10  Sức đề kháng acid của STEC: Nét đặc trưng của các dòng STEC là khả năng định cư ở ống tiêu hóa người, với số lượng cảm nhiễm thấp. STEC đề kháng được pH acid của dạ dày. Do đó, dòng STEC O157:H7 vẫn còn sống sót trong các thực phẩm acid cao (Leyer và ctv, 1995). Tính trạng này được điều hòa bởi gen rpoS. Gen này có khả năng giúp vi khuẩn E. coli kéo dài thời gian sống sót ở pH dưới 2,5 (Paton và Paton, 1998). Gần đây, Waterman và Small (1996) báo cáo tình trạng đột biến của gen này. Điều này góp phần giải thích những dòng STEC có khả năng gây cảm nhiễm khác nhau.  Kiểu bám vào tế bào biểu mô ruột: STEC có khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt của dạ dày. Chúng phải thiết lập sự định cư này bằng cách bám vào các tế bào biểu mô ruột. STEC định cư được ở đoạn kết tràng (colon) và có lẽ cũng ở đoạn xa ruột non người; mặc dù hiện tượng này chưa được chứng minh trực tiếp. Ngay cả những dòng trong serotype O157:H7 vẫn có sự bám dính khác nhau, điều này phản ánh nhiều cơ chế bám khác nhau.  Vai trò của plasmid 60 MDa (pO157) cho STEC bám dính: Hầu hết các dòng STEC đều chứa pO157 này. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện diện của plasmid liên quan đến yếu tố bám (fimbriae) và sự bám dính với tế bào Henle 407 nhưng không bám vào tế bào HEp-2. Theo Tzipori và ctv (1987), có hiện diện plasmid hay không có đều không ảnh hưởng đến khả năng định cư ở kết tràng của STEC và khả năng gây bệnh tích A/E trên heo con sinh ra bằng cách mổ lấy thai. 2.2.4. Khía cạnh lâm sàng Ngày nay, người ta công nhận rằng có sự phân bố rất rộng về bệnh ở người liên quan đến các vi khuẩn sản sinh độc tố Stx. Những bệnh liên quan tới STEC thường gắn liền với những ổ dịch nhỏ rải rác lẫn những ổ dịch lớn có nguồn gốc ngộ độc thực phẩm. Nhiều bệnh nhân nhiễm STEC với triệu chứng đầu tiên là tiêu chảy, một số trường hợp thì sau một hay hai ngày thì tiêu chảy lẫn máu và HC. Đau bụng dữ dội cũng thường xảy ra. Đối với những bệnh nhân nhiễm STEC gây tình trạng HUS thì dễ để lại di chứng do sự tổn thương cấp tính ở thận, sự thiếu máu do dung huyết và giảm tiểu cầu. Vài cá thể bị HUS thì có triệu chứng thần kinh như bơ phờ, nhức đầu dữ dội, co giật và đau não. Mặc dù HUS xảy ra trên tất cả các nhóm tuổi nhưng tỉ lệ mắc bệnh 11 do STEC ở trẻ em và người già thường cao hơn, điều này có thể do sự đáp ứng miễn dịch kém ở hai lứa tuổi này. Sự cải thiện trong kiểm soát lâm sàng và kỹ thuật thẩm tách thận đã làm giảm tỉ lệ chết do HUS từ 50% xuống hơn 10% trong hai – ba thập niên vừa qua. Tuy nhiên, số lượng người sống sót (khoảng 30%) phải chịu đựng ốm yếu triền miên, bao gồm suy thận mãn tính, tăng huyết áp và suy yếu hệ thần kinh. Tiến trình bệnh do STEC gây ra có hay không có biến chứng tùy thuộc vào sự tác động qua lại giữa vi khuẩn và vật chủ. Trong một ổ dịch, tuổi của người bệnh ảnh hưởng đến tỉ lệ mắc cũng như tỉ lệ chết. Những nghiên cứu gần đây về các ổ dịch lớn gây ra bởi STEC thuộc serotype O157:H7 cho thấy khoảng 5 – 10% bệnh nhân tiêu chảy tiến triển để hình thành HUS do STEC (Paton và Paton, 1998). 2.2.5. Dịch tễ học Trong nhiều năm qua, người ta thừa nhận rằng những dòng STEC gây bệnh trên người thuộc các tuýp huyết thanh O:H phổ rộng. Karmali (1989) đã liệt kê 32 serogroup O (tương đương với 60 tuýp O:H khác nhau). Trên khắp thế giới, các dòng STEC thuộc serotype O157:H- là nguyên nhân chính gây bệnh cho người. Việc phân lập các serotype này thường dựa vào khả năng không lên men sorbitol nên đã góp phần đánh giá quá cao tỉ lệ mắc phải nhóm này so với các serotype khác. Khi một tuýp được phân lập là O157, có lẽ có khuynh hướng bỏ qua tầm quan trọng tiềm năng gây bệnh của các tuýp khác. Trong khi đó, các serotype STEC không thuộc O157:H7 cũng là nguyên nhân nổi bật gây bệnh cho người. Nguồn lây nhiễm: