19 - Giấy thấm vô trùng - Buồng lắc định ôn. Phục hồi và nhân sinh khối nấm R. solani Các dòng nấm được giữ trong môi trường ống nghiệm lâu ngày có thể bị nhiễm hoặc mọc yếu. Cho nên trước khi sử dụng, chúng tôi cấy chuyền nấm ra môi trường thạch đĩa để phục hồi và loại bỏ nhiễm. - Phục hồi: môi trường PGA (Potato-glucose-agar). Thành phần để nấu một lít môi trường PGA. + Khoai tây: 200 g + Glucose: 20 g + Agar: 18-20 g + Nước cất: 1lít Môi trường được hấp khử trùng bằng Autoclave ở 121 o C, 20 phút. Sau đó được đổ vào đĩa peitri sạch, khoảng từ 15 – 20 ml mỗi đĩa. Nấm từ các ống giống được cấy trên môi trường thạch đĩa và ủ ở nhiệt độ 25 o C trong vòng 1 – 2 ngày. - Nhân sinh khối: môi trường PGB (potato-glucose broth). + Môi trường PGB sau khi nấu được lọc qua giấy thấm hoặc bông gòn. + Cho vào mỗi bình tam giác 50 ml môi trường và hấp khử trùng bằng Autoclave ở 121 o C trong 20 phút. + Nấm đã phục hồi trên môi trường PGA được cho vào các bình tam giác chứa môi trường lỏng và nuôi lắc 4 ngày ở điều kiện từ 27 – 28 o C, và 120 – 150 vòng/phút. + Sợi nấm sau khi nuôi lắc được rửa lại nhiều lần với nước cất hai lần, lọc thu sợi nấm qua vải lọc hoặc giấy thấm và làm khô, giữ ở - 80 o C. 3.4.2. Ly trích DNA tổng số (isolation of DNA) của nấm R. solani Quy trình ly trích DNA tổng số: dựa trên quy trình được đề xuất bởi Lee và Taylor (1990), có sự thay đổi. Các hóa chất đƣợc sử dụng để ly trích DNA - Nitơ lỏng - Lysis buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 50 mM EDTA, 3% SDS, 1% β- mercaptoethanol. 20 - Hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) - Hỗn hợp chloroform:izoamyl alcohol (24:1) - Natri acetate 3 M, pH 8.0 - Isopropanol 100% - Ethanol 70% - TE 1X: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng để ly trích DNA - Khay đựng nitơ - Cối và chày đá - Epffendorf 1,5 ml - Micropipette các loại - Đầu tip các loại - Bồn ủ nhiệt (water bath) - Máy vortex - Máy ly tâm lạnh - Giấy thấm - Tủ 4 o C và - 20 o C Quy trình ly trích DNA tổng số - Nghiền 0,1 – 0,3 g sợi nấm đã được làm khô kiệt trong nitơ lỏng. - Thêm 600 µl lysis buffer và vortex cho tới khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer (cho tới 700 µl). - Ủ 1h ở 65 o C. - Thêm một thể tích tương ứng (600 µl) hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1), và lắc nhẹ. - Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. - Chuyển dịch nổi (khoảng 400 µl) vào một ống eppendorf mới. - Thêm 400 µl hỗn hợp chloroform, izoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ. Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (25 – 28 o C). - Hút lấy dịch nổi (khoảng 200 µl) vào một epffendorf mới. - Kết tủa DNA bằng cách thêm 0,03 thể tích natri acetate 3M (6 µl) và 0,5 thể tích isopropanol (100 µl). Trộn nhẹ nhàng nhưng cẩn thận. - Ly tâm 5 phút (14000 vòng/phút ở 4 o C) 21 - Loại bỏ dịch nổi, rửa phần kết tủa 3 lần với ethanol 70% lạnh. - Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với một thể tích TE 1X (từ 50-100 µl) và trữ ở 4 o C hoặc -20 o C cho đến khi sử dụng. - Kiểm tra sự có mặt và độ tinh sạch của DNA bằng cách điện di trên gel agarose. Đo hàm lượng DNA bằng máy đo quang phổ OD. 3.4.3. Khuếch đại vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani Các hóa chất đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng PCR - Dung dịch đệm PCR 10X (amplification buffer): 200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl) (Bio-rad) - MgCl 2 50 mM (Bio-rad) - dNTP 10 mM (gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Promega) - Taq DNA polymerase 5 UI/µl (Bio-rad) - Primer: ITS4 và ITS5 Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng thực hiện phản ứng PCR - Hộp đá khô -20 o C - Eppendorf 0,2 ml - Micropipette 10 µl, 100 µl và các loại đầu tip tương ứng - Máy luân nhiệt - Tủ thao tác vô trùng Quy trình thực hiện phản ứng PCR - Sử dụng hai primer ITS 4 và ITS 5 (White và ctv, 1990) để khuếch vùng rDNA-ITS của nấm R. solani có kích thước khoảng 700 bp. - Trình tự hai primer như sau: ITS4: 5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’ ITS5: 5’ GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G 3’ Bảng 3.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (30 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ bắt cặp Kéo dài 94 o C 94 o C 56 o C 72 o C 3 phút 1 phút 30 giây 1 phút 22 Giai đoạn kết thúc 72 o C 7 phút Bảng 3.2. Hỗn hợp để thực hiện phản ứng PCR Thành phần Nồng độ cuối cùng Dung dịch đệm PCR MgCl 2 dNTPs Primer ITS4 Primer ITS5 Taq DNA polymerase DNA khuôn mẫu Nước cất vô trùng 1X 1,5 mM 160 µM mỗi dNTP 2 pmol/µl 2 pmol/µl 0,04 UI <100 ng vừa đủ thể tích yêu cầu 3.4.4. Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose Các hóa chất đƣợc sử dụng để điện di và đọc kết quả - Agarose - TAE 0,5X - Loading dye 6X - Ethidium bromide Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng để điện di và đọc kết quả - Cân kĩ thuật 4 số - Lò viba - Khay đổ gel - Bồn và máy điện di (Bio-rad) - Giấy parafin - Máy chụp hình gel (Gel doc). - Ống đong Quy trình thực hiện - Cho 0,1875 g agarose vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X (nồng độ 1,5%). - Đun sôi hỗn hợp trên khoảng hai phút trong lò viba. - Để nguội ở nhiệt độ phòng còn khoảng 50 o C. - Đổ gel vào khay (đặt lược tạo giếng trước khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí khi đổ gel. 23 - Để gel đông đặc lại ở nhiệt độ phòng, rút lược ra khỏi gel, cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TAE 0,5X. - Trộn 2-3 µl sản phẩm PCR với 1µl loading dye và cho vào giếng của gel. - Vận hành máy điện di ở 50V trong khoảng 50 – 60 phút. Đọc kết quả điện di Sau khi điện di, gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide từ 5 - 15 phút. Vớt ra, rửa lại nhiều lần với nước và đọc kết quả dưới tia UV. DNA liên kết với ethidium bromide sẽ phát sáng dưới tia UV. Chụp ảnh kết quả điện di bằng máy Gel doc thông qua phần mềm Quantity one. 3.4.5. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani Sản phẩm PCR được cắt bởi ba enzyme giới hạn Alu I, Hae III, và Taq I để phát hiện hiện tượng đa hình trong phạm vi vùng ITS của rDNA đã được khuếch đại của 9 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61-02, CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63- 01, XL-4, L-73, và ĐHL-63). Phản ứng cắt được thực hiện như sau: - Ủ khoảng 1 g DNA đã được khuếch đại với 1U enzyme cắt dưới những điều kiện nhà sản