i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii iii LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo điều kiện cho em thực hiện khóa luận này. Em xin cảm ơn thầy Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ bảo và hỗ trợ cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Con cảm ơn Ba, Mẹ đã luôn dành tình thƣơng cho con; dạy dỗ, động viên con; là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con trong suốt thời gian qua. Em xin cảm ơn các Anh, Chị ở Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh đã hết lòng giúp đỡ, đóng góp nhiều kinh nghiệm quý báu cho em hoàn thành tốt khóa luận. Em chân thành cảm ơn anh Cƣờng- Viện Cây Ăn Quả miền Nam, anh Dũng- Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Tiền Giang, anh Vinh- Trạm BVTV Tân Phú- Định Quán đã cung cấp tài liệu và tạo điều kiện thuận lợi cho em thu thập mẫu thí nghiệm. Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình dạy bảo, dìu dắt em trong suốt quãng đƣờng sinh viên. Cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 đã luôn bên cạnh mình, đóng góp, động viên mình trong học tập cũng nhƣ trong cuộc sống. TP. HCM, Tháng 9 năm 2005 Nguyễn Thị Thùy Dƣơng iv TÓM TẮT NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG, Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2005. “SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÒNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP”. Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Bùi Cách Tuyến Đề tài đƣợc tiến hành tại hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh- Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. Nội dung thực hiện: - Tiến hành lấy mẫu bệnh đốm vòng trên cây đu đủ tại hai tỉnh điều tra. - Sử dụng kĩ thuật DAS ELISA để chẩn đoán và đánh giá mức độ nhiễm bệnh đốm vòng ở hai tỉnh này. - Thiết lập quy trình RT-PCR để phát hiện PRSV với đối tƣợng thí nghiệm là các mẫu dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp ELISA. Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp DAS ELISA - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng ở các địa điểm - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo từng giống cây - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo tuổi cây 4 - 5 tháng (chƣa trái) 70,00 % 6 - 8 tháng 85,71 % 8 - 11 tháng 12,50 % Trên 1năm 36,11 % Xã Mỹ Hiệp 92,68 % Xã Bình Thạnh 77,42 % Xã Phú Tân 47,37 % Xã Phú Lộc 47,37 % Xã Phú An 16,00 % Da bông (Db) 86,54 % Mã Lai (Ml) 80,00 % Địa phƣơng (Đp) 34,92 % v Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp RT-PCR - Cặp mồi 1 không đặc hiệu cho trình tự gen coat protein của PRSV-P song vẫn khuếch đại đƣợc sản phẩm mong muốn. - Cặp mồi P4-M30 và P14-M31 đặc hiệu cho trình tự coat protein của PRSV-P. Kết quả giải trình tự một số mẫu - Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P14-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 619 bp. - Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P7-M31): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 410 bp. - Mẫu Định Quán (giải trình tự với mồi P7-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 412 bp. So sánh các trình tự vừa giả đƣợc với trình tự coat protein và genome của PRSV-P trên Genebank, thấy có sự tƣơng đồng khá cao. Chứng tỏ, sản phẩm thu từ mồi P14- M31 và P7-M30 đúng là đợc khuếch đậi từ gen coat protein của PRSV-P. Nhƣ vậy, đã xây dựng đƣợc quy trình chẩn đoán PRSV trên cây đu đủ bằng phƣơng pháp RT-PCR với các cặp mồi P14-M31 hay P7-M30. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT iv MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC BẢNG xi DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ xii PHẦN I 1 GIỚI THIỆU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 2 1.3. Yêu cầu 2 1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2 PHẦN II 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .) 3 2.1.1. Phân loại học 3 2.1.2. Nguồn gốc, phân bố 4 2.1.3. Đặc điểm thực vật học 4 2.1.4. Nhu cầu sinh thái 5 2.1.5. Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dƣỡng của đu đủ 6 2.1.5.1. Giá trị dinh dƣỡng 6 2.1.5.2. Ứng dụng thực tiễn 7 2.1.6. Tình hình sản xuất 8 2.1.7. Sâu bệnh 9 2.1.7.1. Các loài côn trùng gây hại chính 10 2.1.7.2. Các bệnh phổ biến trên đu đủ 10 2.2. Sơ lƣợc về Papaya ringspot virus và tác hại của nó trên đu đủ 11 vii 2.2.1. Khái niệm chung về bệnh virus hại thực vật 11 2.2.2. Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV) 15 2.2.3. Những phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus PRSV 20 2.2.3.1. Phƣơng pháp quan sát triệu chứng 20 2.2.3.2. Phƣơng pháp cây chỉ thị 20 2.2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng hiển vi điện tử 21 2.2.3.4. Phƣơng pháp huyết thanh học 21 2.2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử 22 2.2.3.6. Các phƣơng pháp khác 22 2.2.4. Sơ lƣợc về phƣơng pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay . 22 2.2.5. Sơ lƣợc về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) 24 PHẦN III 27 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27 3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu 27 3.3. Phƣơng pháp giám định bệnh đốm vòng trên đu đủ (Papaya Ringspot Desease) 28 3.3.1. Dụng cụ và thiết bị 28 3.3.2. Hóa chất 29 3.3.3. Quy trình thực hiện 31 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA 31 3.3.3.2. Phƣơng pháp RT-PCR 35 PHẦN IV 39 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1. Hiện trạng canh tác cây đu đủ ở nơi lấy mẫu 39 4.2. Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm với bộ kit DAS- ELISA 40 4.2.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra 40 4.2.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây 42 4.2.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây 43 4.3. Kết quả thí nghiệm PCR 44 4.4. Kết quả giải trình tự một số mẫu 53 viii PHẦN V 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 5.1. Kết luận 56 5.2. Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 61 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid CP gene: Coating protein gene DAS ELISA: Direct double antibody sandwich DMSO: Dimethylsulforxide DNA: Deoxyribonucleic acid DNase: Deoxyribonuclease dNTP: Deoxynucleotide triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid EIA: Enzyme immunoassay ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay EtBt: Ethidium bromide FDA: Food and Drug Administration MMLV: Moloney murine leukemia virus mRNA: Messenger RNA OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction p-NPP: p- nitrophenyl phosphate PRSV: Papaya ringspot virus PSP-T: Phosphate buffer saline with TWEEN-20 RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease RT-PCR: Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction T a : Annealing temperature T m : Melting temperature UV: Ultra violet x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cây đu đủ 3 Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus 12 Hình 2.3 Các dạng thể vùi của virus tồn tại trong mô cây 16 Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên lá 17 Hình 2.5 Đối chiếu giữa lá bệnh (bên trái) và lá khỏe (bên phải) 18 Hình 2.6 Triệu chứng trên cuống lá và quả 18 Hình 2.7 Myzus persicae (trái) và Aphis gossypii (phải) 19 Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA 24 Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn 44 b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2 44 Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1 45 Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1 46 Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1 47 Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên 50 Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31 51 Hình 4.7 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 52 . năm 2005. “SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÒNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP”. Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS. GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên kho : 20 01 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG. Nội dung thực hiện: - Tiến hành lấy mẫu bệnh đốm vòng trên cây đu đủ tại hai tỉnh điều tra. - Sử dụng kĩ thuật DAS ELISA để chẩn đoán và đánh giá mức độ nhiễm bệnh đốm vòng ở hai tỉnh này. -