Nhiều cuộc điều tra dịch tễ đã chứng minh rằng các dòng STEC hiện diện trong đường ruột của nhiều loài vật nuôi như bò, cừu, heo, dê, chó, mèo (Beutin và ctv, 1995) và cả ngựa (Chalmer và ctv, 1997). Do đó, STEC tồn lưu trong gia súc chính là nguồn quan trọng gây bệnh cho người, và nguồn quan trọng nhất là từ trâu bò. STEC lây truyền qua người chủ yếu bằng con đường thực phẩm, nước và từ người qua người. Cụ thể, STEC có thể xâm nhập vào chuỗi sản xuất thực phẩm cho con người từ nguồn gốc vật nuôi, vấy nhiễm thông thường nhất cho thịt là phân hoặc các thành phần trong ruột sau khi hạ thịt (Paton và Paton, 1998). 12 Truyền lây STEC giữa người và người xảy ra trong các đợt bộc phát bệnh. Thời gian bài thải O157 qua phân là 2 – 4 tuần, nhưng khoảng 13% bệnh nhân thải O157 hơn một tháng và triệu chứng bệnh không biểu hiện trong giai đoạn sau. Như vậy nguy cơ truyền lây giữa người – người là cao (Keene và ctv, 1994). 2.2.6. Chẩn đoán Có những khó khăn liên quan đến chẩn đoán cảm nhiễm do STEC. Trong giai đoạn đầu, STEC tồn tại nhiều trong phân; có nhiều trường hợp, STEC chiếm trên 90% quần thể vi sinh vật hiếu khí (Paton và ctv, 1996). Tuy nhiên, lúc bệnh thuyên giảm, số lượng này giảm nhanh cực kỳ. Đối với những bệnh nhân HUS, triệu chứng dạ dày ruột có thể chỉ xuất hiện một tuần hoặc nhiều tuần, và ở thời điểm này số lượng STEC hiện diện trong phân rất ít. Trong vài trường hợp, tiêu chảy không kéo dài và nếu lấy bệnh phẩm qua trực tràng thì số lượng sẽ hạn chế. Vì những lí do này, yêu cầu của phương pháp chẩn đoán thích hợp phải nhạy, nhanh và đòi hỏi khối lượng mẫu tối thiểu. Các qui trình chẩn đoán thường tập trung vào việc phát hiện Stx, đặc biệt là Stx trong phân. Do các qui trình khác nhau về tính phức tạp, thời gian, độ nhạy, tính chuyên biệt và giá thành, vì vậy phải có chiến lược chẩn đoán thích hợp tùy hoàn cảnh và nguồn mẫu (Paton và Paton, 1998). 2.2.7. Phòng ngừa E. coli gây bệnh theo phân ra ngoài và phát tán trong đất, nước, không khí. Ngoài ra, bệnh có thể lây truyền từ người sang người do tay bẩn, thực phẩm và nước uống bị nhiễm. Do đó, bệnh có thể gây thành dịch, đặc biệt ở nhà trẻ, khoa nhi của bệnh viện và người già. Vì vậy, phòng bệnh chủ yếu là tuân thủ nghiêm ngặt qui chế vệ sinh, chú ý xử lý phân và dụng cụ của bệnh nhân. Không nên ăn những loại thực phẩm không đảm bảo chất lượng, đặc biệt là sản phẩm từ thịt chưa nấu chín vì chúng có thể là nguồn truyền nhiễm STEC. Có thể xác định chỉ số E. coli trong nước để xem nước có nhiễm bẩn hay không. 2.3. Serotype O157:H7 Theo thống kê về tình hình các ổ dịch bệnh do nhiễm phải STEC thì hầu hết các trường hợp đều do serotype O157:H7 gây ra (Nataro và Kaper, 1998). Điều này cho 13 thấy serotype này nguy hiểm hơn, dễ lây lan bệnh hơn so với các serotype khác. Lần đầu tiên, serotype O157:H7 được phân lập và định danh vào năm 1982. E. coli O157:H7 ngày càng có tác động lớn ở Mỹ và châu Âu. Hàng năm, ở Mỹ có trên 73000 ca ngộ độc thực phẩm do nhiễm phải O157:H7, trong đó có 61 trường hợp tử vong. Nguyên nhân do ăn phải thịt bò chưa nấu chín hay đã bị vấy nhiễm, do uống sữa tươi hay do truyền lây giữa người và người sau khi đi bơi trong các hồ đã bị nhiễm (USA Department of Agriculture’s Food safety and Inspection Service, 2004). Từ đó, người ta xem O157:H7 là nguyên nhân phổ biến nhất cho HC và HUS. Serotype này có một số đặc điểm khác biệt so với các serotype E. coli khác: - Nhạy cảm với nhiệt độ, không phát triển được ở nhiệt độ 44 – 44,5 0 C (Jay, 2000). - Không có khả năng lên men D-sorbitol trong 24 giờ. Trong khi đó có đến 75 – 94% những dòng E. coli khác lại lên men sorbitol. Do đó, người ta thay thế môi trường MacConkey có lactose bằng SMAC chọn lọc chứa 1% sorbitol để phân lập (Smith và Scotland, 1993). - Không biểu hiện hoạt tính -D-glucuronidase (GUD): Điểm khác biệt về sinh hóa của dòng O157:H7 là không cho GUD dương tính, trong khi đó khoảng 90 – 95% chủng E. coli cho GUD dương tính. Và người ta dựa vào đặc tính này để phân biệt O157:H7 với các dòng E. coli khác (Monday và ctv, 2001). GUD là enzyme xúc tác sự thủy phân -D-glucuronide thành rượu và glucuronate. Mặc dù không biểu hiện GUD nhưng các serotype O157:H7 vẫn mang đoạn gen uid hoàn chỉnh (gồm cả vùng điều hòa) trên nhiễm sắc thể. Kiểu hình đặc trưng này là do đã xảy ra các đột biến trên gen uid. Hầu hết các đột biến trên uid ở O157:H7 là đột biến thoái hóa, ví dụ như đột biến điểm thay thế T bằng G ở vị trí 92 so với E. coli thuộc chủng hoang dại (wild-type) (Feng và Lampel, 1994) hay đột biến do sự chèn thêm hai base G-G ở vị trí +686 trên uid ở serotype O157:H7 (Monday và ctv, 2001). Tóm lại, những đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của GUD, O157:H7 vẫn sản sinh GUD nhưng GUD bị bất hoạt, không thực hiện chức năng thủy phân của nó được. Và điều này vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn. 14 - Kháng kháng sinh: cefixime, sulfivoxazol, tetracycline, streptomycine và các tác nhân ức chế khác như potassium tellurite (ức chế các VSV thông thường) (Kim và ctv, 1994). - Tính kháng acid (acid resistance - AR) đóng vai trò quan trọng cho khả năng sống sót của vi khuẩn trong môi trường acid. E. coli O157:H7 có khả năng sống sót trong môi trường acid từ pH = 2 đến pH = 7. Chẳng hạn, O157:H7 sống đến 56 ngày ở pH >= 4 trong môi trường TBS (Tryptic Soybean Broth), ngoài ra nó không phát triển ít nhất 5 giờ ở pH 3 -2,5 khi nhiệt độ 37 o C trong môi trường canh Luria có điều chỉnh pH bằng HCl (trích dẫn bởi Jay, 2000). Đặc tính kháng acid này do gen rpoS qui định. Có 3 hệ thống AR khác nhau (Foster, 2004): (1) Hệ thống AR1: chỉ hoạt động khi tế bào tăng trưởng trong môi trường yếm khí với sự vắng mặt của glucose. (2) Hệ thống AR2: hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của glutamate. (3) Hệ thống AR3: hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của arginine. Ba hệ thống này hoạt động suốt quá trình tăng trưởng ở pha cân bằng (stationery phase) của vi khuẩn. - Khả năng chịu mặn: Trong canh khuẩn 4,5% NaCl, vi khuẩn tăng số lượng gấp 3 lần khi tăng thời gian lên 2 lần, và không phát triển khi 8,5% NaCl (Jay, 2000). 2.4. Kỹ thuật PCR 2.4.1. Khái niệm Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 đã và đang được sử dụng rộng rãi. Đây là một phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào. 2.4.2. Nguyên tắc Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA, là phản ứng gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3 bước: 15  Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ thường sử dụng là 94 – 95 0 C  Bước 2: là giai đoạn lai (hybridization), nhiệt độ dao động trong khoảng 40 0 C – 70 0 C.  Bước 3: là giai đoạn kéo dài (elongation hay extension), thường ở nhiệt độ 72 0 C. Một chu kì gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và sau mỗi lần lặp lại sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA của lần trước. Số chu kì thường theo kinh nghiệm và có thể trong khoảng 25 – 30 chu kì, tùy theo lượng của mẫu DNA lúc bắt đầu và độ nhạy mong muốn. 2.4.3. Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR - Dung dịch đệm: thành phần của dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg 2+ . Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ MgCl 2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5 mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). - Các dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. - Mồi (primer): là những oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Các chuỗi primer nên được thiết kế để nhân một đoạn DNA sao cho đạt chiều dài tối hảo là 100 – 1000 bp mặc dù trong vài trường hợp sản phẩm chỉ 10 bp. - Taq polymerase: là DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg 2+ . Hoạt lực của Taq bị ảnh hưởng rất lớn bởi nồng độ Mg 2+ . Nồng độ tối hảo Mg thường là 1,5 mM (Trần Thị Dân, 2001). - DNA mẫu xét nghiệm. 