xuất (Roche) hướng dẫn. Thành phần của phản ứng xem bảng 3.3. - Những đoạn DNA đã cắt được phân tách bằng điện di trên gel agarose 2%, sau đó gel được nhuộm ethidium brommide. Đọc kết quả và chụp hình dưới tia UV. Bảng 3.3. Thành phần phản ứng enzyme cắt Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Thể tích SuRE/cut Buffer DNA Restriction enzyme Nước cất vô trùng 10X 100 – 150 ng 10 UI 2,5 l 6 – 10 l 0,1 l Vừa đủ thể tích 25 l 24 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani Tách chiết DNA là bước quan trọng đầu tiên để cho phép phản ứng PCR có thành công hay không. Việc tách chiết phải đảm bảo thu nhận được lượng DNA có trong mẫu. Mặt khác, DNA thu được cũng phải có độ tinh sạch nhất định. Theo quy trình ly trích như phương pháp đã nêu ở mục 3.3.2, chúng tôi đã ly trích được DNA tổng số của các dòng nấm Rhizoctonia solani. DNA đã được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose (Hình 4.1). Do không xử lý RNAse nên vẫn còn lẫn RNA nhưng DNA thu được tương đối sạch để thực hiện phản ứng PCR. Hình 4.1. Ảnh điện di DNA tổng số của một số dòng nấm R. solani chƣa xử lý RNase. 1. ĐHL-63; 2. BV-61-01; 3. CP-50-02; 4. BN-61-01 5. ĐT-77; 6. BV-50-01; 7. BV-61-05; 8. BĐ-TL 9. CLV-72-02; 10. CX-8-02; 11. TL-72; 12. CTĐ-77 Nguyễn Thị Huệ (2003), áp dụng quy trình ly trích DNA của Raeder và Broda (1985), đã thu được DNA tổng số của nấm R. solani. Nhưng quy trình cần 1 giờ để ly tâm loại bỏ cặn nấm và sử dụng RNase để xử lý RNA. Như vậy quy trình ly trích chúng tôi đã thực hiện là đơn giản, ít tốn kém, và tiết kiệm thời gian hơn so với phương pháp của Nguyễn Thị Huệ (2003) đã sử dụng. DNA tổng số Phần tạp 25 Hồ Viết Thế (2005), khi sử dụng phương pháp ly trích DNA của Lee và Taylor cũng thu được DNA tổng số của nấm R. solani. Chúng tôi cũng sử dụng quy trình này nhưng đã thêm bước ly trích với hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol sau khi ly trích với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Kết quả, quy trình ly trích có cải tiến của chúng tôi đã thu được DNA tổng số tinh sạch hơn phương pháp của Hồ Viết Thế (2005) đã thực hiện. 4.2. Khuếch đại vùng rDNA-ITS thông qua phản ứng PCR 4.2.1. Lƣợng DNA khuôn Lượng DNA khuôn mẫu (DNA template) dùng trong phản ứng PCR khoảng từ 10 – 100 ng. Nếu lượng DNA khuôn quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. Do đó, trước khi thực hiện phản ứng PCR, chúng tôi đã định lượng DNA bằng máy đo quang phổ. Dựa vào kết quả định lượng, chúng tôi pha loãng DNA gốc trong nước cất vô trùng để nồng độ đạt khoảng 100 ng. Sau khi pha loãng, DNA được điện di lại trên gel agarose. Kết quả điện di (Hình 4.2) cho thấy, các mẫu sau khi pha loãng có nồng độ DNA tương đối ngang bằng với mẫu DNA chuẩn 100 ng. Như vậy, phương pháp đo huỳnh quang để đánh giá nồng độ DNA là đáng tin cậy. Hình 4.2. Ảnh điện di DNA tổng số của một số dòng R. solani sau khi pha loãng 1. BV-61-06; 2. BV-61-05; 3. BV-50-01; 4.BV-62-03; 5. BV-71-01 6. BV-50-02; 7. BV-71-02; 8. BV-61-04; 9. DNA chuẩn 100 ng 26 4.2.2. Khảo sát chu trình nhiệt Chúng tôi tiến hành khảo sát 4 chu trình nhiệt để tìm ra chu trình nhiệt thích hợp cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn rDNA-ITS của nấm