặc điểm của virus có khả năng hấp thụ tia cực tím do virus có chứa acid nucleic. 2.3.4 Phƣơng pháp so sánh độ đục của dịch cây So sánh độ đục của dịch cây bằng máy đo độ đục, hoặc so sánh độ nhớt của dịch cây bằng bình đo độ nhớt. Phƣơng pháp này chỉ chẩn đoán bệnh virus nói chung, và chẩn đoán tƣơng đối đúng khi nồng độ virus trong dịch cây khá cao. 9 2.3.5 Phƣơng pháp chiết quang kép Dùng kính hiển vi phân quang khảo sát dịch cây đang chảy. Phƣơng pháp này chỉ dùng đối với các virus có hình gậy, còn virus hình cầu không dùng đƣợc. 2.3.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử Trong nghiên cứu virus, kính hiển vi điện tử tia xuyên đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ rất tích cực để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng nhƣ mô thực vật bị nhiễm bệnh. Ngƣời ta dùng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 2 - 3 chục ngàn lần trở lên. Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay thông qua làm tinh khiết và cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất. Có thể dùng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta xác định đƣợc hai virus khác nhau trong một mẫu. Ngƣời ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu đƣợc cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh. 2.3.7 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Đây là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ rất thấp (0,1 ng / ml). So với với các kỹ thuật miễn dịch khác thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác. ELISA đƣợc dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Hai kỹ thuật ELISA đƣợc dùng nhiều là kỹ thuật ELISA trực tiếp (direct Double Antibody Sandwich - ELISA) và ELISA gián tiếp (Indirect ELISA). Các enzyme thƣờng dùng là β-galactosidaze, glucosidaze, peroxidaze và phosphataze kiềm (Vũ Triệu Mân, 2003). 10 2.3.7.1 Phƣơng pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich Gồm các bƣớc sau Bƣớc 1: Cố định kháng thể đặc hiệu của virus vào đĩa ELISA. Bƣớc 2: Cố định dịch cây (có chứa virus cần xác định) vào đĩa ELISA. Bƣớc 3: Cố định kháng thể có gắn enzyme. Bƣớc 4: Cho cơ chất nền là cơ chất của enzyme vào đĩa ELISA Kết quả đƣợc đọc trên máy đọc ELISA (ELISA reader) ở bƣớc sóng 405 nm. Để cố định màu sắc của đĩa ELISA, bảo quản trong tủ lạnh 4 o C và cần xem vào khi khác có thể dùng dung dịch NaOH 3M nhỏ vào mỗi giếng 25 – 30 µl. 2.3.7.2 Phƣơng pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Kỹ thuật này thƣờng đƣợc dùng để định tính và định lƣợng kháng thể hiện diện trong mẫu cần xác định. Gồm các bƣớc: Bƣớc 1: Cố định kháng nguyên lên thành giếng. Bƣớc 2: Cho tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể cần kiểm tra) vào. Bƣớc 3: Thêm cộng hợp kháng kháng thể có gắn enzyme vào. Bƣớc 4: Thêm cơ chất của enzyme vào để đọc kết quả (Vũ Triệu Mân, 2003). 2.3.8 Phƣơng pháp RT-PCR (reverse transcriptase - polymerase chain reaction) RT-PCR là một ứng dụng của PCR (Polymerase Chain Reaction) dùng để khuếch đại các phân tử RNA. Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên ngƣời ta sử dụng kỹ thuật phối hợp RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR). Trƣớc hết RNA đƣợc chuyển thành cDNA (Complement Deoxyribonucleotic Acid) nhờ enzyme phiên mã ngƣợc từ Mo-MLV (murine leukemia virus) hoặc AMV (avian myeloblastosis virus). Primer sử dụng trong giai đoạn này có thể là primer ngƣợc của PCR giai đoạn sau (Antisense primer), có thể là Oligonucleotic dT (để bắt cặp với đuôi poly A của các phân tử RNA), mà cũng có thể là các hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA. Sau đó cDNA đƣợc khuếch đại nhờ Taq polymerase. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng Tth DNA polymerase cho cả hai giai đoạn. Kỹ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng thấp, RNA của virus, không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp khác nhƣ Northern blot. Một kỹ thuật mới phát triển - kỹ thuật in situ RT-PCR cho phép khuếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào. Kỹ thuật này có nguyên tắc nhƣ trên, đƣợc tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame. 11 2.3.9 Phƣơng pháp giải trình tự gen Phƣơng pháp RT-PCR chỉ cho biết kích thƣớc của đoạn gene ta có đƣợc, cho phép xác định đoạn gene đó có tồn tại trong virus hay không nhƣng chƣa thể kết luận về bản chất của nó, cụ thể là đoạn gen đó tƣơng ứng với gene gì, có chức năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào, cá thể mang gene này có phải là biến thể mới không . Thông tin này chỉ có thể rút ra từ việc xác định trình tự nucleotide của gen đó. Hai phƣơng pháp chính trong xác định trình tự là phƣơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phƣơng pháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). - Nguyên tắc của phƣơng pháp hóa học dựa vào các phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thƣớc khác nhau. - Nguyên tắc enzyme học của Sanger dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thƣờng, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau. Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR . 2 1 .2 Mục đích - Phát hiện các loại virus (PVX, PVY, PLRV) trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA. - Phát hiện virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. - Giải trình tự đoạn. (Watson, 1956). 2. 2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây 2. 2.1 Sơ lƣợc về virus PVX (Potato virus X) - Virus PVX thuộc họ Flexiviridae, giống Potexvirus, là loại virus không. cùng lúc virus PVX và PLRV (Salaza, 19 82) và chịu ảnh hƣởng của môi trƣờng canh tác. Một nghiên cứu tại Nigeria cho biết có khoảng 50% số mẫu nghiên cứu bị nhiễm cùng lúc PVX, PVY, PLRV và PVS.