16 2.4.4. Phân tích kết quả PCR Sau khi thực hiện phản ứng PCR, tùy vào mục đích mà người ta sử dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau để phân tích sản phẩm của phản ứng PCR như đọc trình tự sản phẩm PCR, tạo dòng sản phẩm PCR … Tuy nhiên, công việc đầu tiên sau khi thực hiện phản ứng PCR là phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di. Sau khi điện di, các DNA trong gel sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen vào các base của các nucleotide và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV. Và để ước lượng kích thước DNA trên gel, người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử “ (molecular weight marker - MWN) hay còn gọi DNA ladder (thang chuẩn). 2.4.5. Multiplex – PCR Là phản ứng PCR sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng PCR. Phương pháp này được thử nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng vào nhiều công trình nghiên cứu. Cho đến nay, vẫn chưa có nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tối ưu hóa phản ứng multiplex – PCR. Do vậy, ứng với mỗi một điều kiện phản ứng, cần phải điều chỉnh cho phù hợp với mục đích mong muốn. 2.4.6. Ứng dụng Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, khảo cổ, pháp y và hình sự. Trong nghiên cứu genome, PCR được ứng dụng trong nhân bản vô tính, multiplex PCR, cloning cDNA bằng PCR đảo (inverse PCR), recombinant PCR, Trong y khoa và thú y, PCR được sử dụng để chẩn đoán các mầm bệnh virus, vi khuẩn, protozoa lẫn ký sinh trùng đa bào. Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, sử dụng PCR để phát hiện gen halothan, gen thụ thể estrogen, gen thụ thể prolactin … trong công tác chọn giống vật 17 nuôi, phát hiện các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm : E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Campylobacter, 18 Phần 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian Đề tài được thực hiện từ ngày 1/03/2005 đến ngày 30/07/2005. 3.1.2. Địa điểm - Mẫu phân được lấy từ các hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai, TP. HCM và Tiền Giang. - Mẫu bề mặt thịt bò được lấy ở lò mổ Dĩ An-Bình Dương. - Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại Phòng thực hành Kiểm nghiệm thú sản và Môi trường sức khỏe vật nuôi, Khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. - Xác định các gen độc lực của E. coli được thực hiện tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2. Nội dung thực hiện - Phân lập vi khuẩn E. coli trong phân bò, heo và bề mặt thịt bò. - Li trích DNA của E. coli phân lập được. - Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện các gen eae, ehxA, stx1, stx2 và uid của E. coli. 3.3. Phương pháp thực hiện 3.3.1. Vật liệu thí nghiệm cơ bản Dụng cụ lấy mẫu: tăm bông, đèn cồn, chai cồn, môi trường chuyên chở Carry Blair, Mẫu vi khuẩn đối chứng dương: EDL933. . bò. - Li trích DNA của E. coli phân lập được. - Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện các gen eae, ehxA, stx1, stx2 và uid của E. coli. 3.3. Phương pháp thực hiện 3.3.1. Vật liệu. dụng PCR để phát hiện gen halothan, gen thụ thể estrogen, gen thụ thể prolactin … trong công tác chọn giống vật 17 nuôi, phát hiện các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm : E. coli, Salmonella, Staphylococcus. nhờ ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen vào các base của các nucleotide và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV. Và để ước lượng kích thước DNA trên gel, người ta sử dụng một