R. solani với hai primer ITS 4 và ITS 5 (White và ctv. 1990). Bảng 4.1. Các chu trình nhiệt đƣợc khảo sát Chu trình 1 Chu trình 2 Chu trình 3 Chu trình 4 94 o C: 3 phút 94 o C: 30 giây 56 o C: 1 phút 72 o C: 1 phút 72 o C: 7 phút 94 o C: 3 phút 94 o C: 1 phút 56 o C: 45 giây 72 o C: 1 phút 72 o C: 7 phút 94 o C: 3 phút 94 o C: 30 giây 56 o C: 45 giây 72 o C: 1 phút 72 o C: 7 phút 94 o C: 3 phút 94 o C: 1 phút 56 o C: 30 giây 72 o C: 1 phút 72 o C: 7 phút Chúng tôi đã nhận được kết quả thể hiện qua Hình 4.3. Hình 4.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR với các chu trình nhiệt khác nhau (A). Chu trình 1; (B). Chu trình 2; (C). Chu trình 3; (D). Chu trình 4 Kết quả điện di trên agarose cho thấy, cả 4 chu trình, chúng tôi đều khuếch đại được vùng rDNA-ITS của nấm R. solani. Sản phẩm có kích thước khoảng 700 bp. Tuy nhiên, ở chu trình 1, phần dư rất rõ bên dưới và có một băng mờ bên trên băng chính. Ở chu trình 4, mặc dù phần dư không thể hiện nhưng băng sản phẩm mờ hơn băng sản phẩm của chu trình 2 và chu trình 3. Mặt khác, tỉ lệ thành công của phản ứng khi áp dụng chu trình 4 thấp (tỉ lệ là 2 lần thành công trên 5 lần thực hiện). Giữa chu 30 chu kỳ 30 chu kỳ 30 chu kỳ 30 chu kỳ 700bp (A) (B) (C) (D) 700bp (A) (B) (C) (D) 27 trình 2 và chu trình 3, chúng tôi quyết định chọn chu trình 2 vì chu trình 2 cho băng sản phẩm khuếch đại rõ nét hơn chu trình 3. Do đó, chúng tôi sử dụng chu trình nhiệt thứ 2 để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo. 4.2.3. Khảo sát nồng độ primer Những phần dư không mong muốn trong sản phẩm PCR (Hình 4.3) được dự đoán có thể là do primer dư. Vì theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (1999), nồng độ primer quá cao sẽ dẫn đến sự hình thành Primer – dimer và hiện tượng priming nhầm. Nên chúng tôi quyết định tiến hành khảo sát tìm nồng độ primer thích hợp cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn rDNA-ITS của nấm R. solani. Chúng tôi khảo sát 3 nồng độ primer là 2 pmol/µl, 1 pmol/µl, và 0,4 pmol/µl. Kết quả được thể hiện qua hình 4.4. (A) (B) (C) Hình 4.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR với các nồng độ primer khác nhau (A). 2 pmol/µl; (B). 1 pmol/µl; (C). 0,4 pmol/µl Kết quả cho thấy, với primer có nồng độ 2 pmol/µl, phần dư vẫn còn thể hiện rõ. Với primer có nồng độ 1 pmol/µl, và 0,4 pmol/µl, phần dư giảm hẳn xuống. Giữa hai nồng độ primer 1 pmol/µl, và 0,4 pmol/µl, chúng tôi lựa chọn nồng độ 0,4 pmol/µl để tiết kiệm primer. Như vậy, chúng tôi đã chọn được quy trình PCR để khuếch đại đoạn rDNA – ITS của nấm R. solani cho kết quả tốt nhất. Quy trình này được thể hiện qua Bảng 4.2 và Bảng 4.3. 700bp . 72 o C: 1 phút 72 o C: 7 phút 94 o C: 3 phút 94 o C: 30 giây 56 o C: 45 giây 72 o C: 1 phút 72 o C: 7 phút 94 o C: 3 phút 94 o C: 1 phút 56 o C: 30 giây 72 o C: 1 phút 72 o C: 7 phút. đƣợc khảo sát Chu trình 1 Chu trình 2 Chu trình 3 Chu trình 4 94 o C: 3 phút 94 o C: 30 giây 56 o C: 1 phút 72 o C: 1 phút 72 o C: 7 phút 94 o C: 3 phút 94 o C: 1 phút 56 o C: 45. pháp của Nguyễn Thị Huệ (20 03) đã sử dụng. DNA tổng số Phần tạp 25 Hồ Viết Thế (2005), khi sử dụng phương pháp ly trích DNA của Lee và Taylor cũng thu được DNA tổng số của nấm R. solani.